HPLC法測(cè)定硫磺熏蒸與未熏蒸北沙參中5種香豆素類成分的含量Δ

牛 韜（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250014）

北沙參為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis的干燥根，具有養(yǎng)陰清肺、益胃生津之功效。常用于肺熱燥咳，勞嗽痰血，胃陰不足，熱病津傷，咽干口渴[1]。作為藥材的一種傳統(tǒng)養(yǎng)護(hù)方法，硫磺熏蒸在中藥材及飲片的加工、貯藏中應(yīng)用普遍。硫磺熏蒸可導(dǎo)致中藥材中二氧化硫（SO2）、砷、汞等重金屬殘留超標(biāo)[2]，有效成分損失和改變[3]，藥材毒性增加[4]，還直接影響了患者的用藥安全和療效。為此，國(guó)家采取各項(xiàng)措施限制硫磺熏蒸在中藥材及飲片加工過(guò)程中的使用，并將SO2檢測(cè)方法列入2010年版《中國(guó)藥典》附錄中。在本研究中筆者擬用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定硫磺熏蒸及未熏蒸北沙參藥材中補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素5 種香豆素類成分的含量，探討硫磺熏蒸對(duì)北沙參有效成分的影響。

1 材料

2996型HPLC儀，包括2996二極管檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；AE200 型電子天平（上海臺(tái)衡儀器儀表有限公司）；AB135-S型電子分析天平、KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（批號(hào)：110739-201115）、歐前胡素對(duì)照品（批號(hào)：110826-201214）、異歐前胡素對(duì)照品（批號(hào)：110827-201109）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均＞98%；花椒毒素對(duì)照品（批號(hào)：20130324）、佛手柑內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：20121027）均購(gòu)于武漢天植生物技術(shù)有限公司，純度均＞98%；甲醇、乙腈為色譜純，磷酸、甲醇為分析純，水為純凈水。

北沙參采自山東煙臺(tái)萊陽(yáng)胡城村、河北安國(guó)明官店鄉(xiāng)霍莊村、山東煙臺(tái)海陽(yáng)小紀(jì)鎮(zhèn)、山東威海文登昆崳鎮(zhèn)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李峰教授鑒定為真品，部分不熏蒸，部分由筆者自行熏蒸；硫磺熏蒸北沙參飲片購(gòu)自安徽亳州中藥材市場(chǎng)（批號(hào)：131001）、河北安國(guó)中藥材市場(chǎng)（批號(hào)：131017）、山東海陽(yáng)中藥材市場(chǎng)（批號(hào)：130619）、山東煙臺(tái)三聯(lián)中藥材市場(chǎng)（批號(hào)：130611）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～18 min，24%→50%A；18～25 min，50%→64%A；25～33 min，64%→72%A；33～40 min，72%A）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：295 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品2.43 mg、花椒毒素對(duì)照品7.78 mg、佛手柑內(nèi)酯對(duì)照品1.10 mg、歐前胡素對(duì)照品1.41 mg、異歐前胡素對(duì)照品1.85 mg，置于同一100 ml量瓶中，加入75%乙醇溶解并定容，制得補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素質(zhì)量濃度分別為24.3、77.8、11.0、14.1、18.5 μg/L的混合對(duì)照品貯備液；精密量取上述貯備液適量，加入75%乙醇溶解，制得補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素質(zhì)量濃度分別為12.2、38.9、5.5、7.1、9.3 μg/L的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 分別取硫磺熏蒸與未熏蒸北沙參粉末（過(guò)4號(hào)篩）各約2 g，分別置于50 ml量瓶中，加入75%甲醇20 ml，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）提取30 min，放冷，濾過(guò)，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)混合照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，各成分分離效果良好，理論板數(shù)以補(bǔ)骨脂素峰面積計(jì)均大于3 000。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.硫磺未熏蒸北沙參供試品；C.硫磺熏蒸北沙參供試品；1.補(bǔ)骨脂素；2.花椒毒素；3.佛手柑內(nèi)酯；4.歐前胡素；5異歐前胡素Fig 1 HPLC ChromatogramsA.mixed reference；B.test samples of G.littoralis with no sulphur fumigation；C.test samples of G.littoralis with sulphur fumigation；1.psoralen；2.xanthotoxin；3.bergapten；4.imperatorin；5.isoimporatorin

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，采用逐級(jí)稀釋法依次制得稀釋倍數(shù)為1、2、4、10、20、40、100 的系列質(zhì)量濃度混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素的回歸方程分別為y＝99 911x－8 180.1（r＝0.999 8）、y＝59 343x－147 36（r＝0.999 9）、y＝150 000x－4 441.9（r＝0.999 7）、y＝54 709x－2 222.2（r＝0.999 8）、y＝65 659x－3 567.2（r＝0.999 7）。結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素的質(zhì)量濃度分別在0.121 5～12.15、0.389～38.9、0.055～5.5、0.070 5～7.05、0.092 5～9.25 μg/L范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素峰面積的RSD 分別為0.12%、0.08%、0.65%、0.70%、0.38%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取硫磺熏蒸北沙參（批號(hào)：131001）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素峰面積的RSD分別為0.69%、2.61%、0.96%、2.78%、2.15%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取硫磺熏蒸北沙參（批號(hào)：131001）適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素峰面積的RSD 分別為0.91%、0.96%、1.08%、2.82%、2.73%（n＝6），表明本方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定已知含量的硫磺熏蒸北沙參（批號(hào)：131001）粉末（過(guò)4 號(hào)篩）6 份，每份1 g，分別加入一定量的混合對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素加樣回收率為98.55%～99.54%，RSD為0.71%（n＝6）；花椒毒素加樣回收率為98.44%～101.29%，RSD為1.72%（n＝6）；佛手柑內(nèi)酯加樣回收率為98.01%～100.06%，RSD 為1.34%（n＝6）；歐前胡素加樣回收率為100.05%～101.77%，RSD 為2.32%（n＝6）；異歐前胡素加樣回收率為100.32%～101.97%，RSD 為0.89%（n＝6）。

2.9 樣品含量測(cè)定

分別稱取不同產(chǎn)地硫磺未熏蒸、自行熏蒸北沙參與硫磺熏蒸飲片各適量，粉碎，過(guò)4號(hào)篩，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算香豆素類成分的含量，詳見(jiàn)表1[編號(hào)1～4 分別為山東煙臺(tái)萊陽(yáng)胡城村、河北安國(guó)明官店鄉(xiāng)霍莊村、山東煙臺(tái)海陽(yáng)小紀(jì)鎮(zhèn)、山東威海文登昆崳鎮(zhèn)采摘的藥材；編號(hào)5～8 分別為上述產(chǎn)地藥材自行熏蒸所得供試品；編號(hào)9～12分別為安徽亳州中藥材市場(chǎng)（批號(hào)：131001）、河北安國(guó)中藥材市場(chǎng)（批號(hào)：131017）、山東海陽(yáng)中藥材市場(chǎng)（批號(hào)：130619）、山東煙臺(tái)三聯(lián)中藥材市場(chǎng)（批號(hào)：130611）所購(gòu)飲片]。

表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，μg/g）Tab 1 Results of the contents determination of samples（n＝3，μg/g）

3 討論

本研究結(jié)果表明，硫磺熏蒸北沙參中5種香豆素類成分含量均低于未熏蒸北沙參。為進(jìn)一步證實(shí)北沙參中5 種香豆素類成分的減少與硫磺熏蒸有關(guān)，筆者對(duì)收集的4批未熏蒸北沙參進(jìn)行硫磺熏蒸處理后，分別對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，經(jīng)與未熏蒸北沙參比較，發(fā)現(xiàn)5 種香豆素類成分的含量明顯減少，說(shuō)明硫磺熏蒸可導(dǎo)致北沙參中補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手苷內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素含量減少，但具體機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步研究。

目前，雖有學(xué)者對(duì)硫磺熏蒸藥材的鑒別進(jìn)行了相關(guān)的研究工作[5]，但尚不成熟。為防止中藥材粗加工過(guò)程中濫用或過(guò)度使用硫磺熏蒸的問(wèn)題，保證中藥的質(zhì)量和用藥安全，2010年版《中國(guó)藥典第二增補(bǔ)本》中收載了中藥材及飲片的SO2殘留量標(biāo)準(zhǔn)，除山藥、牛膝、粉葛、天冬、天麻、天花粉、白及、白芍、白術(shù)、黨參10 種中藥材及飲片中亞硫酸鹽殘留量（以SO2計(jì)）不得超過(guò)400 mg/kg外，其余中藥材及飲片中亞硫酸鹽殘留量均不得超過(guò)150 mg/kg[6]。為保證中藥材及飲片低硫或無(wú)硫，必須規(guī)范藥材產(chǎn)地加工方法，研究先進(jìn)的飲片貯藏保管技術(shù)，加強(qiáng)監(jiān)管力度，以確保中藥飲片的用藥安全和療效。

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