松楊柵銹菌無性發(fā)育階段組織學(xué)染色方法1)

于丹 曹支敏

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌，712100)

責(zé)任編輯:程 紅。

楊樹具有優(yōu)質(zhì)、速生、適應(yīng)性強(qiáng)、易改良遺傳等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛用于木材、造紙、包裝等多種行業(yè)，具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會、生態(tài)效益［1］。松楊柵銹菌(Melampsora larici-populina)是一種活體營養(yǎng)專性寄生真菌，必須從生活著的寄主細(xì)胞中獲得所需的營養(yǎng)物質(zhì)，才能正常生長和發(fā)育。該銹菌主要侵染青楊派、黑楊派及其雜交種的20 余種楊樹，在世界范圍內(nèi)引起楊樹葉銹病，嚴(yán)重危害幼苗和幼樹，降低其生長量從而造成重大經(jīng)濟(jì)損失［2－4］。由于活體專性寄生特性，目前，松楊柵銹菌仍不能離開寄主組織進(jìn)行培養(yǎng)。因此，利用組織病理學(xué)來研究該銹菌與寄主楊樹的互作關(guān)系對于闡明病原菌的致病機(jī)理和寄主的抗病機(jī)制則尤為重要。一些學(xué)者利用Bruzzese整葉透明法研究過松楊柵銹菌與寄主楊樹的互作關(guān)系［5－7］。本研究中筆者通過試驗(yàn)比較分析了熒光增白劑和偶聯(lián)Alexa 488 熒光素的小麥凝集素2 種熒光染色方法對松楊柵銹菌無性發(fā)育不同階段的染色效果，篩選出較理想的染色方法，從而為解析該銹菌與楊樹互作的分子機(jī)制提供有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和楊樹

供試菌種為松楊柵銹菌陜西渭河單孢菌系Wh03，由西北農(nóng)林科技大學(xué)森林病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。用太白楊(Populus purdomii)作為繁殖寄主在溫室人工擴(kuò)繁，參照曹支敏等［8］的方法進(jìn)行菌種的活化及保存。

供試楊樹為感病品種中林美荷(P.deltoids×P.nigra，歐美楊品種)，采自西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院苗圃［4］。

1.2 試驗(yàn)方法

接種培養(yǎng):3月份，采集中林美荷楊1年生的插條，盆栽于西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院溫室。5月份，選取生長狀態(tài)基本一致的楊樹健康葉片作為接種葉片，參照曹支敏等［8］的方法進(jìn)行接種。用1～2 g·L－1的Wh03 菌系夏孢子懸浮液進(jìn)行接種，以涂抹自來水的健康葉片作為對照。接種后置于保濕桶內(nèi)保濕36 h，然后放在18～24 ℃的溫室培養(yǎng)，于不同培養(yǎng)時(shí)間取樣進(jìn)行染色觀察。

熒光增白劑熒光染色方法:將接種的葉片切成小片，置于含有1.5 g·L－1三氯乙酸的V(乙醇)∶V(氯仿)= 3 ∶1 固定透明液中，更換透明液至不變色，然后將小片轉(zhuǎn)入飽和水合氯醛(2.5 g·mL－1)中至小片完全透明。參照康振生等［9］的方法，將透明好的樣品置于熒光增白劑染料(Sigma－Aldrich，St.Louis，MO，USA)中避光染色5 min，用50%甘油做浮載劑，將染色樣品轉(zhuǎn)入載玻片中蓋片封片，用OLYMPUS 熒光顯微鏡(BX52+DP72)觀察松楊柵銹菌的無性發(fā)育不同階段并拍照。

偶聯(lián)Alexa 488 熒光素的小麥凝集素染色方法:葉片的透明處理同熒光增白劑熒光染色方法。參照Ayliffe 等方法［10］并略作修改，用偶聯(lián)Alexa 488 熒光素的小麥凝集素(Wheat germ agglutinin－Alexa 488，Invitrogen，USA)避光處理20 min，用50%甘油做浮載劑，將染色樣品轉(zhuǎn)入載玻片中蓋片封片，用OLYMPUS 激光共聚焦顯微鏡(FV1000)觀察松楊柵銹病菌的無性發(fā)育不同階段并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光增白劑熒光染色

固定透明后的樣品經(jīng)熒光增白劑染色處理，在紫外光激發(fā)下菌體可產(chǎn)生藍(lán)色熒光，寄主組織同樣產(chǎn)生藍(lán)色熒光，因此呈現(xiàn)藍(lán)色背景(圖1)。借助這種染色方法可以較清楚地觀察到松楊柵銹菌的夏孢子、萌發(fā)的芽管、附著胞和氣孔下囊，但不易觀察到葉肉細(xì)胞間隙擴(kuò)展的侵染菌絲、吸器母細(xì)胞以及胞內(nèi)的吸器結(jié)構(gòu)(圖1)。

圖1 松楊柵銹菌無性發(fā)育階段的熒光增白劑熒光染色結(jié)果

2.2 偶聯(lián)Alexa 488 熒光素的小麥凝集素?zé)晒馊旧?/h3>

染色結(jié)果(圖2)表明，偶聯(lián)Alexa 488 熒光素的小麥凝集素與真菌細(xì)胞壁的特定組分結(jié)合，在一定條件激發(fā)下(激發(fā)光450～480 nm，發(fā)射光515 nm)菌體產(chǎn)生綠色熒光，而寄主組織不被染色，因此呈現(xiàn)出黑色背景，從而可明顯地區(qū)分菌體與寄主。利用該方法可以較清楚地觀察到松楊柵銹菌的夏孢子、萌發(fā)的芽管、附著胞、氣孔下囊、侵染菌絲、吸器母細(xì)胞及吸器等結(jié)構(gòu)。相比較熒光增白劑熒光染色方法，該方法更適用于染色觀察葉肉細(xì)胞間隙擴(kuò)展的侵染菌絲及伸入細(xì)胞內(nèi)的吸器。

3 結(jié)論與討論

熒光增白劑能夠特異性結(jié)合纖維素和幾丁質(zhì)等葡聚糖，因此，植物和真菌的細(xì)胞壁均能夠被染色［11］。所以，熒光增白劑染色處理后背景呈現(xiàn)類似的藍(lán)色熒光，這在一定程度上會影響觀察效果。本試驗(yàn)中熒光增白劑更適合于松楊柵銹菌侵染早期時(shí)的形態(tài)觀察，可以對萌發(fā)的夏孢子以及穿透氣孔后形成的氣孔下囊進(jìn)行觀察，對之后發(fā)育過程的觀察還存在一定的困難，即侵染菌絲、吸器母細(xì)胞及吸器等結(jié)構(gòu)的觀察效果不理想。相對偶聯(lián)Alexa 488 熒光素的小 麥凝集素染色方法，該方法有待于進(jìn)一步改進(jìn)。

圖2 松楊柵銹菌無性發(fā)育階段的偶聯(lián)Alexa 488 熒光素的小麥凝集素?zé)晒馊旧Y(jié)果

小麥凝集素能夠特異結(jié)合真菌細(xì)胞壁組分幾丁質(zhì)的成分N－乙酰氨基葡萄糖，因此該物質(zhì)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于真菌組織的染色觀察［10］。幾乎所有植物細(xì)胞壁中的多糖不含有N－乙酰氨基葡萄糖，因此被小麥凝集素染色處理后的植物組織不被染色。然而，也有研究表明小麥凝集素能夠與小麥籽粒的表皮細(xì)胞壁和馬鈴薯導(dǎo)管的第2 層細(xì)胞壁結(jié)合，表明N－乙酰氨基葡萄糖可能也存在于某些植物細(xì)胞壁內(nèi)部［12］。通過偶聯(lián)Alexa 488 熒光素的小麥凝集素染色，可以較全面地觀察到松楊柵銹菌在楊樹葉片中的不同發(fā)育階段，不受寄主組織顏色的干擾，而且重復(fù)性較強(qiáng)。因此，該方法是研究松楊柵銹病菌與寄主楊樹互作的一種可行的組織學(xué)病理學(xué)方法。

植物組織病理學(xué)研究是解析病原菌與寄主互作過程中病菌致病機(jī)理以及植物抗病機(jī)制的一種重要手段，熒光染色技術(shù)是其中一種研究方法。熒光增白劑染色方法和偶聯(lián)Alexa 488 熒光素的小麥凝集素染色方法在禾谷類銹菌研究中應(yīng)用較為廣泛［10，13－15］，然而目前尚未見報(bào)道使用這2 種染色方法觀察松楊柵銹菌與楊樹互作過程中病菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)。筆者通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)Alexa 488 熒光素的小麥凝集素染色方法可以較全面地觀察到松楊柵銹菌在楊樹葉片中的不同發(fā)育階段，從而為研究該銹菌與楊樹互作的分子機(jī)制以及病原菌致病分子機(jī)理提供了技術(shù)支持。

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