輔助型T細胞9對動脈粥樣硬化斑塊的影響

楊克平　張云峰　倪文瓊　許臣洪　李　欣

輔助型T細胞9對動脈粥樣硬化斑塊的影響

楊克平張云峰倪文瓊許臣洪李欣

【摘要】目的：探討輔助型T細胞9(Th9)對動脈粥樣硬化斑塊形成的影響。方法：8周齡載脂蛋白E基因敲除(apoE-/-)小鼠28只，4只用作制備Th9細胞，余24只分為四組：高脂喂養(yǎng)至12周齡組和16周齡組，Th9過繼組(尾靜脈注射Th9)和白細胞介素-9抗體(IL-9 Ab)組(尾靜脈注射IL-9 Ab)，每組6只。分別用流式細胞術及ELISA計數(shù)12周齡組和16周齡組小鼠外周血Th9細胞和檢測IL-9水平變化，同時HE染色觀察兩組腹主動脈斑塊面積及其與管腔面積的比值；16周時用相同方法檢測Th9過繼組和IL-9 Ab組上述指標，并行兩組腹主動脈CD68免疫組化(SP法)染色，比較CD68陽性細胞數(shù)量差異。結(jié)果：16周齡組小鼠外周血Th9細胞計數(shù)及IL-9水平均較12周齡組升高，腹主動脈斑塊面積和斑塊面積/管腔面積比值也增大，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與IL-9 Ab組比較，Th9過繼組外周血Th9細胞數(shù)量及IL-9濃度均上升，腹主動脈斑塊面積和斑塊面積/管腔面積比值明顯增大，斑塊內(nèi)CD68陽性細胞增多，纖維帽厚度變薄，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論：Th9細胞可能通過IL-9促進斑塊形成，并可能是斑塊不穩(wěn)定的重要因素。

【關鍵詞】輔助型T細胞9；白細胞介素-9；動脈粥樣硬化；apoE-/-小鼠

Effect of Helper T cell 9 on the Formation of Atherosclerosis Plaque

YANG Ke-ping, ZHANG Yun-feng，NI Wen-qiong，XU Chen-hong，LI Xin

Department of Cardiology, Jingzhou Central Hospital, Jingzhou 434020,China

【Abstract】Objective: To explore the effect of Helper T cells 9(Th9) on the formation of atherosclerosis plaque. Method: 28 apolipoprotein E gene knockout (apoE-/-) mice of 8 weeks of age were fed with high fat diet. 4 mice was used for preparation of Th9 cells, the rest 24 were divided into four groups: 12 weeks of age group and 16 weeks of age group and Th9 adoptive group (injection of Th9 via tail vein) and IL-9 Ab group (injection of IL-9 Ab via tail vein). Each group contained 6. Flow cytometry and ELISA assay were used to detect the changes of Th9 cell count and IL-9 level in peripheral blood of 12 and 16 week old mice, and HE staining was used to observe the area of abdominal aortic plaque and the ratio of the size of the abdominal aorta to the lumen area. The same method was used to detect the above indexes of Th9 and IL-9 Ab groups in 16 weeks. CD68 immunohistochemical (SP) staining was performed to compare the number of CD68 positive cells in the two groups. Results: The peripheral blood Th9 cells and IL-9 levels of 16 weeks old apoE-/-mice were higher than those of the 12 week old mice. The area of abdominal aortic plaque and plaque area / lumen area ratio also increased. The differences were statistically significant (P<0.05); comparison of Th9 adoptive group and IL-9 antibody group, Th9 cells quantity in peripheral blood and IL-9 concentration of the former increased, abdominal aortic plaque area and plaque area / lumen area ratio increased significantly, CD68 positive cells increased in the plaque, the thickness of fibrous cap became thin, the differences were statistically significant(P<0.05). Conclusion: Th9 cell could boost atherosclerosis and contribute to unsteady state of artery plaque via IL-9.

【Key words】Helper T cell 9; IL-9; Atherosclerosis; apoE-/-mouse

冠心病病程與血管壁急慢性炎癥有關。生物體內(nèi)各種T細胞亞群均參與了炎癥過程，對其干預已成為預防和治療冠心病研究的熱門方向。近年研究發(fā)現(xiàn)的輔助型T細胞9(Helper T cell 9，Th9)是一種新型效應性細胞，它不同于以往的Th1、Th2、Th17

和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)亞類，Th9以分泌白細胞介素-9(IL-9)為主，并在多種免疫性和過敏性疾病中發(fā)揮重要作用[1]。但其是否參與動脈粥樣硬化的血管壁炎癥反應及對動脈粥樣斑塊的作用機制尚不十分明確。本實驗觀察載脂蛋白E基因敲除(apoE-/-)小鼠經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)不同時間或尾靜脈注射一定劑量Th9或IL-9干預后，小鼠周圍血Th9、IL-9水平及腹主動脈粥樣斑塊面積、纖維帽厚度、CD68陽性巨噬細胞數(shù)量等的變化，探討Th9對動脈粥樣硬化形成和發(fā)展的影響。

1材料與方法

1.1　實驗動物及分組處理

8周齡雄性apoE-/-C57BL/6J小鼠28只，購自北京維通利華實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2014-0008；4只用作制備Th9細胞，余24只隨機分為四組：12周齡組6只，高脂飲食(脂肪15.00%、膽固醇1.25%、膽酸0.50%、基礎飼料83.75%，購自江蘇協(xié)同生物工程有限公司)喂養(yǎng)至12周齡時，取外周血及腹主動脈檢測有關指標；16周齡組6只，高脂飲食喂養(yǎng)至16周齡時，取外周血及腹主動脈檢測有關指標；Th9過繼組6只，每只8周齡小鼠尾靜脈一次性注射1.3中制備的同系小鼠CD4+IL-9+T細胞(Th9細胞)3×106個，16周齡時取外周血及腹主動脈檢測有關指標；IL-9抗體組(IL-9 Ab組)6只，每只8周齡小鼠尾靜脈注射IL-9 Ab，每周一次，5μg/次，16周齡時取外周血及腹主動脈檢測有關指標。

1.2　實驗試劑和器材

rmIL-4和rmTGF-β購自美國 Biosource公司(NO:BML-P150-0500)； FITC-antimouse CD4、PE-anti mouseCD62L及PE-anti IL-9 購自美國Biolegend 公司(NO:108909)；IL-9 ELISA試劑盒購自美國R&D公司(NO:SC1375)；CD68單克隆抗體和SP試劑盒購自上海邁新生物技術有限公司(NO:FX-00013)；細胞培養(yǎng)基包含RPMI 1640(Gibco公司,NO:31800022)和20%胎牛血清(Gibco公司，NO: 16000085),青霉素和鏈霉素各100U/L(上海生物化學制藥廠，NO: 20140718)；固定劑、破膜劑購自美國Beckman-coulter公司(NO:92550-00-35)；Tris-NH4Cl購自上海君瑞生物技術有限公司(NO:UFJ00341)；PBS購自上海研拓生物技術有限公司(NO:H0042)；CD3Ab、CD28Ab培養(yǎng)板購自美國BD公司(NO:553057)；烏拉坦購自上海恒遠生物科技有限公司(NO:51796)。實驗器材：恒溫培養(yǎng)箱(9082型，上海醫(yī)用分析儀器廠)；EL312 microplate 酶標儀(BIO-TEK，美國)；96孔聚苯乙烯酶標板(655096型，德國Greiner )；石蠟病理切片機(YD-325型，上海之信儀器有限公司)；顯微攝像系統(tǒng)( BX50，日本Olympus公司)；流式細胞儀(FACSCanto，美國Becton Dickinson公司)。

1.3　Th9細胞的制備

8周齡雄性apoE-/-小鼠4只，乙醚麻醉后剖腹取脾臟，研磨過濾，Tris-NH4Cl去除紅細胞，收集有核細胞用PBS調(diào)整密度為106個/ml，制成每管100μl細胞懸液共4支，分別加入標記FITC-CD4、PE-CD62L各0.1μg, 4℃ 孵育20min后，PBS洗兩遍；加入0.5ml PBS重懸，流式細胞儀分選CD4+CD62LhighT細胞作為naive T細胞。用RPMI重懸naive T細胞濃度為2×106個/ml，加至2μg/ml CD3 Ab和CD28 Ab包被過夜培養(yǎng)板，再每孔加入20ng/ml的rmIL-4和3ng/ml 的轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)溶液，37℃ 孵育48h收獲細胞，調(diào)整細胞密度為1×106個/ml，加入FITC-CD4和PE-IL-9抗體，用流式細胞術檢測到CD4+IL-9+細胞即為Th9細胞。結(jié)果顯示，CD4+IL-9+T細胞占細胞總數(shù)(74±12)%，見圖1。

圖1　Th9細胞(CD4+IL-9+ )流式細胞圖

1.4　有關指標及檢測方法

1.4.1Th9細胞檢測：眼球摘除法取各組小鼠外周血200μl，肝素抗凝，用同1.3方法制作有核細胞懸液，每管100μl。用FITC-CD4+抗體10μl標記，4℃避光孵育30min。隨后進行細胞固定、破膜和胞內(nèi)

染色，即每管中加入PE-anti IL-9 10μl，4℃避光孵育25min，PBS洗滌后，1 500r/min離心5min，棄上清，重洗一遍后，上流式細胞儀檢測Th9細胞數(shù)量。以Th9細胞占有核細胞百分比表示。

1.4.2IL-9檢測：眼球摘除法取各組小鼠外周血，肝素抗凝，離心留取血漿，置于-80℃冰箱中凍存，按ELISA試劑盒說明書檢測IL-9濃度。

1.4.3腹主動脈斑塊觀察：各組小鼠腹腔注射10%烏拉坦麻醉后剖腹，取整段腹主動脈，用4.0g/L多聚甲醛固定10min,常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察，通過Image J軟件分析計算腹主動脈斑塊面積與管腔面積、兩者面積比及纖維帽厚度。

1.4.4腹主動脈斑塊CD68染色：取Th9過繼組和IL-9 Ab組小鼠腹主動脈組織斑塊，采用SP法，參照試劑盒說明書行腹主動脈斑塊CD68染色，以每張切片斑塊肩部及基底部出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為CD68陽性細胞，選取4個高倍視野(×200)計數(shù)每個視野中的陽性細胞，取均值進行統(tǒng)計學分析。

1.5　統(tǒng)計學處理

2結(jié)果

2.1　不同周齡apoE-/-小鼠外周血Th9細胞數(shù)量、IL-9濃度變化及腹主動脈斑塊大小

16周齡組小鼠外周血Th9細胞數(shù)量及IL-9濃度較12周齡組小鼠升高(t=3.217，t=3.341，P<0.05)；腹主動脈斑塊面積及斑塊面積/管腔面積比值亦比12周齡組大(t=5.426，t=6.324，P<0.05)，斑塊內(nèi)細胞豐富，膽固醇結(jié)晶增多，纖維帽較薄(t=4.100，P<0.01)；兩組管腔面積差異無統(tǒng)計學意義(t=2.118，P>0.05)。見表1和圖2。

表1　不同周齡小鼠外周血中Th9數(shù)量、IL-9濃度及腹主動脈

注：與12周齡組比較，1)P<0.05，2)P<0.01

2.2　Th9過繼組和IL-9 Ab組外周血Th9細胞數(shù)量、IL-9濃度變化及腹主動脈斑塊大小

16周齡Th9過繼組小鼠外周血Th9細胞計數(shù)和IL-9濃度均較IL-9 Ab組增加(t=6.214，t=6.248，P<0.01)，且腹主動脈斑塊較IL-9 Ab組明顯增大(t=5.302，P<0.01)，其占管腔面積比更大(t=7.438，P<0.01)；纖維帽更薄(P<0.01)；兩組管腔面積差異無統(tǒng)計學意義(t=1.872，P>0.05)。見表2及圖3。

表2　Th9過繼組和IL-9 Ab組小鼠外周血Th9細胞計數(shù)、IL-9

注： 與IL-9 Ab組比較，1)P<0.01

2.3　Th9過繼組和IL-9 Ab組大鼠腹主動脈斑塊CD68免疫組化結(jié)果

如圖4所示，16周齡Th9過繼組小鼠腹主動脈斑塊內(nèi)CD68陽性巨噬細胞顯著多于IL-9 Ab組，其值分別為52±12和24±8(n均=6)，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.700，P<0.05)。

[本文圖2-圖4見封4]

3討論

動脈粥樣硬化與血管壁內(nèi)慢性炎癥有關，在動脈粥樣損害的早期階段即有活化的T淋巴細胞在斑塊局部浸潤。除了經(jīng)典輔助性T細胞Th1、Th2，近年對Th17和Treg與動脈粥樣硬化的研究也較多[2,3]，認為Th17細胞以促炎作用為主，而Treg對斑塊有明顯抑制作用。最近又有研究發(fā)現(xiàn)機體內(nèi)有一群不同于上述輔助性T細胞的CD4+T細胞亞群，主要分泌IL-9，稱之為Th9[4]。在體外，此類細胞可通過IL-4和TGF-β誘導naive T細胞而獲得[5]。目前研究表明，Th9細胞在寄生蟲誘發(fā)的免疫應答和過敏性疾病中起著重要的作用，其主要效應因子是IL-9[6,7]。在自身免疫性結(jié)腸炎、實驗性自身免疫性腦脊髓炎、多發(fā)性硬化等自身免疫性疾病中，Th9細胞能加重炎癥反應而加重病情[8-10]。但Th9是否參與動脈粥樣硬化的炎癥過程，對斑塊生長的作用如何尚不十分明確。因此，本研究采用高脂飲食飼養(yǎng)8周齡apoE-/-小鼠，分別給予Th9過繼及IL-9 Ab干預后，觀察Th9細胞過繼在動脈粥樣硬化炎癥過程中的作用。

本文結(jié)果表明，經(jīng)高脂飲食喂養(yǎng)的8周齡apoE-/-小鼠，其外周血中Th9細胞數(shù)量及IL-9濃度均明顯升高，斑塊面積也增大，提示Th9可能通過IL-9促進小鼠炎癥的發(fā)生，進而導致動脈粥樣硬化。為了驗證該現(xiàn)象，我們給apoE-/-小鼠注入Th9細胞(過繼組)或IL-9抗體，結(jié)果再次表明Th9過繼組Th9細胞數(shù)量和IL-9水平均高于IL-9 Ab組，且斑塊面積更大，纖維帽更薄，斑塊內(nèi)巨噬細胞增多，而IL-9 Ab組由于IL-9 Ab中和了IL-9的作用，上述指標明顯改善，且CD68陽性巨噬細胞也顯著減少，進一步證實Th9細胞分泌的IL-9參與和促進了動脈粥樣硬化的炎癥過程，更在斑塊的不穩(wěn)定性中充當重要角色。

既往認為IL-9是Th2細胞類因子，與個體發(fā)育及造血有關，但近來研究發(fā)現(xiàn)， IL-9可作用于多種炎癥細胞，遠遠超出了僅僅作為調(diào)節(jié)造血細胞的閥功能[11]。有文獻報道過敏性哮喘及鼻炎患者血清IL-9水平升高[12,13]。還有研究認為IL-9可作為調(diào)節(jié)自身免疫性疾病炎癥反應的一種新的治療靶向，可用 IL-9 Ab來治療某些哮喘、粒細胞性白血病和關節(jié)炎等免疫性疾病[14-16]。本次動物實驗證實Th9細胞積極參與了動脈粥樣硬化的炎癥機制，對動脈硬化有明顯促進作用。另一方面，IL-9 Ab可抑制炎癥進程和改善動脈粥樣硬化，提示臨床這種炎癥機制調(diào)節(jié)或可作為預防和治療冠心病的靶標之一。但對Th9是否通過IL-9途徑來聚集巨噬細胞，從而激發(fā)炎癥反應，形成斑塊泡沫化，有待進一步研究。

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楊克平(1977—)，男，漢族，博士，副主任醫(yī)師，主要從事冠心病炎癥機制研究

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作者簡介：本文第一

[中圖分類號]R392.12

[文獻標識碼]A

[文章編號]1005-1740(2015)04-0032-04

doi：10．3969／j．issn．1005－1740．2015．04．008

[作者單位]湖北省荊州市中心醫(yī)院心內(nèi)科，荊州 434020

本文2015-05-20收到，2015-09-21修回

微循環(huán)學雜志，2015，25（4）：32－35

? 2015 CHINESE JOURNAL OF MICROCIRCULATION