一株血鸚鵡嗜水氣單胞菌的分離鑒定

錢曉宇，陳成勛，丁亦玙，毛海濤

(天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院/天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是一種典型的人獸共患病病原，可引起人類腹瀉和多種水產(chǎn)動(dòng)物的敗血癥。研究表明，嗜水氣單胞菌是導(dǎo)致淡水魚細(xì)菌性出血病的重要病原，對(duì)多種水產(chǎn)動(dòng)物具有較強(qiáng)的致病性，包括斑點(diǎn)叉尾鮰[1]、中華鱉[2]、黃鱔[3]、團(tuán)頭魴[4]等，危害性很大，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

血鸚鵡(Cichlasoma var.)，屬于淡水熱帶觀賞魚，色彩鮮艷且具有生長(zhǎng)迅速、抗病力強(qiáng)、對(duì)溫度適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，目前鸚鵡魚是天津地區(qū)的主要觀賞魚養(yǎng)殖品種。2014 年6 月，天津市寧河縣眾民水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)血鸚鵡暴發(fā)傳染病，本研究通過傳統(tǒng)生物學(xué)鑒定方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，對(duì)病原菌進(jìn)行了鑒定分析。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 健康血鸚鵡和患病魚來自天津市寧河縣眾民水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)。DNA 快速提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；革蘭氏陰性菌鑒定卡購自生物梅里埃中國有限公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。引物合成和基因序列測(cè)定均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定儀為法國梅里埃產(chǎn)品。

1.2 病原菌的分離和篩選 取具有典型病理癥狀的血鸚鵡，在無菌條件下取其肝、腎、脾、鰓絲及肌肉腐爛處進(jìn)行病原菌的分離，劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂，32 ℃于振蕩培養(yǎng)24 h，對(duì)分離菌進(jìn)行生長(zhǎng)情況、形態(tài)學(xué)及革蘭氏染色鑒定。

1.3 生理生化試驗(yàn) 采用VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定儀和革蘭氏陰性菌鑒定卡進(jìn)行測(cè)定。

1.4 16S rRNA基因序列分析 以提取細(xì)菌的DNA為模板，采用引物5'-AGAGTTTGATCCTGG-3'/5'-G GTTACCTTGTTACGACTT-3'，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94 ℃4 min，94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。并對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列同源性分析，使用MEGA4.0 軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 藥敏試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[5-6]方法，將新鮮培養(yǎng)的分離菌稀釋至1×105cfu/mL，將17 種藥敏紙片貼于MH 固體培養(yǎng)基上，32 ℃培養(yǎng)24 h。根據(jù)抑菌圈直徑的大小判定分離菌對(duì)藥物的敏感性。

1.6 pH對(duì)分離菌生長(zhǎng)的影響 將濃度為2.2×108cfu/mL 的菌懸液以1 %接種量接種于pH 分別為3～11 的無菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中，32 ℃200 r/min 振動(dòng)培養(yǎng)24 h后，測(cè)定在各pH 下菌懸液的OD600nm值。以無菌營(yíng)養(yǎng)肉湯作為空白對(duì)照，確定最佳增殖的pH 值。

1.7 溫度對(duì)分離菌生長(zhǎng)的影響 根據(jù)1.6 結(jié)果，將濃度為2.2×108cfu/mL 的菌懸液以1 %接種量接種于最佳pH 的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，按4 ℃遞增設(shè)定培養(yǎng)溫度，在16 ℃～40 ℃的情況下200 r/min 振動(dòng)培養(yǎng)24 h后，測(cè)定在各培養(yǎng)溫度下菌懸液的OD600nm值，確定最佳培養(yǎng)溫度。

1.8 分離菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[7]的方法，將濃度為2.2×108cfu/mL 的菌懸液以1 %接種量接種于最佳pH 的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，在最佳溫度條件下以200 r/min 振動(dòng)培養(yǎng)，設(shè)定測(cè)量時(shí)間為48 h，每2 h測(cè)一次菌懸液的OD600nm值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。

1.9 人工感染試驗(yàn) 將體長(zhǎng)8.10 cm±0.64 cm，體質(zhì)量為44.41 g±4.08 g 的健康血鸚鵡置于90 cm×70 cm×45 cm 塑料水槽中暫養(yǎng)7 d，水溫保持在25 ℃～27 ℃。每箱隨機(jī)投放錦鯉10 尾。用0.65 %生理鹽水洗脫菌落，稀釋濃度為2.2×106cfu/mL、2.2×107cfu/mL、2.2×108cfu/mL、2.2×109cfu/mL、2.2×1010cfu/mL 和2.2×1011cfu/mL 的菌懸液，腹腔注射健康錦鯉，每尾注射0.1 mL，另設(shè)對(duì)照組注射等量生理鹽水，持續(xù)觀察96 h，記錄死亡情況。采用寇氏法計(jì)算半致死劑量(LD50)：LD50=Lg-1Xk-d{∑P-0.5}。式中：Xk為最大劑量的對(duì)數(shù)；d 為相鄰兩組劑量高劑量與低劑量之比的對(duì)數(shù)(即相鄰兩組對(duì)數(shù)劑量的差值)；P 為各組死亡率，用小數(shù)表示；∑P 為各組死亡率之和[8]。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀與病理變化 自然發(fā)病魚臨床和病理變化癥狀主要表現(xiàn)為體表出血，病灶處肌肉深度腐爛，鱗片嚴(yán)重脫落，腹部腫大，鰓絲充血腫脹，腸道出現(xiàn)淡黃色積液，肝臟腫大糜爛有少量出血點(diǎn)。

2.2 病原菌的分離和篩選 從患病魚癥灶分離、純化得到1 株疑似病細(xì)菌，命名為YW01。挑選健康血鸚鵡注射菌懸液YW01 及無菌生理鹽水，96 h 內(nèi)注射YW01 的實(shí)驗(yàn)魚出現(xiàn)死亡，再次分離病原進(jìn)行重復(fù)人工感染得到同一致病菌，從而確定該病病原菌為YW01。重新分離純化的細(xì)菌經(jīng)過24 h 培養(yǎng)，菌落形態(tài)呈白色或淡黃色半透明狀，菌落小，圓形，中央凸起，表面光滑，菌落周圍整齊。經(jīng)革蘭氏染色后進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示該菌為革蘭氏陰性菌，呈桿狀。

2.3 病原菌的生理生化反應(yīng) 生理生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌對(duì)側(cè)金花盞醇、L-阿拉伯醇、D-纖維二糖、D-山梨醇、D-洛塔糖、α-葡萄糖反應(yīng)呈陰性，對(duì)D-葡萄糖、葡萄糖發(fā)酵、D-麥芽糖、D-甘露醇、D-甘露糖、蔗糖、D-海藻糖反應(yīng)呈陽性；對(duì)H2S、β-葡萄糖苷酶、酯酶、乳酸鹽產(chǎn)堿、琥珀酸鹽產(chǎn)堿、等反應(yīng)呈陽性；對(duì)β-葡萄糖苷酸酶、L-蘋果酸鹽同化、L-乳鹽酸同化、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、氨基乙酸芳胺酶、磷酸酶、丙二酸鹽、尿酸酶、L-脯氨酸芳胺酶、β-半乳糖苷酶等反應(yīng)呈陰性。因此初步確定該株致病菌為嗜水氣單胞菌。

2.4 16S rRNA基因序列分析 以分離菌株的DNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，目的片段約為1 500 bp(圖略)。序列分析顯示，其與嗜水氣單胞菌同源性為99 %，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1，進(jìn)一步表明該菌為嗜水氣單胞菌。

圖1 YW01 的16S rRNA 聚類分析Fig.1 The cluster analysis of the isolate based on 16S rRNA

2.5 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.6 p H對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 經(jīng)過在不同pH 下的培養(yǎng)顯示，當(dāng)培養(yǎng)基pH 為3～5 時(shí)，該菌株的OD600nm值變化不大；當(dāng)pH 值為5～7 時(shí)，培養(yǎng)液的OD600nm值隨著pH 的升高顯著增大；在pH 值達(dá)到7～8 時(shí)，OD600nm值達(dá)到峰值；之后OD600nm值隨著pH 值升高而顯著減小，當(dāng)pH 值達(dá)到11 時(shí)，OD600nm值最低。表明該菌株最適pH 為7～8。

表1 YW01 藥敏試驗(yàn)(n=5)Table 1 Antibiotic sensitivity of isolate strain YW01(n=5)

2.7 溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 經(jīng)過在不同溫度下的培養(yǎng)顯示，該菌株當(dāng)培養(yǎng)溫度為12 ℃～32 ℃時(shí)，菌株M3 的OD600nm值逐漸增大，在32 ℃達(dá)到峰值；之后，OD600nm值隨著培養(yǎng)溫度的升高而顯著下降，當(dāng)溫度值達(dá)到40 ℃時(shí)，OD600nm值最低。表明在12 ℃～40 ℃均能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為32 ℃。圖2 為病原菌在最適生長(zhǎng)溫度為32 ℃時(shí)的生長(zhǎng)曲線。

圖2 32 ℃條件下菌株YW01 的生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curve of isolate strain YW01 at 32 ℃

2.8 人工感染試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，經(jīng)計(jì)算LD50=9.55×109cfu/mL，與以往研究比較[9-10]，表明該分離菌株具有較低的致病性。

表2 YW01 菌株感染試驗(yàn)Table 2 Infection test by isolate strain YW01

3 討論

嗜水氣單胞菌感染淡水魚類引起的疾病根據(jù)魚的種類表現(xiàn)略有不同，例如錦鯉表現(xiàn)為體表及各鰭出血、鱗片脫落，大面積肌肉腐爛甚至穿孔[9]，施氏鱘癥狀主要為體表出血、腹部腫脹、肝脾腎等器官出現(xiàn)出血現(xiàn)象[10]；本研究中血鸚鵡的發(fā)病癥狀與嗜水氣單胞菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物疾病癥狀相近。

研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌對(duì)甘露醇、葡萄糖等反應(yīng)呈陽性[11]，與本研究結(jié)果相同。秦國民等研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌對(duì)葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖、脂酶等反應(yīng)呈陽性，對(duì)β-丙氨酸芳胺酶等反應(yīng)呈陰性[12]，與本研究相同，但對(duì)組氨酸同化、乳酸鹽產(chǎn)堿等反應(yīng)結(jié)果與本研究不同。為了進(jìn)一步確定YW01 的分類學(xué)地位，本研究進(jìn)行了16S rRNA 基因的序列比對(duì)分析，通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，YW01 與嗜水氣單胞菌聚類，相應(yīng)基因的同源性為99 %。因此綜合以上分析確定YW01 為嗜水氣單胞菌。

司力娜等在東北三省患病鯉魚分離的嗜水氣單胞菌的藥敏研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)多粘霉素B、諾氟沙星高度敏感，對(duì)氨芐西林、頭孢拉定、林可霉素不敏感[13]，與本研究結(jié)果相同，但本研究中對(duì)麥迪霉素不敏感，對(duì)紅霉素、萘啶酸高度敏感與其則不同。由此可以得出即使是同一種病原菌不同的分離株抗藥性也不完全相同。

對(duì)嗜水氣單胞菌生物學(xué)特性的研究過程中發(fā)現(xiàn)病原菌的最適pH 為7～8，表明自然養(yǎng)殖水體中適宜嗜水氣單胞菌的生長(zhǎng)；最適生長(zhǎng)溫度出現(xiàn)在32 ℃，表明該病原菌在夏季水溫相對(duì)較高時(shí)生長(zhǎng)代謝旺盛，而在溫度較低時(shí)生長(zhǎng)緩慢，提醒養(yǎng)殖戶在飼養(yǎng)觀賞魚類的過程中，水溫上升時(shí)應(yīng)當(dāng)注意該類細(xì)菌病的防范。此外通過細(xì)菌生長(zhǎng)曲線確定該分離菌的最佳培養(yǎng)時(shí)間為10 h～22 h，推測(cè)該分離菌為急性感染菌類，潛伏期較短。嗜水氣單胞菌對(duì)西伯利亞鱘的LD50為5.62×105cfu/mL[14]，對(duì)斑鱧的LD50為6.83×105cfu/mL[15]。本研究中分離菌YW01 對(duì)血鸚鵡魚的LD50為9.55×109cfu/mL，明顯比上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果低，表明該分離株的致病力相對(duì)較低。

本研究為嗜水氣單胞菌引起傳染病的防治提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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