條石鯛mPRα基因的cDNA克隆和表達(dá)模式分析*

史 寶 柳學(xué)周① 陳圣毅, 徐永江 臧 坤, 李曉妮

(1. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

孕激素參與調(diào)控生物體內(nèi)的多種生理生化過程,包括生殖、 發(fā)育、 細(xì)胞增殖和腦部功能等(Tsai et al,1994)。孕激素、促黃體激素和成熟促進(jìn)因子共同作用下硬骨魚類卵母細(xì)胞成熟(Nagahama et al, 2008)。孕激素結(jié)合膜孕激素受體(Membrane progestin receptor, mPR), 進(jìn)而激活成熟促進(jìn)因子促使卵母細(xì)胞成熟(Thomas et al, 2004)。近年來, 在脊椎動(dòng)物包括硬骨魚類發(fā)現(xiàn)膜孕激素受體的三種亞型 mPRα、mPRβ、mPRγ(Zhu et al, 2003; Kazeto et al, 2005a)。在斑馬魚, 發(fā)現(xiàn)mPRα和mPRβ在卵母細(xì)胞發(fā)育的早期的轉(zhuǎn)錄水平較低, 在卵黃生成階段轉(zhuǎn)錄水平逐漸增加(Kazeto et al, 2005b)。而且, 顯微注射 mPRα和mPRβ的反義寡核苷酸探針能夠有效地抑止斑馬魚、金魚和蟾蜍卵母細(xì)胞對(duì)孕激素的應(yīng)答(Ben-Yehoshua et al, 2007; Tokumoto et al, 2012)。這些研究說明膜孕激素受體參與調(diào)控孕激素誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟。

條石鯛(Oplegnathidae fasciatus)在黃海、東海和臺(tái)灣沿海等海域均有分布, 其肉質(zhì)細(xì)嫩, 具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(張春霖等, 1955)。條石鯛適合網(wǎng)箱、工廠化等多種養(yǎng)殖模式, 是一種理想的增養(yǎng)殖魚種。近年來, 有關(guān)條石鯛的繁殖生物學(xué)和人工繁育、養(yǎng)殖技術(shù)研究已有一些報(bào)道(劉偉成等, 2008; 柳學(xué)周等, 2008;孫中之等, 2009; 張鳳萍等, 2010; He et al, 2011; 彭志蘭等, 2013), 促進(jìn)了條石鯛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展, 但是關(guān)于條石鯛繁殖內(nèi)分泌學(xué)方面的研究報(bào)道并不多見,不利于建立穩(wěn)定的生殖調(diào)控技術(shù)。本研究對(duì)條石鯛的mPRα基因進(jìn)行了克隆, 并對(duì)其在雌體各組織及其卵巢發(fā)育不同階段表達(dá)譜進(jìn)行了分析, 初步探討 mPRα在卵巢發(fā)育成熟中的作用以及與性類固醇激素的關(guān)系; 旨在查明mPRα在條石鯛卵母細(xì)胞成熟過程的作用機(jī)制提供理論依據(jù), 并為條石鯛的繁殖調(diào)控提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

條石鯛取自青島忠海水產(chǎn)有限公司(2012年4—12月), 共取16尾人工培育的 3齡以上性成熟的條石鯛雌魚(全長(zhǎng) 27.23—31.11 cm, 體重 478.2—671.7 kg)。條石鯛培育水溫 15 —26 °C, 鹽度 28—32,pH 8.0—8.2, 溶解氧6 mg/L以上, 日換水率300%—500%。在條石鯛親魚繁殖周期取樣, 每次取樣4尾。實(shí)驗(yàn)魚用MS222(200 mg/L)麻醉后解剖, 取其腦、垂體、肝臟、心臟、卵巢、胃、幽門盲囊、腸、脾臟、腎臟、鰓、肌肉組織快速投入液氮中, 然后轉(zhuǎn)入–80°C冰箱保存, 用于總 RNA的提取。同時(shí), 用 Davidson固定液固定部分卵巢組織, 24h后轉(zhuǎn)入70%的酒精保存, 用于組織學(xué)觀察, 確定性腺發(fā)育時(shí)期。

1.2 卵巢的組織切片與觀察

卵巢組織固定后切取小塊組織, 通過梯度酒精(100%—70%)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋, 利用LEICA RM 2235型切片機(jī)連續(xù)切片, 切成6 μm切片,采用蘇木精-曙紅(H.E)染色, 中性樹膠封片, 在NIKON 90i顯微鏡下觀察及顯微攝影。卵巢各發(fā)育期的確定參考劉筠對(duì)鯉科魚類性腺分期的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行(劉筠, 1993)。

1.3 RNA提取和cDNA 合成

利用RNAiso Plus (TaKaRa)從垂體、心臟、卵巢等12個(gè)組織中提取總RNA。利用超微量紫外檢測(cè)儀(Nanodrop 2000D)檢測(cè)總RNA的純度和濃度, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量。以條石鯛卵巢中總RNA為模板, 根據(jù)PrimeScript?RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)中的操作說明反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA并用于后續(xù)克隆。

1.4 條石鯛mPRα基因 cDNA序列克隆

使用F/R引物(表1)擴(kuò)增mPRα保守序列, PCR擴(kuò)增體系為 cDNA2 μL, PCR Buffer 2.5μL, dNTP 0.5μL,Taq酶 0.2μL, 補(bǔ)無菌水至 20μL。PCR反應(yīng)條件為:94°C 5min, (94°C 30s, 57.7°C 30s, 72°C 50s)共 30 個(gè)循環(huán), 最后72°C延伸10min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)、切膠回收、純化后連接到pEASY-T1載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司)上并轉(zhuǎn)移至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)中, 37 °C條件下振蕩培養(yǎng)12h, 篩選陽性克隆菌株送至華大基因公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行分析比對(duì)。

以垂體總RNA為模板, 根據(jù)Clontech SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)中的操作說明分別合成5'-cDNA和3'-cDNA。然后分別以5'-cDNA和3'-cDNA為模板, 以GSP5和GSP3為引物(表1), 根據(jù)Smart RACE Advantage 2 PCR 試劑盒(Clontech)中的操作說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR條件: 94 °C 30s; 68 °C 30s, 15 個(gè)循環(huán), Tm每個(gè)循環(huán)降低 0.5 °C, 72 °C 延伸 2 min; 然后 94 °C 30s, 60 °C 30 s,72 °C 60s, 28個(gè)循環(huán)。 將第一次PCR產(chǎn)物稀釋40倍后作為模板, 分別以NGSP5和NGSP3為引物進(jìn)行巣式PCR, PCR條件同第一次PCR。用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè) PCR產(chǎn)物。然后切膠回收、連接轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆并測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用引物及其序列Tab.1 Sequences of the primers used for PCR analysis

1.5 序列分析

測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中利用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行同源性比對(duì)。利用DNAstar軟件進(jìn)行序列拼接、預(yù)測(cè)蛋白分子量和等電點(diǎn); 利用ExPASy中的Translate Tool進(jìn)行氨基酸序列翻譯; 利用 SignalP 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalP/)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè); 利用 Clustal X進(jìn)行氨基酸同源性比較; 利用MEGA 5.0中的Neighborjoining法(自展值為 1000)做進(jìn)化分析; 利用 SOPMA(http://npsa-devel.ibcp.fr/NPSA/npsa-sopma.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè); 利用 I-TASSE(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。參與序列比對(duì)和進(jìn)化分析的mPRα序列均來自 GenBank(表 2)。

表2 mPRα同源性比較與進(jìn)化樹中所用的魚種及其基因登錄號(hào)Tab.2 GenBank accession number of mPRα used for homologue and phylogenesis analyses

1.6 條石鯛 mPRα mRNA的組織表達(dá)與繁殖周期表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法(Mastercycler?Eprealplex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀)檢測(cè)mPRα mRNA在條石鯛不同組織中的相對(duì)表達(dá)量和卵巢發(fā)育不同時(shí)期中腦-垂體-卵巢組織中的表達(dá)水平變化。設(shè)計(jì)特異性引物Q-F1/R1, 以Q-β-actin-F/R為內(nèi)參引物(表1), 用SYBR GreenⅡ熒光染料(TaKaRa)進(jìn)行熒光定量檢測(cè), 用比較閾值法測(cè)定不同組織的相對(duì)表達(dá)量。每種組織取3尾魚, 每尾魚設(shè)定3個(gè)平行。以各組織RNA為模板,根據(jù) PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)中的操作說明合成 cDNA。Real-time PCR 程序: 95 °C 30s; 95 °C 5s; 63.5 °C 28s,共 40個(gè)循環(huán), 反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析。根據(jù)Ct值計(jì)算引物的擴(kuò)增效率和溶解曲線的分析, 以確定引物和擴(kuò)增參數(shù)是否達(dá)到進(jìn)行熒光定量檢測(cè)組織相對(duì)表達(dá)量的要求(0.8＜E＜1.2, R2＞0.98)。

1.7 性類固醇激素的測(cè)定

采用125I放射免疫測(cè)定方法(RIA)(FJ-2008PSγ放射免疫計(jì)數(shù))對(duì)條石鯛卵巢不同發(fā)育階段血清中雌激素(E2)的含量進(jìn)行測(cè)定。試劑盒購(gòu)于天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司, 根據(jù)試劑盒中的操作說明先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線, 待標(biāo)準(zhǔn)曲線制作好后(相關(guān)系數(shù)R＞ 0.9999)再上樣, 每次上樣時(shí)都選擇雙管平行上樣, 每個(gè)樣品重復(fù)3次。測(cè)定的精密度在批次內(nèi)為7.7%, 批次間為8.9%。測(cè)定的靈敏度為2.1 pg/mL。

1.8 數(shù)據(jù)處理

基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用相對(duì)定量的 2–ΔΔCT方法(Livak et al, 2001)計(jì)算處理后, 再用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和顯著性檢驗(yàn)分析(P＜0.05)。相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE), 并制成柱狀圖。雌激素測(cè)定數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE), 采用單因素方差分析并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 條石鯛卵巢組織學(xué)

對(duì)16尾條石鯛卵巢組織切片的H.E染色結(jié)果進(jìn)行分析, 采用卵巢切面中平均面積超過 50%或居最高比例的卵母細(xì)胞的時(shí)相來確定性腺的發(fā)育時(shí)期。對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行分析, 將采集的卵巢組織樣本分為4個(gè)期: Ⅲ期卵巢, Ⅳ期卵巢, Ⅴ期卵巢和Ⅵ期卵巢(圖1);每個(gè)性腺發(fā)育期對(duì)應(yīng)4尾雌魚。組織切片觀察, Ⅲ期卵巢以Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞為主, 卵母細(xì)胞多為圓形, 細(xì)胞核嗜堿性, 核仁多靠核膜分布(圖 1a)。進(jìn)入Ⅳ期,條石鯛的卵母細(xì)胞隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷積累, 細(xì)胞體積繼續(xù)增大, 胞質(zhì)中儲(chǔ)存著大量卵黃顆粒和油球,卵母細(xì)胞外有兩層濾泡細(xì)胞(圖1b)。卵巢發(fā)育進(jìn)入Ⅴ期, 卵母細(xì)胞呈圓球形, 卵黃顆粒的大量積累和融合,核仁消失(圖 1c)。進(jìn)入Ⅵ期, 卵巢萎縮, 卵巢壁上的平滑肌纖維松弛, 卵黃顆粒顏色暗淡(圖1d)。

2.2 條石鯛mPRα的序列分析和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

獲得的條石鯛 mPRα 的 cDNA 序列全長(zhǎng)為1222bp, ORF長(zhǎng)1060bp, 編碼了353個(gè)氨基酸, 其中第 1—16個(gè)氨基酸為信號(hào)肽, 在其序列含有 13個(gè)保守的半胱氨酸(Cys), 分別位于第35、189、192、193、221、234、239、262、263、274、291、330、331 氨基酸殘基處(圖2)。該蛋白的預(yù)測(cè)分子量為40.68 kDa,預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為7.08。

通過SOPMA軟件對(duì)mPRα的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè), 結(jié)果表明mPRα蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中, 圖中藍(lán)色代表的 α-螺旋占 55.97%, 綠色代表的 β-轉(zhuǎn)角占1.99%, 紫色代表的無規(guī)則卷曲占 28.98%, 紅色代表的延伸鏈占13.07%(圖3)。通過I-TASSER軟件預(yù)測(cè)了條石鯛 mPRα蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu), 結(jié)果表明在其蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果中存在著多個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)(圖4)。

圖1 條石鯛卵巢發(fā)育不同時(shí)期的形態(tài)特征Fig.1 The morphological characteristicsin ovarian development stages of O. fasciatus

圖2 條石鯛mPRα cDNA全長(zhǎng)以及推斷的氨基酸序列Fig.2 The cDNA sequence and its deduced amino acid sequence of mPRα from O. fasciatus

2.3 條石鯛 mPRα氨基酸的同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將條石鯛mPRα的氨基酸序列與其它物種mPRα的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析, 結(jié)果表明: 其與云紋犬牙石首魚(Cynoscion nebulosus)同源性為 98%; 與大西洋絨須石首魚(Micropogonias undulatus)的同源性為97%; 與羅非魚(Oreochromis niloticus)的同源性為 95%; 與半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)的同源性為94%; 與漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)的同源性為93%; 與青鳉(Oryzias latipes)的同源性為91%;與金魚(Carassius auratus)的同源性為 81%; 與斑馬魚(Danio rerio)的同源性為 80%; 與豬(Sus scrofa)的同源性為54%; 與牛(Bos taurus)的同源性為54%; 與家鼠(Mus musculus)的同源性為 53%; 與人(Homo sapiens)的同源性為 54%。同源性比較還發(fā)現(xiàn), 在條石鯛的mPRα 中存在著7個(gè)保守的跨膜區(qū)域(圖5)。通過MEGA5.0軟件中的Neighbor-joining法(置信度檢驗(yàn) 1000次)構(gòu)建了條石鯛 mPRα氨基酸序列的 NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明: 條石鯛mPRα與硬骨魚類構(gòu)成一個(gè)大分支; 與鱸形目魚類的親緣關(guān)系較近, 與云紋犬牙石首魚和大西洋絨須石首魚聚為一個(gè)小分支(圖 6)。

圖3 條石鯛mPRα蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析Fig.3 Secondary structure of O. fasciatus mPRα protein

圖4 條石鯛mPRα蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析Fig.4 Tertiary structure of O. fasciatus mPRα protein

2.4 mPRα mRNA在不同組織中的表達(dá)分布

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法, 以β-actin基因?yàn)閰⒄? 檢測(cè)條石鯛mPRα mRNA在條石鯛不同組織中的表達(dá)分布。結(jié)果表明: mPRα 在被檢測(cè)的13個(gè)組織中均有表達(dá), 其中在腦中的表達(dá)量最高, 其次是性腺和垂體。統(tǒng)計(jì)分析表明: mPRα mRNA在腦和性腺中的表達(dá)量與其它組織差異極顯著(P＜0.01); 而在垂體、脾臟、頭腎、鰓、胃、肝臟、幽門盲囊、腸、心、腎和肌肉中的表達(dá)量差異不顯著 (P＞0.05) (圖7)。

2.5 mPRα mRNA在卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)了mPRα mRNA在條石鯛卵巢不同發(fā)育時(shí)期的腦-垂體-卵巢中的相對(duì)表達(dá)水平。與垂體和卵巢相比, 腦中的mPRα mRNA在卵巢發(fā)育各個(gè)時(shí)期都有較高的表達(dá)水平。由SPSS16.0軟件顯著性檢驗(yàn)分析得出, mPRα mRNA在各繁殖周期腦、垂體、卵巢組織的表達(dá)水平差異顯著(P＜0.05)。

在繁殖周期腦組織中, mPRα mRNA的表達(dá)量在卵巢發(fā)育的Ⅲ—Ⅳ期逐漸上升, 到Ⅳ期時(shí)達(dá)到最大值(P＜0.05), 在Ⅴ期又急劇降低, 達(dá)到最小值, 然后在Ⅵ期時(shí)開始回升(圖 8a)。在繁殖周期垂體組織中,mPRα mRNA的表達(dá)量在卵巢發(fā)育的Ⅲ—Ⅳ期逐漸上升, 到Ⅳ期時(shí)達(dá)到峰值(P＜0.05), 在Ⅴ期又急劇降低, 達(dá)到最低值, 然后在Ⅵ期時(shí)開始回升(圖 8b)。在繁殖周期卵巢組織中, mPRα mRNA的表達(dá)量在卵巢發(fā)育的Ⅲ—Ⅴ期急劇上升, 到Ⅴ期時(shí)達(dá)到最大值(P＜0.05), 在Ⅵ期又急劇下降(圖8c)。

2.6 雌二醇在條石鯛卵巢發(fā)育不同時(shí)期的含量變化

利用放射免疫測(cè)定方法(RIA)檢測(cè)了血清中雌二醇(E2)在條石鯛卵巢發(fā)育不同時(shí)期的含量變化。結(jié)果表明: 條石鯛血清中 E2的含量在卵巢發(fā)育的各個(gè)時(shí)期差異顯著(P＜0.05)(圖9)。E2在卵巢發(fā)育的Ⅲ—Ⅳ期急劇上升, 并在Ⅳ期達(dá)到最大值(P＜0.05), 之后其含量開始下降, 并在Ⅵ期達(dá)到最小值。表明條石鯛血清雌二醇的濃度變化與卵巢的發(fā)育相關(guān)。

3 討論

本研究利用 RACE等方法首次從條石鯛卵巢中獲得mPRα 的cDNA全長(zhǎng)序列, 推導(dǎo)的mPRα蛋白序列含353個(gè)氨基酸。通過氨基酸序列分析, 在其成熟肽序列中存在 13個(gè)保守的半胱氨酸, 在其二級(jí)結(jié)構(gòu)中有7個(gè)跨膜區(qū)域; 在結(jié)構(gòu)上與其它脊椎動(dòng)物mPRα具有很高的保守性。同源性比較表明, 條石鯛的mPRα與硬骨魚類的mPRα同源性比較高(80%—98%),與哺乳動(dòng)物 mPRα的同源性較低(53%—54%)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明, 條石鯛與同為鱸形目的云紋犬牙石首魚和大西洋絨須石首魚聚為一個(gè)小分支, 與其它硬骨魚類聚為一個(gè)大分支, 說明在長(zhǎng)期進(jìn)化的過程中它們的親緣關(guān)系比較接近。

圖5 條石鯛mPRα氨基酸序列與其它物種mPRα氨基酸序列的比較Fig.5 Amino acid sequence alignment of mPRα from O. fasciatus with other fishes

圖6 條石鯛mPRα氨基酸序列與其它脊椎動(dòng)物mPRα的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of mPRα from O. fasciatus and other known vertebrates

圖7 條石鯛mPRα mRNA在不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平Fig.7 The relative expression level of mPRα mRNA in various tissues of O. fasciatus

圖8 mPRα mRNA在條石鯛卵巢不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 The relative expression of mPRα mRNA in ovarian development stage of O. fasciatus

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)了mPRα mRNA在條石鯛的組織表達(dá)特征, 結(jié)果表明mPRα mRNA在腦組織的表達(dá)量最高, 其次是在卵巢組織, 而垂體組織中mPRα mRNA相對(duì)表達(dá)水平低于前二者; 這與斑點(diǎn)叉尾(Ictalurus punctatus) mPRα mRNA組織表達(dá)特征相似之處, 但是斑點(diǎn)叉尾垂體組織的 mPRα mRNA相對(duì)表達(dá)水平要高于卵巢組織(Kazeto et al,2005a)。Hanna等(2009)通過免疫組化技術(shù)對(duì)模式生物斑馬魚的垂體和卵巢中 mPRα的細(xì)胞表達(dá)定位進(jìn)行檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)mPRα主要分布于卵母細(xì)胞的細(xì)胞膜和濾泡細(xì)胞, 垂體內(nèi)mPRα在多種細(xì)胞內(nèi)分布。本研究首次在石鯛科魚類發(fā)現(xiàn) mPRα mRNA表達(dá)也具有廣泛性, 在被檢測(cè)的 13個(gè)組織中均有表達(dá)。Tubbs等(2010)在大西洋絨須石首魚發(fā)現(xiàn)mPRα mRNA組織表達(dá)具有廣泛性, 在腦、卵巢、精巢、心臟、肝臟、腸、肌肉、鰓、嗅上皮等組織中都有表達(dá)。在本研究中條石鯛mPRα mRNA廣泛表達(dá)模式與之相似。這些研究結(jié)果表明 mPRα在硬骨魚類多種組織介導(dǎo)孕激素的生理功能。關(guān)于mPRα在其它組織中具體的作用機(jī)制和生理作用需要深入研究, 這將有助于更加全面了解mPRα的調(diào)控機(jī)制。

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)了mPRα mRNA在條石鯛卵巢發(fā)育不同階段的表達(dá)水平變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在條石鯛繁殖周期, mPRα mRNA在腦組織中的表達(dá)水平始終高于卵巢和垂體; 而且在卵巢發(fā)育Ⅳ期時(shí)腦組織中mPRα mRNA達(dá)到最大值。在條石鯛繁殖周期, 垂體中的mPRα mRNA在Ⅳ期達(dá)到最大值, 而在Ⅴ急劇降低。條石鯛腦和垂體組織mPRα mRNA的繁殖周期表達(dá)模式相似, 說明孕激素在腦-垂體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng), 可以通過 mPRα的介導(dǎo)進(jìn)而調(diào)節(jié)繁殖活動(dòng)。在另一種重要海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類半滑舌鰨, 研究發(fā)現(xiàn)其腦和垂體組織的 mPRα mRNA的表達(dá)水平從卵巢發(fā)育的Ⅱ—Ⅳ期顯著升高(P＜0.05)并且在Ⅳ期時(shí)達(dá)到最高峰(李曉曉等, 2013)。在魚類神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)mPRα mRNA在繁殖周期各個(gè)階段均有表達(dá),一方面預(yù)示著mPRα生理功能重要性; 另一方面其作用機(jī)制并不清楚, 也體現(xiàn)出復(fù)雜性。在條石鯛繁殖周期, 卵巢組織中的mPRα mRNA在Ⅲ—Ⅴ期急劇上升,并在Ⅴ期達(dá)到最大值; 表明mPRα在卵巢發(fā)育、成熟的生理過程均發(fā)揮作用, 并在介導(dǎo)孕激素誘導(dǎo)卵母細(xì)胞的成熟過程起著重要的調(diào)控作用。Kazeto 等(2005b)采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾繁殖周期的mPRα mRNA在卵巢組織的表達(dá)變化, 發(fā)現(xiàn) mPRα mRNA在卵母細(xì)胞發(fā)育階段表達(dá)量開始升高, 在卵母細(xì)胞成熟階段表達(dá)量達(dá)到峰值。本研究結(jié)果與斑點(diǎn)叉尾mPRα基因周期表達(dá)模式相似。條石鯛血清中雌二醇含量在卵巢發(fā)育的Ⅲ—Ⅳ期急劇上升, 并在Ⅳ期達(dá)到最大值(P＜0.05), 之后其含量開始下降。Karteris等(2006)研究發(fā)現(xiàn)在人類子宮肌層, 雌二醇可以上調(diào)mPRα mRNA和蛋白水平。在本研究中卵巢從Ⅲ期發(fā)育到Ⅳ期過程中, 血清中雌二醇水平升高, 繁殖周期腦-垂體-卵巢中mPRα mRNA表達(dá)量也升高; 并且雌激素含量變化與繁殖周期腦-垂體中mPRα 基因表達(dá)變化相似; 但是在條石鯛卵巢成熟期, 血清中雌二醇水平降低而卵巢中mPRα mRNA達(dá)到周期中最高值, 推測(cè)此階段主要由mPRα介導(dǎo)孕酮激素誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟。真鯛(Pagrus major)血清中孕激素通過 ELISA測(cè)定發(fā)現(xiàn)在卵巢發(fā)育成熟期達(dá)到峰值(Otha et al, 2002), 該研究支持本實(shí)驗(yàn)的推測(cè)。在今后的研究中, 將進(jìn)一步分析條石鯛繁殖周期血清中孕酮激素與mPRα mRNA和蛋白水平變化關(guān)系, 揭示mPRα的作用機(jī)制。

圖9 雌二醇激素在條石鯛卵巢不同發(fā)育時(shí)期的含量變化Fig.9 The level of plasma estrogen in ovarian development stage of O. fasciatus

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