桑白皮有效成分分離純化的工藝研究Δ

董德剛，張秀英，劉小雪（1.大連醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，遼寧大連 11607；.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，沈陽(yáng) 110847）

桑白皮為桑科落葉灌木或小喬木植物桑Morus albaL.的干燥根皮，含有黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、多糖類(lèi)等多種物質(zhì)，具有瀉肺平喘、利水消腫的功效[1]。藥理研究顯示，桑白皮總黃酮具有降低血糖血脂[2]、抗病毒[3]等作用；桑白皮提取物（桑黃酮含量＞30%）對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病模型大鼠坐骨神經(jīng)損傷有一定的改善作用[4]；桑白皮多糖對(duì)四氯化碳、對(duì)乙酰氨基酚所致小鼠急性肝損傷均有明顯的保護(hù)作用[5]；且桑白皮總黃酮、總多糖及總生物堿各部位均具有一定的降糖作用[6]。筆者擬根據(jù)桑白皮總黃酮、總多糖、總生物堿不同有效成分的性質(zhì)，優(yōu)選桑白皮有效部位的分離純化工藝，為有效提取桑白皮有效成分提供參考。

1 材料

1.1 儀器

HH-S恒溫水浴鍋（金壇市億通電子有限公司）；KYC-1102恒溫?fù)u床（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；UV-1750紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.2 藥品與試劑

蘆丁對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：130824，純度：≥98%）；葡萄糖對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：130407，純度：≥98%）；4-羥基哌啶（阿拉丁試劑有限公司，批號(hào)：41944，純度：98%）；D101大孔吸附樹(shù)脂、HPD400 大孔吸附樹(shù)脂、AB-8 大孔吸附樹(shù)脂、001×7 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂均購(gòu)自滄州寶恩吸附材料科技有限公司；桑白皮飲片（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，批號(hào)：20140110）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總多糖、總黃酮、總生物堿的含量測(cè)定

2.1.1 總多糖含量測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[7]。稱(chēng)取葡萄糖對(duì)照品6.19 mg，置于50 ml 量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，超聲振蕩得0.123 8 mg/ml 的葡萄糖對(duì)照品貯備液。分別量取上述貯備液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 ml于具塞試管中，用蒸餾水定容至2.0 ml，再加入1.0 ml 6%苯酚溶液及5.0 ml 98%濃硫酸，蓋塞，靜置10 min，搖勻，再放置20 min，用分光光度計(jì)于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）。以質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)、A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為A＝7.828 3c－0.025 3（r＝0.999 1）。結(jié)果顯示，葡萄糖檢測(cè)質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍為0.024 8～0.111 4 mg/ml。

2.1.2 總黃酮含量測(cè)定 采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[8]。精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品5.690 1 mg 于50 ml 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得蘆丁對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 ml 蘆丁對(duì)照品溶液于10 ml 量瓶中，分別加乙醇至5 ml，然后加入0.05 g/ml亞硝酸鈉溶液0.3 ml，搖勻，靜置6 min；加入0.1 g/ml 硝酸鋁溶液0.3 ml，搖勻，靜置6 min；加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4 ml，再加無(wú)水乙醇至10 ml，搖勻，靜置15 min。用分光光度計(jì)于498 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A，以c為橫坐標(biāo)、A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為A＝6.545 6c+0.124 8（r＝0.998 4）。結(jié)果顯示，蘆丁檢測(cè)質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍為0.011 4～0.091 1 mg/ml。

2.1.3 總生物堿含量測(cè)定 采用雷氏鹽比色法[9]。精密稱(chēng)取4-羥基哌啶0.307 8 g，置于50 ml量瓶中，用0.05 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，得6.156 mg/ml 4-羥基哌啶對(duì)照品溶液。取0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 ml 4-羥基哌啶對(duì)照品溶液于具塞試管中，加入0.05 mol/L HCl溶液至2 ml，再加入20 g/L的雷氏鹽溶液3 ml，搖勻，冰浴1 h，以離心半徑為15 cm（下同）、3 500 r/min離心10 min。取沉淀，用水洗滌至洗滌液無(wú)色，用70%丙酮溶液溶解沉淀，以3 500 r/min 離心5 min。用分光光度計(jì)于498 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定A，以c為橫坐標(biāo)、A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為A＝0.259 4c－0.137 8（r＝0.999 4）。結(jié)果顯示，4-羥基哌啶檢測(cè)質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍為0.615 6～6.156 0 mg/ml。

2.2 桑白皮提取物的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[10-12]，取干燥桑白皮粉碎，稱(chēng)取100 g 加入8倍量80%（g/ml）乙醇浸泡，回流提取2次，每次2 h。收集提取液，蒸發(fā)濃縮，并加一定量蒸餾水稀釋提取液至質(zhì)量濃度為0.1 g（生藥）/ml，此提取液作為總黃酮、總生物堿提取液。藥渣加8倍量蒸餾水回流提取2次，每次2 h，合并水提取液，減壓濃縮，此濃縮液作為總多糖提取液。

2.3 含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取葡萄糖對(duì)照品溶液1.0 ml、蘆丁對(duì)照品溶液2.0 ml、4-羥基哌啶對(duì)照品溶液1.0 ml，分別測(cè)定A，平行測(cè)定5 次。結(jié)果，葡萄糖、蘆丁、4-羥基哌啶A的RSD 分別為0.55%、0.37%、0.59%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別吸取桑白皮總多糖、總黃酮、總生物堿提取液適量，在30 min內(nèi)，每隔5 min 測(cè)定1次A，一共測(cè)定6次。結(jié)果，總多糖、總黃酮、總生物堿A的RSD分別為1.36%、1.11%、1.98%（n＝6），表明各供試品溶液在30 min 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別吸取桑白皮總多糖、總黃酮、總生物堿提取液適量，各5份，分別測(cè)定其A。結(jié)果，總多糖、總黃酮、總生物堿A的RSD 分別為1.29%、1.46%、1.81%（n＝5），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 分別吸取已知含量的桑白皮總多糖、總黃酮、總生物堿提取液適量，各5 份，分別加入一定量的相應(yīng)對(duì)照品溶液，測(cè)定其A，計(jì)算平均回收率。結(jié)果，總多糖、總黃酮、總生物堿A的平均加樣回收率分別為100.79%、101.45%、101.23%，RSD分別為1.21%、2.18%、1.48%（n＝5）。

2.4 總黃酮的分離純化

2.4.1 大孔吸附樹(shù)脂的篩選 將已處理好的D101、AB-8、HPD400 大孔吸附樹(shù)脂中游離水分抽干，稱(chēng)取1 g，置于50 ml錐形瓶中，加入總黃酮提取液20 ml，25 ℃恒溫振蕩24 h，振蕩速度為130 r/min，使其充分吸附，抽濾，測(cè)定濾液A，計(jì)算總黃酮吸附率[吸附率＝（吸附量－初始量）/初始量×100%]。將樹(shù)脂抽濾至干，各加入95%乙醇20 ml，按前述振蕩條件振蕩24 h，使其充分解吸附，抽濾，測(cè)定濾液A，并計(jì)算總黃酮的靜態(tài)解吸率（解吸率＝解吸量/吸附量×100%）。結(jié)果，D101、HPD400和AB-8 大孔對(duì)樹(shù)脂桑白皮黃酮的吸附率分別為78.32%、79.27%、76.49%，解吸率分別為70.12%、68.34%、62.79%。這表明D101 大孔吸附樹(shù)脂對(duì)桑白皮總黃酮的靜態(tài)吸附性能和靜態(tài)解吸附性能均較好，所以進(jìn)一步研究其對(duì)桑白皮總黃酮的動(dòng)態(tài)吸附。

2.4.2 上樣液量的篩選 量取D101大孔吸附樹(shù)脂10 ml，濕法裝柱，加入桑白皮總黃酮提取液，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附的流速為1.0 ml/min，流出液每1 BV（柱體積倍數(shù)）收集1管并測(cè)定流出液中桑白皮總黃酮的A，繪制動(dòng)態(tài)吸附曲線(xiàn)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同上樣液量對(duì)桑白皮總黃酮吸光度的影響Fig 1 Effects of different loading amounts of fluid on the absorbancy of total flavonids from M.alba L.

由圖1 可知，D101 大孔吸附樹(shù)脂對(duì)桑白皮總黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附過(guò)程中，流出液的總黃酮濃度逐漸升高（A增大）；當(dāng)上樣液體積為9 BV時(shí)，流出液總黃酮的濃度接近于桑白皮總黃酮原液濃度（流出液的A接近原液），達(dá)到了吸附平衡。因此，確定上樣液的最佳上樣液量為9 BV。

2.4.3 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的篩選 準(zhǔn)確吸取上樣液，平行4 份，以1.0 ml/min上柱，至吸附完全后，用水洗脫至無(wú)色，然后分別用30%、50%、70%、90%乙醇各40 ml洗脫，收集洗脫液，測(cè)定洗脫液A，計(jì)算樹(shù)脂解吸量（解吸量＝洗脫液濃度×洗脫液體積）和總黃酮解吸率（解吸率＝解吸量/吸附量×100%）。結(jié)果表明，D101 大孔吸附樹(shù)脂對(duì)桑白皮總黃酮解吸率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈先增大后減小的變化趨勢(shì)，可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，醇溶性的雜質(zhì)增多，降低了解吸率。因此，確定以70%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)桑白皮總黃酮的洗脫影響Tab 1 Effects of different volume fractions of alcohol on the elution of total flavonids from M.alba L.

2.4.4 洗脫劑用量的篩選 準(zhǔn)確量取已處理好的D101 大孔吸附樹(shù)脂10 ml，準(zhǔn)確吸取90 ml上樣液，以1.0 ml/min上柱，至吸附完全后，先用水洗脫，再用70%乙醇以1.0 ml/min 洗脫。流出液每1 BV收集1管，至流出液基本無(wú)黃酮時(shí)（測(cè)定流出液吸光度值很低，當(dāng)7 BV時(shí)A＝0.127 8）停止。測(cè)定各流出液中桑白皮總黃酮的A，繪制桑白皮總黃酮的洗脫曲線(xiàn)，見(jiàn)圖2。

從圖2 可知，D101 大孔吸附樹(shù)脂在對(duì)桑白皮總黃酮的動(dòng)態(tài)洗脫過(guò)程中，2 BV的70%乙醇對(duì)桑白皮總黃酮的洗脫效率最高，但5 BV左右的乙醇可以將其洗脫完全。因此，確定洗脫劑用量為5 BV。

圖2 不同洗脫劑用量對(duì)桑白皮總黃酮吸光度的影響Fig 2 Effects of different amounts of eluent on the absorbancy of total flavonids from M.alba L.

2.4.5 總黃酮的提取 綜上所述，確定了D101大孔吸附樹(shù)脂純化桑白皮總黃酮的最佳工藝為：上樣液質(zhì)量濃度為0.1 g（生藥）/ml，最大上樣量9 BV，洗脫劑為70%的乙醇，洗脫劑用量為5 BV，減壓干燥乙醇洗脫液。按上述工藝條件操作后制得桑白皮總黃酮。

2.5 總多糖的分離純化

將桑白皮總多糖提取液分成3等份，分別加入95%乙醇，使其含醇體積分?jǐn)?shù)至60%、70%、80%，靜置12 h，抽濾得總多糖沉淀。沉淀先后用無(wú)水乙醇、丙酮多次洗滌，干燥稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算總多糖得率；測(cè)定總多糖含量并計(jì)算總多糖純度。結(jié)果，3種乙醇體積分?jǐn)?shù)下總多糖得率分別為1.7%、1.9%、2.5%，總多糖純度分別為40.22%、44.53%、47.15%。因此，確定沉淀多糖的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.6 總生物堿的分離純化

向總生物堿提取液中加入2 mol/L鹽酸，調(diào)節(jié)pH為2～4，抽濾，去除濾渣，將總生物堿濾液作為上柱樣品溶液。

2.6.1 上樣液量的篩選 量取預(yù)處理好的001×7 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂20 ml裝柱，將總生物堿濾液加入到離子交換柱中，流速2 ml/min，每1 BV收集1管，測(cè)定各流出液中桑白皮總生物堿A，繪制動(dòng)態(tài)吸附曲線(xiàn)，見(jiàn)圖3。

圖3 不同上樣液量對(duì)桑白皮總生物堿吸光度的影響Fig 3 Effects of different loading amounts of fluid on the absorbancy of total alkaloids from M.alba L.

由圖3可知，流出液中桑白皮總生物堿的A至上樣液量為3 BV時(shí)趨于平緩，即上樣3 BV時(shí)已達(dá)到001×7陽(yáng)離子交換樹(shù)脂對(duì)桑白皮總生物堿的最大吸附量。因此，確定最佳上樣液量為3 BV。

2.6.2 洗脫劑用量的篩選 準(zhǔn)確量取桑白皮總生物堿提取液3 BV，通過(guò)已處理好的001×7陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，然后用去離子水洗至流出液為無(wú)色，再以0.5 mol/L 氨水洗脫，每1 BV 收集1管，測(cè)定各流出液中桑白皮總生物堿的A，繪制洗脫曲線(xiàn)，見(jiàn)圖4。

圖4 不同洗脫劑用量對(duì)桑白皮總生物堿吸光度的影響Fig 4 Effects of different amounts of eluent on the absorbancy of total alkaloids from M.alba L.

由圖4 可知，洗脫劑用量為3 BV 時(shí)流出液中桑白皮總生物堿濃度最高（A最大），至8 BV時(shí)洗脫完全。因此，確定將桑白皮總生物堿洗脫完全需要0.5 mol/L氨水8 BV。

2.6.3 總生物堿的提取 將收集的氨水洗脫液減壓濃縮，濃縮液中按1∶1 比例加入正丁醇，振搖提取5 次，合并正丁醇液。綜上結(jié)果，桑白皮總生物堿提取液以001×7陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為吸附劑，上樣3 BV后用0.5 mol/L氨水8 BV洗脫，將氨水洗脫液濃縮并用正丁醇萃取[濃縮液-正丁醇（1∶1，V/V）]，合并正丁醇液，減壓濃縮，干燥，得桑白皮總生物堿。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)“2.4”“2.5”“2.6”項(xiàng)下所述的桑白皮總黃酮、總多糖、總生物堿的純化工藝，各進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果，桑白皮總黃酮干燥粉末的純度分別為35.67%、35.22%、36.14%，平均純度為35.68%，RSD為1.28%（n＝3）；桑白皮總多糖干燥粉末的純度分別為47.99%、46.51%、46.93%，平均純度為47.14%，RSD為1.61%（n＝3）；桑白皮總生物堿干燥粉末的純度分別為55.74%、56.45%、55.18%，平均純度為55.79%，RSD 為1.14%（n＝3）。結(jié)果表明上述純化工藝穩(wěn)定、可靠。

3 討論

本研究通過(guò)D101大孔樹(shù)脂吸附、分離純化桑白皮總黃酮，通過(guò)水提醇沉的方法分離純化桑白皮總多糖，通過(guò)001×7 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附與正丁醇萃取分離純化桑白皮總生物堿，其干燥后總多糖、總黃酮、總生物堿粉末平均純度分別為47.14%、35.68%、55.79%。筆者通過(guò)不同的分離純化方法，分別制得桑白皮3種不同有效成分，對(duì)于桑白皮的工業(yè)開(kāi)發(fā)利用與藥理藥效的研究有一定意義。

水提醇沉是提取中藥中總多糖成分的一種經(jīng)典工藝，具有方便、快捷、簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，本試驗(yàn)方法可作為桑白皮總多糖的富集工藝。

針對(duì)總生物堿的性質(zhì)選用強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，將酸化的總生物堿提取液通過(guò)樹(shù)脂，使總生物堿鹽的陽(yáng)離子交換到樹(shù)脂上而與其他成分和雜質(zhì)分離；再用氨水堿化得到游離態(tài)總生物堿，并經(jīng)正丁醇萃取，萃取前后的純度分別為28%（未經(jīng)萃取的生物堿溶液干燥后所得）、55%。因此，桑白皮總生物堿的提取純化工藝雖較復(fù)雜，但有效地增加了桑白皮總生物堿的純度。

桑白皮總黃酮的純度還有待提高，分析其原因如下：其一，可能是不同產(chǎn)地、不同采集時(shí)間及不同貯藏時(shí)間的桑白皮中總黃酮的含量差異較為明顯[13]。今后宜采用不同批次、不同產(chǎn)地的桑白皮進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。其二，在考察總黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附曲線(xiàn)，上樣1 BV時(shí)便可檢測(cè)到總黃酮量，分析原因可能為打開(kāi)閥時(shí)速度未控制理想或其他操作不當(dāng)，也有可能試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)上樣速度、提取液濃度等相關(guān)重要參數(shù)選擇不合理。因此，擬在今后的研究中進(jìn)一步優(yōu)化此工藝，以提高桑白皮總黃酮的純度。

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