鈍齒棒桿菌乳酸脫氫酶基因敲除載體構建

陳小舉， 李興江， 姜紹通

（1.巢湖學院 化學化工與生命科學學院，安徽 巢湖 238000；2.合肥工業(yè)大學 生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009）

琥珀酸是具有潛力的大宗生物基化學品，被廣泛應用于食品、化工和醫(yī)藥等產(chǎn)業(yè)［1］。作為聚丁二酸丁醇酯（PBS）的合成前體，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸一直是研究的熱點［2－4］。文獻［5］對鈍齒棒桿菌（Corynebacteriumcrenatum）的研究結果表明，C.crenatum在厭氧發(fā)酵時可以分泌大量的琥珀酸。文獻［6］在利用C.crenatum厭氧發(fā)酵時，流向乳酸的碳代謝流量要遠遠大于流向琥珀酸的碳代謝流量，C.crenatum所吸收的葡萄糖有70%轉化為乳酸，由此可知，乳酸是C.crena－tum厭氧發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸時的主要副產(chǎn)物。如果要增加琥珀酸的產(chǎn)量，首先需要通過代謝工程減少流向乳酸的碳代謝流量，而敲除乳酸脫氫酶基因（ldhA）可以達到減少乳酸生成的目的，成功構建敲除載體則是敲除乳酸脫氫酶基因的首要環(huán)節(jié)。

基因敲除是通過同源重組將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造染色體上某一基因的一種技術。它克服了隨機整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質的方法。該技術已成功應用于Corynebacteriumglutamicum7與Escherichiacoli［8］等琥珀酸生產(chǎn)菌的代謝途徑改造，減少了副產(chǎn)物的生成。文獻［9］通過構建γ－谷氨酰激酶基因（proB）敲除載體，獲得了proB基因缺陷的菌株，搖瓶發(fā)酵結果表明，與出發(fā)菌株相比，缺陷株生物量降低9.6%，L－精氨酸產(chǎn)量提高13.6%。

插入抗性基因打斷目的基因是基因敲除方法的一種，其原理是在目的基因的特定酶切位點處插入一段抗性基因而達到將目的基因完整性予以破壞的目的。本研究旨在構建乳酸脫氫酶基因敲除載體，為后續(xù)敲除鈍齒棒桿菌乳酸脫氫酶基因以增加琥珀酸產(chǎn)量奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

所用質粒如下：pMD18－T simple特征為Apr，ori of ColE1，購自寶生物工程有限公司；pEASYTMT1特征為Apr、kmr、ori of f1，購自全式金生物技術有限公司；pMA特征為pMD18－T simple carryingldhA，pKA特征為pMD18－T simple carryingkm，pMKA 特征為 pMD18－T simple carryingldhA：：Ωkm，均為本實驗室研究。

所用菌株如下：CorynebacteriumcrenatumCICC20219為野生、典型菌株，購自CICC；E.coliJM109特 征 為 recA1end A1gyrA96thi－1hsdR17（rk－，mk＋）relA1supE44Δ（lac－proAB）［F’traD36proAB laclqZΔM15］，本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：葡萄糖（5g／L）、蛋白胨 （10g／L）、酵母膏（5g／L）、NaCl（10g／L），pH 值為7.0，0.1MPa滅菌15min。抗生素為氨芐青霉素（100μg／mL）和卡那霉素（50μg／mL）。

1.1.3 酶與試劑

限制性內切酶、DNA連接酶、低熔點瓊脂糖購自TKaRa公司。聚合酶鏈式反應（polymerase chain raction，PCR）引物合成及PCR試劑由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自愛思進有限公司。氨芐青霉素和卡那霉素為sigma公司產(chǎn)品。DNA marker購自寶生物工程有限公司，型號為250bp DNA Ladder Marker。蛋白胨和酵母膏購自OXOID公司，其他試劑均為分析純。

1.1.4 主要儀器

TC－96PCR儀（杭州博日科技有限公司）、Multiporator電轉化儀（Eppendorf公司）、Universal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)（Bio－Rad公司）。

1.1.5 引物

根據(jù)genebank上公布的Corynebacterium glutamicumldhA基因序列和pEASYTM－T3上km序列分別設計2對引物（5′－3′）：

引物P1與P2用于擴增C.crenatum的乳酸脫氫酶基因ldhA，分別含有SalI酶切位點。引物P3與P4用于擴增卡那霉素抗性基因km，分別含有EcoRV酶切位點。

1.2 方法

1.2.1 DNA 操作

E.coli質粒提取、E.coli感受態(tài)細胞制備與CaCl2法轉化參照文獻［10］。C.crenatum基因組的提取參照文獻［11－12］。

1.2.2 PCR 擴增

PCR擴增采用50μL體系。基因ldhA的PCR反 應 條 件 為：94 ℃，3min；94 ℃，1min；55℃，30s；72℃，1min；30個循環(huán)后于72 ℃再延伸7min?；騥m的PCR反應條件為：94℃，3min；94 ℃，1min；57 ℃，30s；72 ℃，1min；30個循環(huán)后于72℃ 再延伸7min。

1.2.3 乳酸脫氫酶基因敲除載體的構建

利用EcoRV內切酶對質粒pMA與PCR擴增的卡那霉素抗性基因片段km進行酶切，分別進行瓊脂糖凝膠電泳并回收，將回收后的片段進行連接得敲除載體pMKA，結構如圖1所示。

圖1 敲出載體pMKA結構簡圖

以C.crenatum基因組為模板PCR擴增ldhA基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果并對片段進行回收。將凝膠回收的ldhA基因片段連入pMD18－T simple質粒，構建重組質粒pMA并轉化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞。篩選陽性轉化子，提取pMA質粒，測序驗證以確認擴增的片段為ldhA基因。

2 結果與討論

2.1 ldhA基因片段克隆

以鈍齒棒桿菌（C.crenatumCICC20219）基因組DNA為模板，以P1／P2為引物，PCR擴增ldhA基因片段，結果如圖2所示。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，1～4泳道出現(xiàn)了比較明亮的條帶，且擴增的基因片段大小與預期的片段大?。ù蠹s1 000bp）相符，表明PCR擴增的產(chǎn)物為ldhA基因片段。PCR擴增結果較為理想，故而可以進一步對其做膠回收、純化，留作后續(xù)實驗所用。

圖2 基因ldhA的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 pMA質粒構建

將回收后的ldhA基因片段與pMD18－T simple載體連接，然后轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性菌株并提取質粒，以提取的質粒為模板，以P1／P2為引物，PCR擴增ldhA基因片段，以驗證ldhA基因片段是否與pMD18－T simple載體連接成功。如果ldhA與pMD18－T simple連接成功，則提取的質粒中必然含有l(wèi)dhA片段，理論上利用ldhA的PCR體系和程序進行擴增就能得到ldhA的擴增片段。PCR結果電泳圖如圖3所示。

由圖3可知，1、4泳道上未見目的條帶，說明提取的質粒中不含ldhA片段，其對應的為假陽性重組子；在2、3、5泳道上有大約1 000bp的條帶，大小與目的片段相符，因而可以斷定PCR擴增出了ldhA片段，證明ldhA與pMD18－T sim－ple已成功連接，其對應的質粒即為本實驗所要構建的pMA載體。

圖3 pMA重組質粒的PCR驗證

2.3 卡那霉素抗性基因km的克隆

以質粒pEASYTM－T1為模板，以P3／P4為引物，PCR擴增km基因片段。瓊脂糖凝膠電泳圖如圖4所示。由圖4可以看出，在PCR擴增的2管平行樣所對應的2、3泳道上可見明亮條帶，且條帶大小與目的片段相符，表明擴增產(chǎn)物為目的片段，且PCR擴增結果較為理想，故而可以進一步對其做膠回收、純化，然后連入pMD18－T simple質粒，得到質粒pKA。

圖4 基因km的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.4 乳酸脫氫酶基因敲除載體的構建

將質粒pMA進行EcoRV酶切并回收大片段，同時將質粒pKA進行EcoRV酶切并回收小片段，然后將分別回收的片段進行連接，得到質粒pMKA。將質粒pMKA轉化為大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性菌株并提取質粒，以提取的質粒為模板，以P1／P2為引物進行PCR擴增與酶切驗證。PCR結果如圖5所示。由圖5可知，在實驗的4個平行樣中，只有1、4泳道在2 250bp附近的位置出現(xiàn)目的條帶，其大小正好符合ldhA與km片段之和，表明pMA質粒與km連接成功。

敲除質粒pMKA的實際大小為4 714bp左右，經(jīng)過SalI酶切后應得到2個片段，一個是質粒pMD18－T simple除去小片段后剩下的部分，大小約為2 600bp，另一個是km片段和ldhA基因片段組成的大小約為2 200bp的片段。

圖5 pMKA重組質粒PCR驗證

為了驗證km片段是否能成功連接到乳酸脫氫酶基因中的EcoRV特異性酶切位點，本文對pMKA敲除質粒進行了SalI與EcoRV酶切驗證。酶切結果如圖6所示。

由圖6a可知，在1泳道與2泳道分別有2條條帶，其大小約為2 600bp和2 200bp，表明km基因片段成功插入到ldhA片段中。由圖6b可知，泳道2中有2條條帶，分別為經(jīng)EcoRV酶切的km基因片段（1 000bp左右）和去掉km基因片段的pMKA剩余片段（3 700bp左右），表明km基因片段成功連入到ldhA片段中的EcoRV酶切位點，ldhA敲除質粒pMKA構建成功。

圖6 敲除質粒pMKA的酶切鑒定

3 結束語

本文利用鈍齒棒桿菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸時，乳酸是其主要副產(chǎn)物。乳酸脫氫酶是鈍齒棒桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸的關鍵酶，通過構建乳酸脫氫酶基因敲除載體可以用于敲除乳酸脫氫酶基因以達到減少乳酸生成、增加琥珀酸產(chǎn)量的目的。為此本文主要介紹了乳酸脫氫酶基因敲除載體的構建方法及主要過程。首先將克隆到的ldhA基因與質粒pMD18－T simple連接得到質粒pMA，再將km基因插入到ldhA基因中的EcoRV酶切位點，得到載體pMKA。質粒PCR與酶切結果顯示乳酸脫氫酶基因敲除載體構建成功，可以用于后續(xù)乳酸脫氫酶基因的敲除實驗。

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