基于β-連環(huán)蛋白基因的分子標(biāo)記甄別海蜇(Rhopilema esculentum)和沙海蜇(Nemopilema nomurai)*

楊傲傲 朱 玲① 周春婭 楊 洪 駱曉蕊 劉春勝 莊志猛

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306; 2. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071)

海蜇(Rhopilema esculentum)和沙海蜇(Nemopilema nomurai)同屬于刺胞動(dòng)物門(Cnidaria)、缽水母綱(Scyphozoa)、根口水母目(Rhizostomeae)、根口水母科(Rhizostomatidae), 廣泛分布于西北太平洋沿岸海域, 在我國主要分布于東海北部和黃、渤海海域(董婧等, 2012)。海蜇隸屬于海蜇屬(Rhopilema), 目前作為國際公認(rèn)品質(zhì)最好的可食用大型水母, 具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。同時(shí), 海蜇也是我國重要海洋漁業(yè)捕撈、增養(yǎng)殖和放流對象(謝忠明等, 2004)。而沙海蜇屬于沙蜇屬(Nemopilema), 經(jīng)濟(jì)價(jià)值較低, 但是作為世界上最大的水母之一, 是我國近海暴發(fā)的主要大型災(zāi)害性水母(程家驊等, 2004)。近年來, 沙海蜇頻繁暴發(fā)于黃海海域及東海北部海域。沙海蜇的大量暴發(fā)性增殖, 一方面嚴(yán)重改變了自然海洋生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能, 另一方面也嚴(yán)重影響了其它海洋漁業(yè)資源產(chǎn)量以及正常的海洋漁業(yè)生產(chǎn), 而且對濱海旅游和工業(yè)活動(dòng)等都產(chǎn)生了重要影響(孫松等, 2012)。

海蜇和沙海蜇的生活史復(fù)雜, 從受精卵到成體,經(jīng)歷浮浪幼蟲、螅狀體、橫裂體、碟狀體和水母體五個(gè)發(fā)育階段, 不同發(fā)育階段之間個(gè)體形態(tài)、結(jié)構(gòu)差異顯著(董婧等, 2012)。已有的研究結(jié)果表明: 沙海蜇與海蜇的水母體階段可以根據(jù)傘徑大小、外傘表面特征和附屬器形態(tài)等直接用肉眼區(qū)分(洪惠馨, 2002)。但是在浮浪幼蟲、螅狀體、橫裂體和碟狀體階段, 海蜇和沙海蜇的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征極為相似, 幾乎難以區(qū)別。盡管孫明等(2010)在實(shí)驗(yàn)室條件下對沙海蜇與海蜇晚期碟狀體的形態(tài)特征進(jìn)行研究, 認(rèn)為可以通過比較生殖腺、胃絲和口腕等的細(xì)微形態(tài)差異進(jìn)行區(qū)分(孫明等, 2010)。但由于水母具有含水量多, 采集易破碎, 保存易變形、失真等特點(diǎn), 導(dǎo)致這種方法在野外采樣后難以應(yīng)用。

本文基于海蜇轉(zhuǎn)錄組454 GS FLX測序與PCR技術(shù), 在海蜇和沙海蜇中分別克隆了包含 EST-SSR和EST-SNP標(biāo)記的β-連環(huán)蛋白(β-catenin) 基因的目的片段, 并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析, 期望從分子水平上尋找一種簡單、準(zhǔn)確甄別海蜇和沙海蜇的分子標(biāo)記,為海蜇和沙海蜇種群的棲息地調(diào)查、資源量或潛在暴發(fā)量的評估奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 海蜇轉(zhuǎn)錄組 454 GS FLX測序與β-連環(huán)蛋白基因的篩選

在浙江杭州灣采集野生性成熟的海蜇, 立即運(yùn)回山東榮成養(yǎng)殖場進(jìn)行海蜇人工繁育。分別選取海蜇不同發(fā)育階段的個(gè)體(螅狀體、橫裂體、碟狀體和幼蟄)提取總RNA, 并等比例混合, 然后采用SMARTTMcDNA Library Construction (Clontech)試劑盒構(gòu)建海蜇cDNA文庫。由美國夏威夷大學(xué)的ASGPB實(shí)驗(yàn)小組利用 Roche Next Generation Sequencer GS FLX System (a.k.a. 454 Sequencer)進(jìn)行半板454 GS FLX測序。生物信息學(xué)分析后, 篩選與其它生物β-連環(huán)蛋白基因具有高度相似性的海蜇β-連環(huán)蛋白基因序列。

1.2 海蜇和沙海蜇樣品的采集與基因組DNA提取

海蜇和沙海蜇樣品分別采自青島沙子口和膠州灣。液氮保存返回實(shí)驗(yàn)室后, 采用酚-氯仿法提取基因組DNA: 每個(gè)個(gè)體分別取約200mg液氮保存的樣品進(jìn)行研磨, 研磨至粉末狀后, 立即加入 600μL的DNA提取液[其中Tris-HCl (pH 8.0) 100mmol/L, EDTA(pH 8.0) 100mmol/L, 1% SDS 50μL, 20mg/mL 蛋白酶K 8μL], 充分混勻, 55°C水浴 1—2h, 待組織充分裂解完全。加入等體積的酚-氯仿試劑[其中飽和酚、氯仿、異戊醇以體積比為25︰24︰1混合], 靜置10min,12000r/min離心10min, 除去上清。如此反復(fù)抽提三次。然后加入0.6體積的異丙醇靜置5min, 12000r/min離心 5min, 除去上清。加入 600μL已預(yù)冷的無水乙醇, 沉淀 DNA約 30min后, 70%乙醇洗滌沉淀兩次,自然干燥2min, 加入20μL超純水溶解。提取的DNA經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測。

1.3 海蜇和沙海蜇β-連環(huán)蛋白基因目的片段的克隆與測序

利用軟件SSRhunter 1.3 (http: //www.bio-soft.net/dna/SSRHunter.htm)識別海蜇β-連環(huán)蛋白基因序列中的微衛(wèi)星重復(fù)的位置和重復(fù)單位的形式。然后利用Primer Premier 5.00在微衛(wèi)星重復(fù)序列的兩翼設(shè)計(jì)一對特異性引物β-catenin-F1 (5'-TATCAAACCAGGC ATGTCCACC-3')和β-catenin-R1 (5'-GCCCAGACCT ACCAAGATGA A-3'), 分別擴(kuò)增海蜇和沙海蜇β-連環(huán)蛋白基因的目的片段。50μL的PCR反應(yīng)體系包括:5μL 10×PCR buffer, 4μL dNTP (25mmol/L), 3μL MgCl2(25mmol/L), 上下游引物各 2μL (10μmol/L),0.4μL (1U) DNA Taq 酶, 2μL DNA 模板, 31.6μL PCR水; PCR反應(yīng)條件為: 94°C預(yù)變性5min, 36個(gè)PCR循環(huán)(包括: 94°C變性45s, 53°C退火45s, 72°C延伸45s),最后 72°C總延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后, 用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物, 對目的片段進(jìn)行切膠回收后, 與 pMD18-T載體(TaKaRa)連接, 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(Top10)中。最后通過藍(lán)白斑篩選陽性克隆, 對陽性克隆送華大基因公司進(jìn)行測序(每個(gè)物種隨機(jī)選取10個(gè)體); 剩余PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.4 海蜇和沙海蜇β-連環(huán)蛋白基因片段的生物信息學(xué)分析

運(yùn)用 BLAST技術(shù)(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)和蛋白分析系統(tǒng)(http: //www.expasy.org/), 作者分析了海蜇β-連環(huán)蛋白基因的cDNA和氨基酸序列。用ClustalW (http: //www.ebi.ac.uk/clustalw/)對海蜇和沙海蜇群體的β-連環(huán)蛋白基因片段進(jìn)行多序列比對, 識別海蜇與沙海蜇的SSR特征序列和單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)。

1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳與圖譜分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過6%聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳55W, 2.5h, 然后銀染, 顯色, 拍照, 根據(jù)DNA長度標(biāo)準(zhǔn) pBR322/MspI, 確定等位基因的長度范圍。采用Genepop 4.0統(tǒng)計(jì)等位基因數(shù), 計(jì)算表觀雜合度和期望雜合度, 進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡背離測試, 并進(jìn)行成對標(biāo)記間連鎖不平衡測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 海蜇β-連環(huán)蛋白基因的篩選與同源性分析

生物信息學(xué)分析表明, 在半板海蜇454 GS FLX轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中, 共有7個(gè)Est序列與其它生物β-連環(huán)蛋白基因具有高度相似性。將上述 EST序列拼接后, 共獲得長1833 bp的海蜇β-連環(huán)蛋白基因片段。推導(dǎo)的氨基酸序列經(jīng) BLAST分析發(fā)現(xiàn), 海蜇β-連環(huán)蛋白基因片段與來自刺胞動(dòng)物門的 Hydractinia echinata (ACZ51403)、Podocoryna carnea (ABI74628)、Hydra magnipapillata (AFI99111)和Hydra vulgaris(AAQ02885)的β-連環(huán)蛋白基因具有很高的同源性,其氨基酸序列一致性高達(dá) 84%—89%。與長牡蠣Crassostrea gigas (AFL93714)、海鞘 Ciona savignyi(BAA32789)和 文 昌 魚 Branchiostoma floridae(BAD12593)的氨基酸序列一致性也分別高達(dá) 79%、78%和82%。

2.2 海蜇β-連環(huán)蛋白基因微衛(wèi)星篩選與PCR擴(kuò)增

利用軟件 SSRhunter 1.3搜索拼接后的海蜇β-連環(huán)蛋白基因片段, 在序列 342—360bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)微衛(wèi)星序列, 其重復(fù)單位為(TGC)6。分別以海蜇和沙海蜇的基因組 DNA為模板, 用海蜇β-連環(huán)蛋白基因片段的一對特異性引物β-catenin-F1和β-catenin-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序, 結(jié)果顯示: 10個(gè)海蜇個(gè)體的β-連環(huán)蛋白基因擴(kuò)增片段的大小分別為166bp和169bp, 其中169bp與已知的β-連環(huán)蛋白cDNA序列的大小相同,表明擴(kuò)增的目標(biāo)片段中沒有內(nèi)含子存在。而10個(gè)沙海蜇個(gè)體的β-連環(huán)蛋白基因擴(kuò)增片段的大小分別為157bp和160bp。

2.3 海蜇和沙海蜇β-連環(huán)蛋白基因目的片段特征分子標(biāo)記分析

海蜇和沙海蜇β-連環(huán)蛋白基因的目的片段核苷酸多序列比對見圖1。比對結(jié)果顯示, β-連環(huán)蛋白基因在海蜇和沙海蜇中是高度保守的, 海蜇個(gè)體β-連環(huán)蛋白基因目的序列之間, 除了微衛(wèi)星重復(fù)差異外, 只有一個(gè)堿基的差異; 而沙海蜇個(gè)體之間除了微衛(wèi)星重復(fù)差異外, 其余完全一致。海蜇和沙海蜇的β-連環(huán)蛋白基因目的片段之間, 在相同位置上都存在微衛(wèi)星重復(fù), 但所包含的微衛(wèi)星重復(fù)單元截然不同, 海蜇為:(TGC)4-6(TGT)1-2(TGC)4-5, 而海蜇為(TGT)5-6。除此之外,海蜇和沙海蜇的β-連環(huán)蛋白基因目的片段之間還存在 14個(gè)能夠甄別兩物種的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn), 分別為: (T/C)1, (T/C)2, (C/T)3, (C/T)4, (C/T)5, (T/G)6,(G/C)7, (T/G)8, (A/G)9, (C/T)10, (G/A)11, (A/G)12,(C/T)13, (A/T)14。

表1 海蜇和沙海蜇β-連環(huán)蛋白基因的多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)的特征Tab.1 Characteristics of SSR from β-catienin in R. esculentum and N. nomurai

2.4 微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性分析

根據(jù) DNA長度標(biāo)準(zhǔn) pBR322/MspI, 在聚丙烯酰胺凝膠上, 海蜇和沙海蜇群體的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度主要分布在166 bp和160 bp, 見圖2。遺傳學(xué)分析顯示: 該位點(diǎn)在海蜇和沙海蜇群體中的期望雜合度分別為 0.4998和 0.7482, 表觀雜合度分別為 0.5208和0.7083, 等位基因數(shù)均為2。通過哈迪-溫伯格平衡背離測試, Bonferroni校正后均未發(fā)現(xiàn)偏離現(xiàn)象(表1)。

3 討論

隨著分子生物技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展,利用DNA分子標(biāo)記對海蜇與沙海蜇進(jìn)行物種鑒定、探討物種分類地位及種間親緣關(guān)系已經(jīng)成為傳統(tǒng)分類學(xué)的重要輔助手段。劉敏等(2010, 2011)分別利用18S rDNA序列和COI序列對東黃海沙海蜇與口冠水母分類關(guān)系進(jìn)來了辨析, 認(rèn)為東黃海野生沙海蜇與越前水母的親緣關(guān)系很近, 應(yīng)為同一物種, 與海蜇的親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 與口冠水母的關(guān)系更遠(yuǎn)。張姝等(2009)也利用16S rDNA和COI基因序列對海蜇和沙海蜇進(jìn)行了分子鑒定, 認(rèn)為線粒體基因作為分子標(biāo)記可能是解決水母幼體分類困擾的有效途徑之一。本研究在海蜇轉(zhuǎn)錄組454 GS FLX測序基礎(chǔ)上, 通過對EST序列的深度解析, 在β-連環(huán)蛋白基因序列中發(fā)掘出同時(shí)包含EST-SSR和EST-SNP兩種分子標(biāo)記的目的片段,只需要設(shè)計(jì)一對引物, 分別從海蜇和沙海蜇的基因組 DNA中擴(kuò)增出目的片段, 經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳即可進(jìn)行海蜇和沙海蜇的物種甄別。該方法不但簡單、快速、準(zhǔn)確, 同時(shí)也為EST-SSR和EST-SNP分子標(biāo)記在物種鑒定和親緣關(guān)系分析中的應(yīng)用提供了一種新思路。

基于EST序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記與從基因組開發(fā)的SSR標(biāo)記相比, 具有以下優(yōu)點(diǎn): a) EST-SSR是在已有的 EST序列中進(jìn)行篩選, 所以該開發(fā)過程不僅簡單, 成本也低; b) EST-SSR標(biāo)記通常來自較為保守的轉(zhuǎn)錄區(qū), 故而開發(fā)出的分子標(biāo)記在近緣物種間具有較高的通用性和可轉(zhuǎn)移性; c) EST-SSR 代表基因的編碼部分, 因此可作為功能基因的“絕對”的標(biāo)記, 也可用于直接鑒定一些決定重要表型性狀的等位基因; d) 通過序列同源性比對, 可以分析獲得EST-SSR標(biāo)記的某種可能功能(Scott et al, 2000;Areshehenkova et al, 2002)。本研究所獲得的β-連環(huán)蛋白基因分子標(biāo)記正是利用了 EST-SSR的這些優(yōu)點(diǎn)。β-連環(huán)蛋白作為 Wnt/β-catenin信號通路的核心成員,幾乎參與了生物體從胚胎到成體所有的發(fā)育過程(Peifer, 1997)。例如調(diào)控細(xì)胞的增殖和生長(Logan et al, 2004)、保障各種干細(xì)胞的功能(Willert et al, 2005)、參與細(xì)胞的分化(Prestwich et al, 2007)、控制胚胎早期發(fā)育(Klaus et al, 2008)等。通過對目前已在GenBank注冊的β-連環(huán)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn): 這個(gè)位于β-連環(huán)蛋白基因C末端的SSR重復(fù)序列僅存在于刺胞動(dòng)物海蜇、沙海蜇及 H. echinata(ACZ51403)中, 其它動(dòng)物類群均不存在。盡管目前尚不知道這個(gè)微衛(wèi)星序列對β-連環(huán)蛋白的生物功能的影響, 但越來越多證據(jù)表明, 位于編碼區(qū)的SSR序列或者直接影響基因編碼產(chǎn)物功能(Ellegren, 2000;Huang et al, 2002), 或者通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)(Bachtrog et al, 2000), 或者通過影響局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等發(fā)揮著重要作用(Dupuy et al, 2004)。已有研究表明, β-連環(huán)蛋白的C末端與核轉(zhuǎn)錄因子淋巴樣增強(qiáng)因子-1/T-細(xì)胞因子的結(jié)合, 形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,進(jìn)入細(xì)胞核后激活下游基因的表達(dá), 發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用(Kuhl et al, 2001), 因此推測該微衛(wèi)星序列可能通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá), 從而參與刺胞動(dòng)物的發(fā)育過程(Bachtrog et al, 2000)。

圖1 海蜇和沙海蜇β-連環(huán)蛋白基因目的片段的核苷酸多序列比對Fig.1 Multiple alignment of β-catienin target nucleotide sequences from R. esculentum and N. nomurai

圖2 海蜇和沙海蜇β-連環(huán)蛋白基因的多態(tài)微衛(wèi)星圖譜Fig.2 SSR profile from β-catienin in R. esculentum and N. nomurai populations

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