豬偽狂犬病病毒HeN1株全基因組測序及感染和毒力相關基因的變異特征分析

葉 超，趙 款，郭金潮，姜成剛，常曉博，王淑杰，王同云，彭金美，蔡雪輝，田志軍，安同慶

(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150001)

豬偽狂犬病(PR)是由PR 病毒(PRV)引起的一種烈性傳染病，該病在世界范圍內廣泛分布，隨Bartha-K61 等疫苗以及鑒別診斷方法的應用，在歐美一些國家PRV 已經(jīng)得到凈化。然而從2011 年底開始，我國多個省份免疫過Bartha-K61 疫苗的豬場發(fā)生PRV，造成了嚴重的經(jīng)濟損失[1]。

研究表明，PRV 感染相關基因gC 通過與硫酸乙酰肝素結合介導病毒入侵[2]；gB、gD、gH 介導膜融合促進病毒衣殼和內間質進入細胞質[3]。gE 和gI通過將新生病毒粒子分配到細胞連接，促進病毒在細胞間的擴散。gE、gI 和TK 基因的缺失可以使PRV 的毒力和感染力顯著降低[4-5]。核苷酸還原酶(RR)由RR1 和RR2 兩個亞基組成，缺失RR 會降低病毒的生長速度[6]。PK 為PRV 增殖的非必需基因，但缺失PK 基因后也導致PRV 毒力下降[7]。微衛(wèi)星序列(SSR)在皰疹病毒基因組中廣泛存在，并與病毒的遺傳變異具有緊密聯(lián)系。SSR 是由幾個1 bp～6 bp 的核苷酸序列作為重復單元，串聯(lián)重復形成的一類DNA 序列。以往對于歐美PRV 株的研究表明，不同PRV 株間的SSR 變異較大[8]。為研究2011 年以來我國PRV 流行株的變異情況，本研究對本實驗室分離的流行株HeN1 株進行了全基因組測序，并對其感染或毒力相關基因進行序列分析，為PR 的有效防制提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株及細胞 于2011 年分離自Bartha-K61疫苗免疫過的豬場出現(xiàn)神經(jīng)癥狀死亡仔豬的PRV HeN1 株及Vero-E6 細胞由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 LA Taq DNA 聚合酶、DL2000 DNA Marker 及pMD18-T 載體均購自TaKaRa 公司。

1.3 病毒培養(yǎng)與核酸提取 將HeN1 株接種于Vero-E6 細胞，待病變率達到80%時收獲病毒液。按照常規(guī)方法提取PRV 基因組DNA。

1.4 引物設計合成、病毒基因組分段克隆及測序參照GenBank 中登錄的Kaplan 全基因序列(KJ717942)設計96 對特異性引物(如讀者需要，作者可以提供相關的引物序列信息)，以HeN1 株基因組DNA 為模板進行PCR 擴增，相鄰引物擴增區(qū)域保證至少重疊100 bp，引物由博仕生物科技有限公司合成。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳后回收純化，克隆于pMD18-T 載體中，構建重組質粒，由北京華大基因研究中心進行測序。

1.5 PRV感染和毒力相關基因的比對分析 將HeN1 株的測序結果進行拼接，獲得全基因組序列，并與GenBank 中登錄的PRV 相關基因序列進行同源性比對。

1.6 PRV序列的進化樹分析 參照文獻[9]方法，選取PRV 各病毒株gC 基因部分序列，采用MEGA5.1 軟件根據(jù)neighbor-joining 方法繪制無根系統(tǒng)發(fā)生樹，比對值為1 000 次重復。

2 結果

2.1 PRV HeN1株與參考病毒株的核苷酸同源性分析 PRV HeN1 株(KP098534)全長141 803 bp，GC含量為73.7 %，UL 區(qū)占70.2 %，US 區(qū)占9.6 %，內部重復區(qū)和末端重復區(qū)均占11.3 %。HeN1 株與國外參考病毒株(Kaplan、Bartha 和Becker)全基因組序列同源性為89.9 %～93.3 %，與中國病毒株TJ(KJ789182)同源性為96.9 %。各基因同源性分析結果顯示新流行株之間(HeN1、TJ 和BJ/YT)同源性最高，與中國早期的Fa 株和Ea 株同源性較高，與國外代表病毒株同源性最低(表1)。

表1 HeN1 株與國內外參考病毒株的基因核苷酸同源性比較Table 1 The identity of different genes between HeN1 and reference isolates

2.2 PRV感染和毒力相關蛋白的變異特征 國內分離株和國外分離株間存在一些特有的突變氨基酸，這些突變在國內外分離株間是高度保守且大量存在的。除TK、RR2 外，其他8 個蛋白均存在插入或缺失(圖1)。其中RR1、gB、gC、gE、gI 的插入/缺失是國內分離株與國外分離株間特有的差異，以國內分離株在gC 蛋白連續(xù)插入7 個氨基酸(63AAASTPA69)最為顯著。RR2、TK、PK、gH 在國內外分離株之間的同源性較高，而表現(xiàn)為較少的特有氨基酸突變。這表明各相關蛋白在分離株間的保守性存在差異。另外分析顯示在RR1 序列中，歐美分離株在GCC 重復單元中插入了9 個堿基形成3 個絲氨酸的插入。在PK 和gH 的序列中，由于SSR重復單元(GGCGAC 和GAG)的增加，病毒株Becker分別比其他分離株多編碼了2 個氨基酸。在gD 序列中，歐洲病毒株Kaplan 和Bartha 由于SSR 重復單元的減少而缺少了2 個氨基酸。在gE 序列中存在的兩處天冬氨酸插入現(xiàn)象也是由于SSR 重復單元(GAC)數(shù)量的變異引起的(圖1)。表明大部分插入/缺失的產(chǎn)生與SSR 的變異相關。至于這些缺失/插入及突變對各毒力蛋白結構和功能的影響，還有待進一步研究。

圖1 PRV 感染和毒力相關蛋白的缺失/插入?yún)^(qū)域比對結果Fig.1 Comparative alignment analysis of PRV proteins

2.3 基于gC基因的PRV遺傳進化分析 選取PRV 各病毒株gC 基因部分序列，進行進化樹分析表明，國內外分離株進化具有顯著差異，處于兩個獨立的遺傳分支。中國新分離株在相對集中的小分支上，親緣關系緊密。與早期的PRV Fa 株(1964 年分離)在不同的遺傳分支上，但與以往病毒株Ea(1999 年分離)在一個大的分支中(圖2)。表明新分離株可能是中國早期的分離株逐漸演變而來。

3 討論

余秋穎等對河南省2012 年～2013 年的PRV 流行株gE、TK 和gD 基因進行過比對分析[10]，但目前對PRV 新流行株的分子特征還知之甚少。本研究進一步對新流行株HeN1 株的感染和毒力相關基因進行了序列分析，并與GenBank 中登錄的國內外分離株進行比較分析，以研究PRV 新流行株相關基因的變異情況。結果表明，以HeN1 為代表的2011 年以來的流行株具有相似的突變和缺失/插入特征。與國內早期分離株相比，它們之間具有較高的同源性和很近的遺傳關系，屬于同一個大的遺傳分支。國內外分離株間卻存在顯著遺傳差異，在進化關系上處在兩個獨立的遺傳分支。歐美等國外分離株與中國的分離株在各感染和毒力相關蛋白氨基酸編碼上存在較多特征氨基酸的突變和特異性缺失/插入。最為顯著的是中國分離株相對于國外分離株在gC蛋白第63～69 位連續(xù)插入7 個氨基酸(AAASTPA)，該插入突變可以進一步作為鑒定國內外PRV 的分子特征。另外本研究首次發(fā)現(xiàn)有些缺失/插入與SSR的變異直接相關，而且是由于SSR 重復單元數(shù)量的變化造成的。至于這些缺失/插入及突變對各毒力蛋白結構和功能的影響，還有待進一步研究。

圖2 基于gC 基因的PRV 進化樹分析Fig.2 Evolutionary analysis of PRV based on gC sequences

以上研究表明，2011 年以來不同地區(qū)分離的PRV 流行株的感染和毒力相關基因具有相似的缺失/插入分子特征，在進化樹上處于單獨的小分支。我國早期PRV 與2011 年以來流行株之間，各感染和毒力相關基因的同源性較高，二者有很近的親緣關系。而國外病毒株與國內病毒株間各相關基因有較大突變和缺失/插入，二者進化關系很遠。

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