HPLC法同時(shí)測(cè)定消核靈膠囊中延胡索乙素和迷迭香酸的含量

王佃榮，陳洪喜，楊智慧（.連云港市第一人民醫(yī)院，江蘇連云港 00；.連云港市藥品檢驗(yàn)所，江蘇連云港 006）

消核靈膠囊（蘇藥制字Z04000076）是連云港市第一人民醫(yī)院研制的醫(yī)院制劑，是由延胡索、夏枯草、穿山甲、全蝎、斑蝥、蜈蚣6味藥組成的中藥復(fù)方制劑，具有解郁散結(jié)、調(diào)經(jīng)理氣之功效[1]，可用于乳癖結(jié)塊（乳腺小葉增生）的治療。本品原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)延胡索乙素和迷迭香酸含量的測(cè)定，亦未見(jiàn)同時(shí)測(cè)定上述兩種物質(zhì)含量方法的報(bào)道。為快速、全面控制藥品質(zhì)量，確保制劑療效，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-6]，采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)對(duì)消核靈膠囊中延胡索乙素和迷迭香酸含量進(jìn)行了測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100 型HPLC 儀，包括四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、VWD 檢測(cè)器（美國(guó)Agilent 公司）；BP211D 型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；SK250HP型超聲儀（上海利導(dǎo)超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：50 kHz）；ZF-2型紫外光燈（上海安亭儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

消核靈膠囊（連云港市第一人民醫(yī)院自制，批號(hào)：20130304、20130906、20131025，規(guī)格：0.3 g/粒）；延胡索乙素對(duì)照品（批號(hào)：110726-201213）、迷迭香酸對(duì)照品（批號(hào)：111871-201203）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，純度均＞98%；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為高純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.1%磷酸（以三乙胺調(diào)pH 至6.0）-甲醇（45∶55，V/V）為流動(dòng)相A，0.1%磷酸-甲醇（55∶45，V/V）為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～22 min，90%→80%A；22～27 min，80%→50%A；27～32 min，50%→20%A；32～60 min，20%→5%A）；流速：0.8 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：282 nm（0～25 min）、330 nm（25.01～60 min）；柱溫：28 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。在此色譜條件下，色譜基線平穩(wěn)，延胡索乙素峰、迷迭香酸峰與相鄰色譜峰均能達(dá)到基線分離，陰性樣品無(wú)干擾，理論板數(shù)以迷迭香酸峰計(jì)不低于5 000，詳見(jiàn)圖1。

2.2 溶液的制備

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.缺延胡索的陰性對(duì)照；C.缺夏枯草的陰性對(duì)照；D.供試品；1.延胡索乙素；2.迷迭香酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substances；B.negative control of Corydalis yanhusuo；C.negative control of Prunella vulgaris；D.test sample；1.tetrahydropalmatine；2.rosmarinic acid

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取延胡索乙素對(duì)照品15.02 mg、迷迭香酸對(duì)照品60.32 mg，分別置于100 ml 量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成延胡索乙素質(zhì)量濃度為150.2μg/ml、迷迭香酸質(zhì)量濃度為603.2μg/ml 的對(duì)照品貯備液。分別精密吸上述對(duì)照品貯備液各5 ml，置于同一50 ml量瓶中，加70%甲醇定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品20 粒的內(nèi)容物，研細(xì)，取約1.5 g，精密稱(chēng)定，精密加入15 ml 70%甲醇，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取45 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按處方工藝分別制備不含延胡索和夏枯草藥材的陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項(xiàng)下延胡索乙素、迷迭香酸對(duì)照品貯備液各5、2、1、0.5、0.2、0.1 ml，置于10 ml量瓶中，用70%甲醇定容，制成系列混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得延胡索乙素回歸方程為y＝1.328×103x－2.715（r＝0.999 8）；迷迭香酸回歸方程為y＝2.169×103x+1.591（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，延胡索乙素、迷迭香酸檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為1.502～75.10、6.03～301.6 μg/ml。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6 次。結(jié)果，延胡索乙素、迷迭香酸峰面積的RSD 分別為0.82%、1.28%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20130304）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置0、1、3、5、8、12 h 時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，延胡索乙素、迷迭香酸峰面積的RSD分別為1.36%、0.98%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一樣品（批號(hào)：20130304）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，延胡索乙素、迷迭香酸的平均含量分別為51.24、203.2μg/粒，RSD分別為1.12%、1.06%（n＝6），表明本方法重復(fù)性較好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的樣品（批號(hào)：20130304）內(nèi)容物1.5 g，共9 份，分別精密加入高、中、低質(zhì)量的混合對(duì)照品，每3 份一組，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.8 樣品含量測(cè)定

取3 批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，μg/粒）Tab 2 Determination results of samples’contents（n＝3，μg/granule）

2.9 耐用性試驗(yàn)

取供試品溶液（批號(hào)：20130304）適量，在其他色譜條件不變的情況下，分別采用Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果，不同色譜柱的供試品中延胡索乙素的含量分別為51.24、51.09、50.02 μg/粒；RSD均為1.21%（n＝6），迷迭香酸的含量分別為203.2、202.1、203.5 μg/粒，RSD 均為1.05%（n＝6），表明3 種不同品牌的色譜柱對(duì)延胡索乙素和迷迭香酸的含量測(cè)定影響均較小，方法耐用性較好。

3 討論

3.1 提取條件的選擇

本研究分別考察了加熱回流法、冷浸提取法和超聲提取法，以30%甲醇溶液、50%甲醇溶液、70%甲醇溶液為提取溶劑，提取30、45、60 min 時(shí)的提取效果，結(jié)果表明以70%甲醇溶液超聲提取45 min 時(shí)延胡索乙素和迷迭香酸的提取效率最高[7]。

3.2 柱溫的選擇

取同一供試品溶液適量，分別在25、28、30 ℃下試驗(yàn)，結(jié)果均能達(dá)到基線分離，但25 ℃時(shí)迷迭香酸的出峰時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，30 ℃時(shí)延胡索乙素和相鄰峰的分離度不理想，故選擇28 ℃為本研究的柱溫。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)延胡索乙素和迷迭香酸紫外吸收掃描結(jié)果可知，兩者分別在282、330 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。故為了提高測(cè)定靈敏度，本試驗(yàn)采用了切換檢測(cè)波長(zhǎng)。結(jié)果顯示，該方法具有較高的靈敏度，提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上所述，該方法操作簡(jiǎn)便，快速易行，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可作為消核靈膠囊中延胡索乙素和迷迭香酸的含量測(cè)定方法。

[1]李永溟，尹可華，戴翔鈴.HPLC 法測(cè)定消核靈膠囊中熊果酸的含量[J].重慶醫(yī)學(xué)，2002，31（11）：1 145.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：263、525-527.

[3]花汝鳳，姚江雄，黎志堅(jiān)，等.HPLC同時(shí)測(cè)定夏桑菊顆粒中迭香酸與異迷迭香酸苷的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（24）：75.

[4]徐婷，曹惠明，金昔陸，等.延胡索乙素臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，14（4）：60.

[5]王曉玲，鄭振，洪戰(zhàn)英，等.中藥延胡索的化學(xué)成分與質(zhì)量控制研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22（1）：227.

[6]王發(fā)，張秉華，郭歡迎.HPLC 法測(cè)定復(fù)方甘草麻黃堿片中鹽酸麻黃堿和延胡索乙素的含量[J].藥物分析雜志，2010，30（3）：541.

[7]陳玲玲，朱德全，蔡月娥，等.正交試驗(yàn)優(yōu)化溪黃草中咖啡酸和迷迭香酸的超聲提取工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（12）：12.