腫瘤壞死因子-α預(yù)處理與缺血預(yù)處理在減輕肝臟缺血再灌注損傷的作用

郭懷斌，趙　炎，劉　峰，岳立輝，張萬星　(.河北省人民醫(yī)院普外三科，河北 石家莊 05005；.河北省人民醫(yī)院基建處，河北 石家莊 05005；.河北省人民醫(yī)院麻醉科，河北 石家莊 05005)

?

腫瘤壞死因子-α預(yù)處理與缺血預(yù)處理在減輕肝臟缺血再灌注損傷的作用

郭懷斌1，趙炎2，劉峰1，岳立輝3，張萬星1(1.河北省人民醫(yī)院普外三科，河北 石家莊 050051；2.河北省人民醫(yī)院基建處，河北 石家莊 050051；3.河北省人民醫(yī)院麻醉科，河北 石家莊 050051)

[摘要]目的研究采用腫效瘤壞死因子-α(TNF-α)預(yù)處理與采用缺血預(yù)處理兩種方法對(duì)減輕大鼠肝臟缺血再灌注損傷(IRI)的作用效果，并探討采用TNF-α預(yù)處理減輕大鼠肝臟IRI的機(jī)制。方法將40只Wistar大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(SO組)僅行開腹及游離肝十二指腸韌帶；缺血再灌注組(IR組)采用Pringle’s法阻斷肝門30 min，再灌注6 h；缺血預(yù)處理組(IPC組)采用Pringle’s法阻斷肝門10 min，開放血流10 min，此后操作同IR組；TNF-α預(yù)處理組(TPC組)，術(shù)前30 min給予TNF-α 1μg/kg腹腔注射，此后操作同IR組。檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)Bcl-2蛋白和NF-κB p65蛋白表達(dá)情況，以及肝細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。 結(jié)果IPC組血清ALT、AST水平為(316.4±90.6)U/L、(316.4±90.6)U/L，TPC組為(336.8±79.4)U/L、(392.7±109.3)U/L，與IR組(642.8±149.3)U/L、(730.6±103.0)U/L比較明顯降低，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肝細(xì)胞凋亡評(píng)分AI在IPC組(4.36+0.88)和TPC組(4.94+2.04)明顯降低，與IR組(9.48+2.42)比較，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肝組織內(nèi)Bcl-2蛋白陽性表達(dá)在IPC組(62.30+9.20)和TPC組(60.99+6.30)升高，與IR組(11.45+11.97)比較，有顯著性差異(P<0.05)；NF-κB p65陽性表達(dá)在IPC組(31.56+4.85)和TPC組(32.80+5.30)明顯降低，與IR組(68.33+6.07)比較，有顯著性差異(P<0.05)。上述各項(xiàng)指標(biāo)在IPC組與TPC組間，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論采用TNF-α預(yù)處理與缺血預(yù)處理對(duì)減輕大鼠肝臟IRI的效果一致，TNF-α預(yù)處理通過抑制NF-κB p65蛋白表達(dá)、激活凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表達(dá)，減輕了大鼠肝臟IRI。

[關(guān)鍵詞]肝臟；缺血再灌注損傷；腫瘤壞死因子-α；缺血預(yù)處理

腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α )作為一個(gè)重要的細(xì)胞因子，在肝臟熱缺血再灌注損傷過程發(fā)揮著重要作用[2-6]。在大鼠肝臟IRI過程中，采用TNF-α預(yù)處理的方法能明顯減輕大鼠肝臟IRI程度[7]。我們研究采用TNF-α預(yù)處理能否對(duì)肝臟IRI產(chǎn)生保護(hù)作用，以及與IPC的保護(hù)效果作比較，為臨床上減輕肝臟IRI探索一條新的途徑，并通過觀察凋亡抑制基因Bcl-2及核因子NF-κB在肝組織中的表達(dá)情況，初步探討采用TNF-α預(yù)處理對(duì)減輕肝臟IRI的機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

健康清潔級(jí)Wistar大鼠40只(河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量250～300 g，TNF-α(美國(guó)Santa Cruz公司)；Bcl-2免疫組化試劑盒(美國(guó)Santa Cruz公司)；NF-κB p65免疫組化試劑盒(美國(guó)Santa Cruz公司)；DAB顯色試劑盒(美國(guó)Zymed公司)；原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Roche公司)；蛋白酶K(美國(guó)Amresco公司)。

1.2動(dòng)物分組與模型制備

隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組(SO組，n=10)；缺血再灌注組(IR組，n=10)；缺血預(yù)處理組(IPC組，n=10)； TNF-α預(yù)處理組(HTPC組，n=10)。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，自由飲水。腹腔注射氯胺酮麻醉，取上腹正中切口，向上牽開肝臟，顯露并游離肝十二指腸韌帶。IR組，小號(hào)無損傷血管夾夾閉肝十二指腸韌帶致肝缺血30 min，然后松開血管夾恢復(fù)灌注，檢查確切開放血流后關(guān)閉腹腔。腹腔內(nèi)給予慶大霉素0.3 g，并向腹腔內(nèi)注射2 mL生理鹽水補(bǔ)液。單獨(dú)籠養(yǎng)，禁食、禁水。IPC組，小號(hào)無損傷血管夾夾閉肝十二指腸韌帶致肝缺血10 min，然后松開血管夾恢復(fù)灌注10 min，隨后操作同IR組。TPC組，術(shù)前30 min給予TNF-α腹腔注射預(yù)處理，劑量1 μg/kg，其余操作同IR組。SO組，僅游離肝十二指腸韌帶，不再做任何處理，然后關(guān)閉腹腔。各組大鼠于再灌注6 h后再次麻醉，經(jīng)心臟采血5 mL，不加抗凝劑，靜置10 min，離心后取上層血清用于檢測(cè)肝功變化。取肝右葉肝組織迅速切成0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm大小的組織塊置于4%中性多聚甲醛溶液中及時(shí)固定，做石蠟切片后行HE染色及免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.3血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的測(cè)定

利用日立全自動(dòng)生化分析儀,按說明書測(cè)定血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶。

1.4Bcl-2蛋白和NF-κB p65蛋白表達(dá)的檢測(cè)

也許這一事件最后不過是為孟山都、為農(nóng)藥的是是非非之爭(zhēng)又增添了一個(gè)案例。但透過這些是是非非，我們還是看到了很多值得思考的問題。

采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組Bcl-2蛋白和NF-κB p65蛋白的表達(dá)。Bcl-2蛋白表達(dá)以細(xì)胞漿內(nèi)呈棕黃色或黃色的顆?；驁F(tuán)塊為陽性細(xì)胞。NF-κB p65蛋白表達(dá)以細(xì)胞漿呈棕黃色著染為陽性細(xì)胞。每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選10個(gè)200倍視野進(jìn)行拍照，對(duì)每張照片計(jì)算陽性指數(shù)(PI)。PI= (N1+N2+…+ Nn)/n(n=10)。

1.5細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)，陽性凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕黃色著染。方法同上，計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)。AI= (A1+A2+…+An)/n(n=10)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1血清ALT、AST水平

IR組、IPC組和TPC組血清ALT、AST水平明顯升高，與SO組比較，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中IR組升高最明顯，與IPC組、TPC組比較，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IPC組與TPC組比較，P>0.05差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.2Bcl-2蛋白的表達(dá)

Bcl-2蛋白陽性表達(dá)在IPC組和TPC組表達(dá)明顯，而在SO組、IR組較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SO組與IR組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IPC組與TPC組比較，P>0.05差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

2.3NF-κB p65蛋白的表達(dá)

NF-κB p65蛋白陽性表達(dá)在IR組、IPC組和TPC組表達(dá)明顯，在SO組較少，P<0.05差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中IPC組、TPC組NF-κB p65陽性表達(dá)較IR組減低，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IPC組與TPC組比較，P>0.05差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

組別ALTASTSO61.6±11.375.8±46.6IR642.8±149.3*730.6±103.0*TPC336.8±79.4*#392.7±109.3*#IPC316.4±90.6*#△376.4±127.0*#△

*:與SO組比較，P<0.05；#:與IR組比較，P<0.05；△:與TPC組比較，P>0.05

組別Bcl-2PI(%)NF-κBPI(%)SO12.99±3.2110.15±4.42IR11.45±11.9768.33±6.07*TPC60.99±6.30*#32.80±5.30*#IPC62.30±9.20*#△31.56±4.85*#△

*:與SO組比較，P<0.05；#:與IR組比較，P<0.05；△:與TPC組比較，P>0.05

2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)

凋亡細(xì)胞在SO組罕見，IR組、IPC組和TPC組都有明顯增加。凋亡指數(shù)(AI)在IR組(9.48±2.42)、IPC組(4.36±0.88)和TPC組(4.94±2.04)，與SO組(1.29±2.67)比較，P<0.05差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中IR組AI增加最明顯，與IPC組、TPC組比較，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IPC組與TPC組比較，P>0.05差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

肝臟IRI是多種因素以時(shí)間為順序先后作用的結(jié)果，細(xì)胞因子在肝臟IRI中有重要作用，其中TNF-α的作用，尤為重要[2-6]。TNF-α在肝臟IR過程中介導(dǎo)了導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的多形核粒細(xì)胞浸潤(rùn)、釋放ROS、TNF-α和多種蛋白酶,以及激活枯否細(xì)胞，并誘導(dǎo)枯否細(xì)胞釋放ROS和 TNF-α，導(dǎo)致更多多形核粒細(xì)胞浸潤(rùn)，加重肝細(xì)胞損傷[2]。核因子kappa-B(NF-κB)是一個(gè)多種基因的快速反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子,在肝臟IRI發(fā)揮調(diào)解中心的作用[2]。IPC能減輕大鼠肝臟IRI，與抑制核因子NF-κB在肝組織中的表達(dá)，減少細(xì)胞因子、活性氧和氮化物、鈣、補(bǔ)體等的表達(dá)有關(guān)[1]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝臟在遭受缺血30 min，再灌注后發(fā)生了明確的再灌注損傷，采用TNF-α預(yù)處理后，明顯的減輕了肝臟IRI。TNF-α預(yù)處理后，抑制了NF-κB p65蛋白表達(dá)。NF-κB p65蛋白高表達(dá)與肝臟IRI嚴(yán)重程度密切相關(guān)，NF-κB p65蛋白表達(dá)被抑制，則肝臟IRI減輕[1，6-7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TNF-α預(yù)處理抑制了NF-κB p65蛋白表達(dá)，減輕了肝臟IRI。

在肝臟IRI中，肝臟細(xì)胞大量死亡和凋亡，凋亡和死亡的比例，與肝臟IRI嚴(yán)重程度并不成比例關(guān)系，而與肝臟細(xì)胞脂肪含量有關(guān)[2]。在肝臟IR過程中，TNF-α可激活凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞凋亡，加重肝臟IRI[2]。但TNF-α預(yù)處理可以減少肝臟細(xì)胞凋亡[8]。減少肝臟細(xì)胞凋亡可以減輕肝臟IRI，IPC能減少肝臟IRI過程中肝臟細(xì)胞凋亡，從而減輕大鼠肝臟IRI[1，9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TNF-α預(yù)處理后，在隨后的IR階段，大鼠肝臟細(xì)胞AI明顯低于IR組，而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增高，顯著高于IR組。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，TNF-α不但激活了凋亡誘導(dǎo)基因的表達(dá)，也激活了凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)，TNF-α預(yù)處理后，在隨后的IR過程中，Bcl-2高表達(dá)，抑制了IR后大鼠肝臟細(xì)胞凋亡。以及激活凋亡抑制基因Bcl-2，減少肝臟RI導(dǎo)致的肝細(xì)胞凋亡。

兩種方法的預(yù)處理(TNF-α預(yù)處理和IPC)，無論血清酶學(xué)檢查，還是肝細(xì)胞壞死、凋亡檢查角度上分析，對(duì)減輕肝臟IRI的程度上沒有顯著差別。兩種方法的預(yù)處理抑制NF-κB p65蛋白表達(dá)程度相似，在激活凋亡抑制基因Bcl-2表達(dá)程度上亦相似。

綜上所述，TNF-α預(yù)處理對(duì)大鼠肝臟RI造成的肝損傷有保護(hù)作用[8]，與IPC效果相似。TNF-α預(yù)處理通過抑制NF-κB p65蛋白表達(dá)、激活凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表達(dá)，減輕了IR后大鼠肝臟IRI。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Zhang WX,Yin W,Zhang L,et al.Precondioning and postconditioning reduce hepatic ischemia-reperfusion injury in rats[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2009,8(6):586-590.

[2] Montalvo-Jave EE,Escalante-Tattersfield T,Ortega-Salgado JA,et al.Factors in the pathophysiology of the liver ischemia-reperfusion injury[J].Surg Res,2008，147(1):153-159.

[3] 白麗,任鋒,鄭素軍,等.抑制PTEN對(duì)小鼠肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制[J].中華肝臟病雜志,2014,22(6):451-455.

[4] 任鋒,張海燕,樸正福,等.抑制糖原合成酶激酶3活性對(duì)Toll樣受體4介導(dǎo)肝臟炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用[J].中華肝臟病雜志,2012,20(9):693-697.

[5] Gao Z,Li YH.Antioxidant Stress and Anti-Inflammation of PPARα on Warm Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury[J].PPAR Res,2012,12:738-785.

[6] Jaeschke H,Woolbright BL.Role of heme oxygenase 1 in TNF/TNF receptor-mediated apoptosis after hepaticischemia/reperfusion in rats[J].Shock,2013,40(1):75-6.

[7] Arii S,Monden K,Adachi Y,et al.Pathogenic role of Kupffer cell activation in the reperfusion injury of cold-preserved liver[J].Transplantation,1994,58(10):1072-1077.

[8] Feng M,Wang Q,Wang H,et al.Tumor necrosis factor-alpha preconditioning attenuates liver ischemia/reperfusion injury through preserving sarco/endoplasmic reticulum calcium-ATPase function[J].J Surg Res,2013,184(2):1109-1113.

[9] 張智勇,盧綺萍,陳孝平.丹參預(yù)處理對(duì)肝臟缺血再灌注后胃腸激素的影響[J].中華消化外科雜志,2014,13(3):213-217.

(編輯：左艷芳)

Effect of tumor necrosis factor-alpha preconditioning and ischemic preconditioning on hepatic ischemia-reperfusion injury in rats

GUO Huai-bin1，ZHAO Yan2，LIU Feng1，YUE Li-hui3,ZHANG Wan-xing1(1.Department of General Surgery,Hebei Provincial General Hospital，Shijiazhuang Hebei 050051，China;2.Infrastructure Department,Hebei Provincial General Hospital，Shijiazhuang Hebei 050051，China;3.Department of Anesthesiology,Hebei Provincial General Hospital，Shijiazhuang Hebei 050051，China)

Abstract:ObjectiveTo compare the effect of TNF-α preconditioning and ischemic preconditioning on hepatic ischemia-reperfusion injury (IRI) and investigate the underlying mechanisms of TNF-α preconditioning. MethodsFourty healthy male Wistar rats were randomly divided into four groups which were Sham-operated group (SO),ischemia-reperfusion group (IR group:produced by total inflow occlusion for 30 min),ischemic preconditioning group (IPC group:induce with 10 min hepatic ischemic and open 10 min before IR) and TNF-α preconditioning group (TPC group:intraperitoneal injection with 1 μg/kg TNF-a 30 min prior to IR).The sample of blood and hepatic tissue of all groups were taken after experiment.The protein levels of NF-κBp65 and Bcl-2 in the hepatic tissue were detected by immunohistochemistry. ResultsThere was significant difference (P<0.05) between IR group and IPC group,TPC group on the level of ALT,AST and the xpression of NF-κBp65 and Bcl-2,apoptosis index in hepatic tissue.There was no significance difference (P>0.05) between IPC group and TPC group. ConclusionTNF-α preconditioning decreased the intensity of hepatic IRI,just as ischemic preconditioning,by induces an decrease in the NF-κBp65 expression and an increase in the Bcl-2 expression.

Keywords:liver;ischemia-reperfusion injury;TNF-α;ischemic preconditioning

[收稿日期]2014-09-29[修回日期] 2014-10-24

doi:10.11659/jjssx.09E014026

[中圖分類號(hào)]R36；R657.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1672-5042(2015)01-0070-03