過(guò)表達(dá)microRNA-21對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響

張小花　方五旺　管麗娟　王　斐　王騰飛

過(guò)表達(dá)microRNA-21對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響

張小花1方五旺2管麗娟3王斐3王騰飛3

【摘要】目的：觀察直接心肌注入microRNA-21基因腺病毒對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響。方法：40只健康SD大鼠，隨機(jī)分為五組：假手術(shù)組、模型組、生理鹽水組、腺病毒載體組、microRNA-21腺病毒組，每組8只。假手術(shù)組只開(kāi)胸、穿線，不結(jié)扎，也不注射任何物質(zhì)。余4組通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支復(fù)制心肌梗死模型，其中模型組成模后不做其它處理，另3組成模后分別注入不同目標(biāo)物質(zhì)。飼養(yǎng)3天后一并處死，摘取心臟，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)左心室心肌microRNA-21表達(dá)量，采用TTC染色法測(cè)量心肌梗死面積。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組上述指標(biāo)間的差異。結(jié)果：microRNA-21腺病毒組microRNA-21表達(dá)量(0.72±0.01)較其它四組明顯增加(P<0.01)，其它四組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；假手術(shù)組未見(jiàn)心肌梗死，microRNA-21腺病毒組心肌梗死面積(31.27±1.60%)較其它三組明顯減小(P<0.05)，其它三組心肌梗死面積差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：直接心肌注射microRNA-21基因腺病毒可實(shí)現(xiàn)心肌microRNA-21基因的過(guò)表達(dá)，進(jìn)而減小心肌梗死面積。

【關(guān)鍵詞】microRNA-21基因；過(guò)表達(dá)；心肌梗死；大鼠

Relationship between Myocardial Infarction Size and the Overexpression of Micro RNA-21

ZHANG Xiao-hua1,FANG Wu-wang2,GUAN Li-juan3,WANG fei3,WANG Teng-fei3

1Department of Cardiology,3Department of Geriatric, The Fifth People's Hospital of Chengdu City,Chendu 611130,China;2Department of Cardiology, The Second People's Hospital of Wuhu in Anhui Province,Wuhu 241000,China

【Abstract】Objective: To investigate the effects on myocardial infarction(MI) size through injecting gene adenovirus carrying micro RNA-21 (miR-21) into the myocardium directly. Method: Forty male mice were divided into sham group, model group, saline group, adenovirus vector group,miR-21 adenovirus group. The sham group was only opened and threaded without ligation and infusion. The remaining four groups were subjected to MI by left anterior descending artery (LAD) ligation, model group was left untreated,while the other three groups were infused different target materials into surrounding areas of MI after building model successfully. Then executed the mice and spayed the heart at 3th day concurrent. Expression of miR-21 in surrounding areas of left ventricular MI was detected with real-time PCR and MI size was measured with TTC dyeing. Results: The expression of micrornas-21 of injection with microras-21 adenovirus vector group (0.72±0.01) was significantly increased than the other four groups(P<0.01).There was no obvious differences among the other four groups; sham group had no myocardial infarction， while myocardial infarction size of micrornas-21 adenovirus vector group (31.27±1.60%) significantly decreased than the other three groups (P<0.05).There were no significant statistical differences among them. Conclusion: Intramyocardial injections by directly injection with miR-21 gene adenovirus vectors can realize overexpression of miR-21 gene, the gene expression of miR-21 in three days after myocardial infarction has the effect that reduce MI size.

【Key words】MicroRNA-21; Overexpression; Myocardial infarction; Mice

[作者單位]四川省成都市第五人民醫(yī)院，成都 611130；1心內(nèi)科；3老年病科；2安徽省蕪湖市第二人民醫(yī)院心內(nèi)科，蕪湖 241000

本文2015-07-20收到，2015-09-30修回

心肌梗死是指心肌缺血超過(guò)一定時(shí)間，心肌血液灌注量和需求量失去平衡，心肌細(xì)胞失去營(yíng)養(yǎng)支持所致的心肌細(xì)胞壞死。傳統(tǒng)的治療方法主要包括藥物溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈支架介入(Percutaneous Coronary Intervention，PCI)以及冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(Coronary Artery Bypass Grafting，CABG)。但部分終末期患者并不適宜上述治療，需尋求新的治療方案。近年來(lái)，微小RNA(microRNA)已受到臨床關(guān)注和應(yīng)用研究。

MicroRNA是真核生物中的一種非編碼單鏈小分子RNA，參與眾多疾病的病理生理過(guò)程，如各種細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖和死亡、肌細(xì)胞收縮和舒張、神經(jīng)元形成、心血管病變和病毒感染后的調(diào)節(jié)等[1]。載入或剔除相關(guān)microRNA基因可緩解或加重疾病進(jìn)展[2]，或可作為循環(huán)標(biāo)志物被用來(lái)檢測(cè)心肌損傷[3]。而microRNA-21則是影響心肌梗死面積的重要調(diào)控基因，在多種類型心臟應(yīng)激后表達(dá)增加[4]，是目前microRNA的研究熱點(diǎn)。本文通過(guò)直接心肌注入攜帶microRNA-21基因的腺病毒至心肌梗死大鼠，觀察過(guò)表達(dá)microRNA-21對(duì)原有心肌梗死面積的影響，為心肌梗死的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)試劑和器材

25%烏拉坦(皖南醫(yī)學(xué)院藥劑科)，TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑，上海漢恒生物研究所)，cDNA合成試劑盒(加拿大Fermentas公司)，Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)，PCR擴(kuò)增引物及SYBR Green PCR試劑盒(海捷瑞生物工程公司)，腺病毒載體Ad-miR21及空基因腺病毒載體(上海漢恒生物公司)，7-0縫線(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司)，4℃冰箱(青島海爾公司)，微量注射器(大龍醫(yī)療設(shè)備上海有限公司)，HX-300動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)，Powerlab/4ST型心電圖機(jī)、AB104-N電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司生產(chǎn))，體視顯微鏡(Olympus公司)等。

1.2　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組處理

1.2.1動(dòng)物及分組： 健康雄性SD大鼠40只，體重250±30g，購(gòu)自安徽省合肥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組、生理鹽水組、腺病毒載體組、microRNA-21腺病毒組，每組8只。

1.2.2心肌梗死模型的建立[5]：大鼠以25%烏拉坦(0.4ml/100g)腹腔注射麻醉后固定于鼠臺(tái)，分離氣管后行氣管插管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)(呼吸頻率50-60次/min，潮氣量4-6ml/次)和心電圖機(jī)(記錄標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖)。開(kāi)胸，常規(guī)暴露心臟及左室表面血管，以左冠狀動(dòng)脈主干為標(biāo)志，于肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間距主動(dòng)脈根部約3-4mm處進(jìn)針(深度2mm左右)，置放無(wú)創(chuàng)縫合線(7-0)，假手術(shù)組不行結(jié)扎，余4組進(jìn)行縫扎。結(jié)扎后各組結(jié)扎區(qū)心肌活動(dòng)幅度減弱或消失、心肌顏色較相鄰區(qū)域變淺或變白(圖1)，心電圖各導(dǎo)聯(lián)ST段抬高>0.2mv，持續(xù)30min為急性心肌梗死建模成功[5]，4組大鼠均成模。

1.2.3各組干預(yù)方法：假手術(shù)組及模型組大鼠均不予任何干預(yù)。生理鹽水組、腺病毒載體組及microRNA-21腺病毒組用微量注射器分別吸取100μl生理鹽水、腺病毒載體溶液、攜帶microRNA-21腺病毒溶液，按照?qǐng)D1標(biāo)注的干預(yù)注射點(diǎn)直接注入梗死心肌周圍。然后逐層縫合手術(shù)切口，關(guān)胸，拔除氣管插管，腹腔注射青霉素防止術(shù)后感染。

1.3　檢查指標(biāo)和方法

術(shù)后，各組大鼠飼養(yǎng)3天，為方便比較，每組隨機(jī)選取5只大鼠行以下指標(biāo)檢測(cè)(術(shù)后假手術(shù)組、模型組、生理鹽水組、腺病毒載體組、microRNA-21腺病毒組大鼠分別存活8、6、5、6、7只)，采用前述麻醉和手術(shù)方法摘取心臟，用生理鹽水沖洗表面血液后，于-80℃冰箱凍存。

1.3.1microRNA-21檢測(cè)：取出冰凍心肌組織0.1g，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)心肌microRNA-21的表達(dá)量，反應(yīng)體系為25μl，循環(huán)模式：94℃ 預(yù)變性2min，94℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 30s，40個(gè)循環(huán)，72℃ 10min,10℃ 20min，以U6作參照基因。采用相對(duì)定量法中的2-△△Ct方法分析各組microRNA基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2TTC染色：按照以下步驟配制新鮮TTC溶液：將1L 0.1M Na2HPO4溶液與0.5L 0.1M NaH2PO4溶液混合，調(diào)整pH值為7.4,取混合液100ml，將1g TTC粉劑溶于其中即得1%新鮮TTC溶液。取出冰凍心臟，做垂直左心室長(zhǎng)軸連續(xù)切片，厚1-1.5mm。將心肌組織切片置于1%TTC液中，于37℃水浴15min，然后置于10%福爾馬林固定10min后于體視顯微鏡下觀察，拍照。用Image Pro Plus 6.0軟件分析照片，量化心肌梗死面積，以纖維組織區(qū)域(蒼白區(qū)的心肌)占整個(gè)切片(蒼白區(qū)加上染色的心肌)的百分比表示。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1　各組microRNA-21表達(dá)量比較

各組microRNA-21表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.649，P<0.05)。模型組、生理鹽水組、腺病毒載體組與假手術(shù)組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而microRNA-21腺病毒組microRNA-21表達(dá)水平顯著高于其它四組(t值分別為3.714、3.513、3.368、3.472，P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1　各組microRNA-21基因相對(duì)表達(dá)量和心肌梗死

注：與假手術(shù)組比較，1)P<0.01；與模型組、生理鹽水組、腺病毒載體組比較，2)P<0.05,3)P<0.01

2.2　各組心肌梗死面積比較

假手術(shù)組心肌組織為磚紅色，未見(jiàn)心肌梗死，余四組均可見(jiàn)到有明顯心肌梗死(蒼白區(qū))，microRNA-21腺病毒組梗死面積較小，見(jiàn)圖2。定量分析顯示，四組心肌梗死面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.063，P<0.01)。microRNA-21腺病毒組心肌梗死面積小于模型組、生理鹽水組和腺病毒載體組(t值分別為2.371、2.614、2.601，P<0.05)。模型組、生理鹽水組和腺病毒載體組三組間心肌梗死面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.239,P>0.05)。見(jiàn)表1。

[本文圖1、圖2見(jiàn)封3]

3討論

本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典心肌梗死模型，制作時(shí)將結(jié)扎部位選擇在主動(dòng)脈圓錐和左心耳交界處往下3-4mm，提高了大鼠成模率和存活率，同時(shí)選取腺病毒載體攜帶microRNA-21直接心肌注射，不僅具有良好的安全性，較高的轉(zhuǎn)染效率，相對(duì)長(zhǎng)的表達(dá)時(shí)間，而且操作便捷，充分保障了實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和時(shí)效性。結(jié)果表明microRNA-21腺病毒組注入3天后，其心肌組織microRNA-21表達(dá)水平顯著升高，心肌梗死面積明顯小于模型組、生理鹽水組和腺病毒載體組。提示心肌過(guò)表達(dá)microRNA-21可對(duì)心肌梗死起保護(hù)作用。

治療心肌梗死目前常選擇溶栓和冠脈介入來(lái)開(kāi)通血流以拯救壞死心肌和提高心臟功能[6，7]。探討基因治療也是基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。microRNA-21與心血管疾病密切相關(guān)，已被很多研究，包括本實(shí)驗(yàn)證實(shí)其在心肌梗死早期的病理過(guò)程中起到調(diào)節(jié)作用，因此可能是治療心肌梗死的新靶點(diǎn)[8]。

但microRNA-21減少心肌梗死的作用機(jī)制尚不明確。有研究[9]證實(shí)，過(guò)表達(dá)microRNA-21可以減少梗死心肌周圍的膠原沉積，并可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)減少心肌細(xì)胞凋亡，提高心臟功能。更重要的是，過(guò)表達(dá)microRNA-21還可通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)受體II來(lái)極大地激活纖維母細(xì)胞增殖和分化，通過(guò)一系列機(jī)制促進(jìn)心臟結(jié)構(gòu)和功能的重塑，促進(jìn)梗死后心肌組織的修復(fù)，有效防止心臟破裂[10-12]。此外，有研究報(bào)道,microRNA-21在血管平滑肌和心肌細(xì)胞增殖和凋亡中亦扮演了重要的角色[13]。

綜上所述，提高心肌microRNA-21表達(dá)水平可減少心肌梗死面積，因而有可能成為心肌梗死基因治療的新靶點(diǎn)，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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張小花(1986-)，女，漢族，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：冠心病的預(yù)防和治療

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作者簡(jiǎn)介：本文第一

[中圖分類號(hào)]R541.4

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1005-1740(2015)04-0028-04

doi：10．3969／j．issn．1005－1740．2015．04．007

微循環(huán)學(xué)雜志，2015，25（4）：28－31

? 2015 CHINESE JOURNAL OF MICROCIRCULATION