細(xì)菌規(guī)律成簇間隔短回文序列相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展

王立燕，劉永生

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部草食動(dòng)物疫病重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046)

近年來(lái)，在許多細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)一種新的基因干擾途徑—規(guī)律成簇間隔短回文序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)，該序列是許多細(xì)菌和古細(xì)菌用來(lái)保護(hù)自己免受噬菌體、接合質(zhì)粒和其他轉(zhuǎn)座因子(Mobile genetic elements，MGEs)干擾的一段DNA 序列[1-2]，其轉(zhuǎn)錄的RNA 序列與相關(guān)蛋白結(jié)合在一起可使入侵的特異性核酸發(fā)生降解。目前CRISPR 已被開(kāi)發(fā)為一種基因編輯工具，能夠?qū)蚪M進(jìn)行特異性的定點(diǎn)改造。它與鋅指核酸內(nèi)切酶(Zine finger endonuclease，ZFN)以及類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)相比[3]，具有制作簡(jiǎn)單、成本低、作用率高的特點(diǎn)。

1987 年，Ishino 等在對(duì)大腸桿菌中編碼堿性磷酸酶同工酶轉(zhuǎn)化的iap 基因進(jìn)行克隆和測(cè)序時(shí)，發(fā)現(xiàn)在其下游存在一組29 個(gè)核苷酸的非重復(fù)序列，它由一系列不相關(guān)、非重復(fù)、相似的短序列隔開(kāi)，這是第一次對(duì)CRISPR 進(jìn)行報(bào)道[1]。

2002 年，Jansen 等將其稱為CRISPR 以反映這類(lèi)基因座的特殊結(jié)構(gòu)。這類(lèi)特殊結(jié)構(gòu)為：一般在重復(fù)基因簇之前有一段富含A、T 的前導(dǎo)序列，與CRISPR 相關(guān)的一組保守的蛋白編碼基因Cas(CRISPR-associated)通常位于CRISPR的一側(cè)，通過(guò)對(duì)數(shù)個(gè)CRISPR 的間隔序列(Spacer)的分析發(fā)現(xiàn)它們均來(lái)自外源的轉(zhuǎn)座因子，如噬菌體、質(zhì)粒。早期的研究還指出了與特定噬菌體相匹配的間隔序列與噬菌體敏感性之間的關(guān)系，這暗示CRISPR 具有免疫功能[1]。

2007 年，Barrangou 等的開(kāi)創(chuàng)性的研究表明，CRISPR通過(guò)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的途徑來(lái)保護(hù)嗜熱鏈球菌免受噬菌體的感染。間隔序列與其在噬菌體中所匹配序列的一致性是CRISPR 發(fā)揮免疫作用所必需的，Cas 對(duì)于CRISPR 免疫作用的發(fā)揮也是必要的，這個(gè)實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了這些結(jié)論[1,4]。

目前對(duì)于CRISPR 還在進(jìn)一步的研究中，人類(lèi)對(duì)其為許多細(xì)菌和古細(xì)菌提供適應(yīng)性免疫的功能的認(rèn)識(shí)與了解也越來(lái)越透徹。

1 CRISPR的結(jié)構(gòu)

CRISPR由位于5' 端的前導(dǎo)序列、短重復(fù)序列和位于兩個(gè)重復(fù)序列之間的大小與其類(lèi)似的間隔序列組成，并且大多數(shù)的間隔序列與外源噬菌體或質(zhì)粒的遺傳因子具有序列相似性。一般重復(fù)序列的長(zhǎng)度在23～50 bp，平均長(zhǎng)度為31 bp。間隔序列的長(zhǎng)度在17～84 bp，平均長(zhǎng)度為36 bp[1]。在一個(gè)CRISPR 序列中可含有重復(fù)序列2～588個(gè)，平均是49 個(gè)，在特定CRISPR 基因座中重復(fù)序列的順序和長(zhǎng)度一般是保守的，但不同的CRISPR 系統(tǒng)之間相差卻是比較大的[5]；而間隔序列在同一個(gè)CRISPR 序列中是高度可變的，但其長(zhǎng)度卻基本相似，而在不同的株系中，間隔序列則存在明顯差異的[6]。編碼Cas 蛋白的基因簇通常位于CRISPR 基因座的附近，因此將他們的復(fù)合物定義為CRISPR/Cas 模塊[7]。到2013 年5 月7 日為止，已在48 %的細(xì)菌和85 %甚至更多的古細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas 系統(tǒng)[5]。

2 CRISPR/Cas的分類(lèi)

根據(jù)Cas 蛋白的類(lèi)型及順序、CRISPR 中的重復(fù)序列和RNA 的結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)可將CRISPR/Cas 模塊分成3 個(gè)主要的類(lèi)型，即Type I、TypeⅡ和Type Ⅲ。它們?cè)诩?xì)菌中具有不同的分布，Type I 系統(tǒng)均存在細(xì)菌和古細(xì)菌中，TypeⅡ系統(tǒng)只存在于細(xì)菌中，而Type Ⅲ系統(tǒng)存在于大多數(shù)的古細(xì)菌中，而在少量的細(xì)菌中存在。在每個(gè)類(lèi)型中均有自己保守的特征蛋白，如Type I 中的Cas3 蛋白、TypeⅡ中的Cas9 蛋白和Type Ⅲ中的Cas10 蛋白，只有Cas1 和Cas2 蛋白在大多數(shù)的CRISPR/Cas 系統(tǒng)中普遍存在[5]。

每一個(gè)類(lèi)型的系統(tǒng)又可分為不同的亞型，代表crRNA(CRISPR RNA)的生物起源和定位入侵核苷酸的不同機(jī)制[8]。Type I 系統(tǒng)根據(jù)cas 基因的數(shù)量和排列的不同分為A、B、C、D、E、F 6 個(gè)亞型，如在硫礦硫化葉菌(S.Solfataricus)、沃氏嗜鹽富饒菌(H.volcanii)、嗜堿芽孢桿菌(B.halodurans)和銅綠假單胞菌(P.Aeruginosa)中分別存在Type I-A、I-B、I-C 和I-F 系統(tǒng)，大腸桿菌(E.coli)和嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)中存在Type I-E 系統(tǒng)。TypeⅡ也可進(jìn)一步分為Ⅱ-A、Ⅱ-B 和Ⅱ-C 3 個(gè)亞型，釀膿鏈球菌(S.pyogenes)和S.thermophilus 中存在TypeⅡ-A 系統(tǒng)。Type Ⅲ系統(tǒng)可分為Ⅲ-A 和Ⅲ-B 兩個(gè)亞型，他們定位不同的核苷酸，表皮葡萄球菌(S.epidermidis)中存在Type Ⅲ-A 系統(tǒng)，強(qiáng)烈熾熱球菌(P.furiosus)和S.solfataricus 中存在Type Ⅲ-B系統(tǒng)[5]。一種有機(jī)體中可能存在一種甚至一種以上的系統(tǒng)，如S.thermophilus 中既存在Type I-E 系統(tǒng)又存在TypeⅡ-A 系統(tǒng)。

在Type I 系統(tǒng)中，Cas6 與其他Cas 蛋白形成CRISPR相關(guān)抗病毒防御復(fù)合物(CRISPR-associated complex for antiviral defense，Cascade)[9]，crRNA 前體(包含所有重復(fù)序列與間隔序列的CRISPR 轉(zhuǎn)錄物)被Cascade 加工成小的crRNAs，在crRNA 的指導(dǎo)下，Cascade 指導(dǎo)Cas3 核酸酶裂解入侵的DNA[7]。

在Type Ⅱ系統(tǒng)中，主要通過(guò)crRNA、Cas9 蛋白、tracrRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)和宿主的核糖核酸酶Ⅲ(RNase Ⅲ)來(lái)完成整個(gè)裂解外源DNA 的過(guò)程。tracrRNA 是一段小的反義重復(fù)RNA 序列，RNase Ⅲ的作用是剪切tracrRNA，Cas9 蛋白通過(guò)crRNA 和tracrRNA 的引導(dǎo)作用在特定的位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。由于TypeⅡ系統(tǒng)只含有一種Cas9 蛋白，相對(duì)其它兩種類(lèi)型比較簡(jiǎn)單，因此目前對(duì)它的研究比較多[7]。

Type Ⅲ系統(tǒng)與Type I 系統(tǒng)相似，利用Cas6 將precrRNA 剪切成多個(gè)小的crRNA，然而不同的是不同亞型作用于不同底物。在Type Ⅲ-A 亞型中，雖然核酸酶和蛋白質(zhì)執(zhí)行CRISPR 免疫功能的機(jī)制尚不清楚，但已知它是作用于DNA。體外試驗(yàn)證明Type Ⅲ-B 亞型中Cmr 蛋白復(fù)合物切割與crRNA 互補(bǔ)的RNA 序列[10]。

3 CRISPR/Cas9的作用機(jī)制

為闡述CRISPR/Cas9 的作用機(jī)制，這里以目前研究最多的TypeⅡ系統(tǒng)為例進(jìn)行敘述。CRISPR/Cas9 的抵御機(jī)制主要有3 步：首先是間隔序列的獲取并成為CPISPR 序列的一部分，然后是CRISPR 序列被轉(zhuǎn)錄并加工成一些短的crRNA 序列，最后由crRNA-Cas 核糖核蛋白復(fù)合物定位入侵的核苷酸并將其降解[11]。在此作用過(guò)程中，不同的蛋白參與以CRISPR 為基礎(chǔ)的免疫過(guò)程的不同階段[7]。

3.1 CRISPR間隔序列的獲取 CRISPR/Cas9 的防御作用在獲取間隔序列這一階段是最弱的。這一過(guò)程中，Cas 蛋白識(shí)別外來(lái)DNA(噬菌體和質(zhì)粒DNA)，并將這個(gè)作為間隔序列的短片段與成倍的重復(fù)序列加入到最鄰近前導(dǎo)序列的CRISPR 序列的末端，可以說(shuō)是細(xì)菌通過(guò)水平轉(zhuǎn)移獲得的一個(gè)新的特性[5,12]。Cas1 和Cas2 蛋白對(duì)于新間隔序列的獲得是必須的[13]，但具體是怎么發(fā)揮作用的目前尚不清楚，主要是通過(guò)識(shí)別質(zhì)?；蚴删w中前體間隔序列來(lái)正確定位其插入位置[14]。另外在插入CRISPR 的前體間隔序列中包含著幾個(gè)堿基的保守間隔相鄰基序(Proto-spacer adjacent motifs，PAM)，它最終會(huì)是重復(fù)序列5' 末端的堿基，它在定位入侵的核苷酸中發(fā)揮著重要的作用。從免疫學(xué)的角度來(lái)看，該過(guò)程類(lèi)似于細(xì)菌對(duì)入侵核苷酸的免疫以及對(duì)入侵者產(chǎn)生記憶[5]。

3.2 CRISPR基因座的表達(dá)與加工 在獲得間隔序列之后，CRISPR 序列將被轉(zhuǎn)錄成一條長(zhǎng)的pre-crRNA[15]，然后在tracrRNA 和宿主的RNase Ⅲ的參與下被加工成一系列小的約為42 nt 的crRNA，它由一個(gè)保守的重復(fù)序列和一個(gè)與入侵核苷酸互補(bǔ)的可變的間隔序列組成。一般情況下，CRISPR 的表達(dá)水平是很低的，但當(dāng)相應(yīng)的質(zhì)粒或噬菌體入侵細(xì)菌的時(shí)候，其表達(dá)水平便會(huì)被提高[1,16]。

3.3 CRISPR/Cas9對(duì)外源DNA的剪切 加工成熟的cr-RNA 在這一階段會(huì)和tracrRNA 一起與Cas9 蛋白組成核糖核蛋白復(fù)合物[17]，crRNA 中的間隔序列與入侵的質(zhì)?；蚴删w中的雙鏈DNA 或單鏈RNA 發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，Cas9蛋白在crRNA 和tracrRNA 的引導(dǎo)下在靶序列的特定位點(diǎn)發(fā)揮切割作用并將其降解[18]，從而防止外來(lái)遺傳因子的擴(kuò)散與傳播。從免疫學(xué)的角度來(lái)看表達(dá)和剪切過(guò)程的話，它類(lèi)似于接種疫苗的宿主抵抗入侵的核苷酸的免疫應(yīng)答過(guò)程。因此，相比其他抗噬菌體機(jī)制，CRISPR/Cas 系統(tǒng)是一個(gè)抵抗噬菌體和質(zhì)粒等的具有識(shí)別入侵者特異性、可獲得性和遺傳性的細(xì)菌免疫系統(tǒng)[5]。

4 CRISPR的應(yīng)用及展望

目前，對(duì)于CRISPR 的研究還處于初級(jí)階段，但科學(xué)家們根據(jù)CRISPR/Cas9 的特性成功地合成出sgRNA 及Cas9 蛋白[19]，它已被作為人工核酸內(nèi)切酶實(shí)現(xiàn)了對(duì)某一特定基因的敲除與沉默[17]，特別是已有研究表明CRISPR/Cas9 系統(tǒng)能夠在真核細(xì)胞中發(fā)揮作用[17]，使真核基因組中的特異性位點(diǎn)發(fā)生雙鏈斷裂，如斑馬魚(yú)的體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)該系統(tǒng)有能力操縱真核基因組的改造[20]。該系統(tǒng)現(xiàn)已被用于人類(lèi)造血干細(xì)胞、小鼠細(xì)胞等的基因組改造，如對(duì)化膿性鏈球菌中的CRISPR/Cas9 進(jìn)行改造后可以在人類(lèi)的細(xì)胞核中被活化，便可以對(duì)人類(lèi)的特異序列進(jìn)行改造。而且CRISPR/Cas9 對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒副作用[21]，并且該系統(tǒng)具有可遺傳性[5]，這為治療人類(lèi)的一些基因性疾病帶來(lái)了希望。通過(guò)抑制細(xì)菌或古細(xì)菌中CRISPR 系統(tǒng)的活性來(lái)破壞其獲得性免疫系統(tǒng)，這可能加速相關(guān)疫苗的研發(fā)。另外，許多微生物學(xué)家也在通過(guò)CRISPR 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的改造，從而達(dá)到抑制其耐藥基因的進(jìn)一步擴(kuò)散的目的。因此，CRISPR/Cas 系統(tǒng)無(wú)疑是獸醫(yī)領(lǐng)域乃至人醫(yī)領(lǐng)域的又一大福音。

盡管對(duì)CRISPR 的研究正處于迅速發(fā)展的階段，但還有許多問(wèn)題需要解決。例如，為什么許多原核細(xì)胞可以攜帶多種CRISPR/Cas 類(lèi)型以及它們是如何協(xié)調(diào)它們的活性的，對(duì)間隔序列是如何獲取的了解的也太少，對(duì)于許多亞型特異蛋白的功能與結(jié)構(gòu)及在CRISPR/Cas 作用機(jī)制中的位置仍然不知道，如何解決脫靶效應(yīng)，如何提高基因組改造的效率與特異性，如何使其在多種物種中得到應(yīng)用，如該系統(tǒng)仍未在主要的基因模型果蠅中得到適用等等。這些均需要我們對(duì)其深入的研究并透徹的掌握，它將作為新一代的人工核酸內(nèi)切酶為科研事業(yè)做出巨大的貢獻(xiàn)，造福于人類(lèi)。

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