柔嫩艾美耳球蟲Cathepsin B基因的克隆表達及活性研究

劉任強，蔡建平，汪 明＊

（1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院國家原蟲實驗室，北京100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州730046）

雞球蟲病是由頂復合門艾美爾屬球蟲引起的一種寄生蟲病，可對養(yǎng)禽業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失。目前對雞球蟲病的控制措施主要依賴于化學藥物預防，但目前抗藥性和藥物殘留日趨嚴重，急需開發(fā)新藥或找到新的藥物靶點。

組織蛋白酶B（cathespin B）是一類半胱氨酸類蛋白酶，屬于木瓜蛋白家族，研究表明在寄生蟲的生存、與宿主細胞的相互作用、致病性以及逃逸諸多過程中都發(fā)揮了重要的作用［1］。在與球蟲相似的其他頂復合門的寄生蟲中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并克隆了類組織蛋白酶B蛋白，他們在蟲體入侵和入侵相關蛋白質(zhì)的成熟加工中發(fā)揮著重要的作用［2-4］。

頂復門原蟲作為專性胞內(nèi)寄生蟲，游離的蟲體在宿主胞外不能長時間存活。其入侵過程一般在很短時間內(nèi)完成，組織蛋白酶對于胞外的蟲體快速入侵宿主細胞有重要作用。入侵相關蛋白質(zhì)的成熟以及在形成納蟲空泡后從宿主細胞膜上分離的過程中都涉及大量蛋白酶的參與［5-7］。一旦完成入侵，寄生蟲將利用宿主蛋白質(zhì)進行新陳代謝，合成自身生長繁殖所需營養(yǎng)物質(zhì)。這一過程也涉及多種蛋白酶的參與，由于蟲體與宿主細胞的代謝過程不盡相同，因此在抗寄生蟲藥物篩選中，這些蛋白酶作為潛在目標被廣泛研究。寄生蟲的蛋白酶在維持蟲體蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)運輸以及重塑宿主細胞等方面也均發(fā)揮作用，因而具有藥物靶點的潛在價值［8-9］?？梢?，組織蛋白酶對寄生蟲完成其生活史具有重要作用，因此抑制這些蛋白酶活性可在感染過程的不同階段抑制寄生蟲發(fā)育。

半胱氨酸蛋白酶對于許多寄生蟲疾病都是重要的免疫優(yōu)勢抗原，能刺激宿主產(chǎn)生較好的細胞和體液免疫。該類蛋白質(zhì)還存在種屬特異性，因此作為一種較好的候選診斷抗原也有重要意義。同時，由于蛋白酶的酶活性位點與小分子物質(zhì)可發(fā)生相互作用，蛋白酶作為藥物開發(fā)的靶位點，開發(fā)多種小分子蛋白酶抑制劑，越來越受人們關注。隨著寄生蟲的半胱氨酸蛋白酶研究的深入，半胱氨酸蛋白酶日益矚目，相關領域的研究不僅揭示了寄生蟲與宿主相互作用的具體機制，也為寄生蟲病的診斷與防治開辟了新的思路。

1 材料與方法

1.1 卵囊的分離與純化

E.tenella Houghton株未孢子化卵囊的分離、純化：用1.0×104E.tenella Houghton株卵囊感染雞后，在感染的第7天收集盲腸，用組織勻漿器搗碎后100目網(wǎng)過濾，然后用飽和鹽水漂浮，洗滌后再用10%次氯酸鈉處理，離心沉淀后回收，加1 mmol·L-1亞硫酸氫鈉，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

E.tenella Honghton株未孢子化卵囊總RNA的提?。喝?×107凍存的卵囊塊加入研磨器液氮充分研磨，加入1 m L Trizol（Invitrogen）中，室溫靜置5 min，提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄采用TransScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術有限公司），cDNA存于-20℃。

1.3 引物的設計

利用弓形蟲中報道的Cathepsin B的序列，與E.tenella的數(shù)據(jù)庫（http：／／www.genedb.org／Homepage／Etenella）進行Blast P比對，在數(shù)據(jù)庫中找到序列（Supcontig＿23）可編碼具有cathepsin B類蛋白特征的開放閱讀框（ORF）。用Primer premier 5.0軟件設計1對引物，F(xiàn)1：5′-ATGAGGATGGGGAAGCTGTGGGCC-3′；R1：5′-TCATAGGTCCTGCGCTGACGGCAG-3′。

1.4 Etcat B基因序列克隆及分析

以cDNA為模板，擴增條件：95℃預變性5 min；94℃20 s，60℃30 s，72℃100 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。將Etcathepsin B（Etcat B）PCR產(chǎn)物連接到T載體（北京全式金生物技術有限公司），以PCR及序列測定篩選陽性克?。╬EASTT1-Etcat B），用DNAMAN進行序列分析。

1.5 Etcat B的原核表達

利用SignalIP2.0對序列進行分析，去除信號肽，用Primer premier 5.0軟件設計1對引物，F(xiàn)2：5′-ATGCCCTCCGATGATTTGGGCGGCGCT-3′；R2：5′-TCATAGGT-CCTGCGCTGACGGCAG-3′。將PCR產(chǎn)物連接到表達載體（北京全式金生物技術有限公司），PCR及序列測定篩選陽性克隆（p EAST-E1-Etcat B）。取陽性表達菌接種到LB（含Amp）中，37℃200 r·min-1擴大培養(yǎng)，菌液濃度增至OD值0.6，1 mmol·L-1IPTG誘導，SDSPAGE分析，確定表達條件。使用Ni-NTA柱（Qiagen）進行純化。

1.6 Etcat B的活性檢測

將蛋白質(zhì)加入等量非變性SDS電泳上樣緩沖液中（2%SDS，0.125 mol·L-1Tris-HCl，p H 6.8，10%甘油，0.001%溴酚藍），經(jīng)含0.1%明膠的10% SDS-PAGE電泳終止后，凝膠置于漂洗液中（含50 mmol·L-1乙酸鈉，10 mmol·L-1半胱氨酸，100 mmol·L-1NaCl，2.5%Triton X-100）漂洗1 h，蒸餾水洗3遍，孵育于底物緩沖液（50 mmol·L-1乙酸鈉、1.212 g半胱氨酸、0.5 mmol·L-1EDTA），37℃孵育24 h，1%考馬斯亮藍染色，脫色后可見具明膠酶活性處為清晰透明條帶。

1.7 Etcat B多克隆抗體的制備

首免將純化好的Etcat B重組蛋白質(zhì)與等體積的弗氏完全佐劑混勻后（0.5 mg·kg-1）對成年健康家兔進行背部多點皮下及肌肉注射，2周后再用Etcat B重組蛋白質(zhì)與等體積弗氏不完全佐劑混勻（2 mg·kg-1）背部多點皮下及肌肉注射，此后每隔1周用蛋白質(zhì)樣品（2 mg·kg-1）皮下及肌肉注射。四免后采集血液，用間接ELISA測定抗體效價。用Etcat B蛋白（10μg·m L-1）包被ELISA板，每孔100μL。4℃過夜后棄液體，PBST（0.05%）洗滌3次。在用5%（m／v）脫脂奶粉進行封閉，37℃1 h；PBST洗滌后分別加入不同稀釋度的抗血清，同時以免疫前血清作為陰性對照，37℃孵育1 h；PBST洗滌3次后加入1∶4 000稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h；加底物TMB 37℃顯色15 min，終止反應后，讀取450 nm吸光值。

1.8 Western blot和Real-time PCR檢測

取107個E.tenella的子孢子、裂殖子、配子體分別加入1 m L TRIzol中充分混勻，室溫作用5 min，取107個未孢子化卵囊和孢子化不同時間卵囊于液氮中研磨，研磨好的樣品加入1 m L TRIzol中充分混勻，室溫作用15 min并提取RNA，剩余油相用異丙醇沉淀蛋白質(zhì)。每使用1 m L TRIzol加1.5 m L異丙醇，室溫放置10 min，4℃12 000×g離心10 min棄上清。用含0.3 mol·L-1鹽酸胍的95%乙醇洗滌蛋白質(zhì)沉淀，每使用1 m L TRIzol加2 m L洗滌液，室溫放置20 min，2～8℃7 500×g離心5 min，棄上清，共洗2次。用2 mL無水乙醇同樣方法再洗一次。真空抽干蛋白質(zhì)沉淀10 min，用1%SDS溶解蛋白質(zhì)，反復吸打，50℃溫浴使其完全溶解。

SDS-PAGE蛋白電泳后，選用PVDF膜，用Bio-Rad濕轉(zhuǎn)裝置，60 v電轉(zhuǎn)2 h。把PVDF膜浸入5%脫脂奶粉，37℃封閉1 h；PBST（0.05%）洗滌后分別加入1∶2 000的一抗，37℃孵育1 h；加入1∶2 000稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h；PBST洗滌5次后，用ECL-plus來檢測蛋白質(zhì)。

Real-time PCR使用的引物為FcatB（5′-CTGGGGAAGCCGGCCAGCTGTTAGC-3′）、RcatB（5′-CGTTCCAGCTGTTCACAGCTAGCCAG-3′）；選用的內(nèi)參為β-actin，引物為Factin（5′-CACCACCgCCg Ag AAAg A-3′）和Ractin（5′-g AACAACATTgCCg TAg Agg-3′）

反應體系：cDNA模板2μL，Power SYBR Green PCR Master Mix 10μL，上／下游引物（25 μmol·L-1）各0.5μL，H2O 7μL，總體積20μL。

反應程序：95℃10 min；95℃15 s；50℃30 s；72℃40 s（讀板），共45個循環(huán)。

利用Graph Pad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進行分析和繪圖。利用SPSS軟件采用Duncan’s multiple range test進行各組數(shù)據(jù)顯著性分析。

2 結 果

2.1 Etcat B基因擴增及序列分析

瓊脂糖凝膠電泳（圖1）顯示有1條約1 500 bp條帶，與預計大小一致。測序結果顯示基因大小為1 539 bp，與sanger上所得的序列（Supcontig＿23）完全一致。序列分析得知Etcat B編碼區(qū)（CDS）編碼512個氨基酸，其蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為56.86 ku，理論pI為5.82。氨基端含有21個氨基酸構成的信號肽，羧基端有典型的cathepsin B的結構特征。與弓形蟲報道的cathepsin B相似性為57%。

2.2 Etcat B原核表達載體的構建和表達條件優(yōu)化

SDS-PAGE電泳結果顯示，在1 mmol·L-1IPTG條件下，與對照組相比，誘導組均表達了57 ku大小的特異帶（圖2，泳道3、4和5），與預測的相對分子質(zhì)量相符（圖2）。表達結果顯示，37℃誘導4 h，該蛋白質(zhì)主要以包涵體的形式表達；4℃過夜誘導轉(zhuǎn)為可溶性表達。

2.3 重組Etcat B活性檢測

明膠酶譜法試驗結果（圖3）顯示，在不同質(zhì)量濃度的酶作用下，均能不同程度的降解明膠，57和35 ku出現(xiàn)特異性透明條帶，且蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度越高，降解越徹底，條帶越明顯。

圖1 Etcat B基因的克隆Fig.1 Cloning of Etcat B gene

圖2 Etcat B原核表達SDS-PAGE電泳分析Fig.2 Analysis of expressed protein by SDS-PAGE

2.4 多克隆抗體制備和Western blot及Real-time PCR檢測

圖3 采用SDS-PAGE明膠酶譜法檢測重組蛋白酶活性Fig.3 Activities of recombinant protein by SDS-PAGE gelatin zymography

間接EILSA顯示兔抗Etcat B血清效價在107以上，表明重組蛋白質(zhì)具有良好的免疫原性。以E. tenella Houghton株配子體、未孢子化卵囊、子孢子和裂殖子cDNA為模板，同時檢測Etcat B和參照基因（β-actin）的表達，計算各階段Etcat B基因表達的相對水平，結果顯示Etcat B mRNA水平在配子體和裂殖體要高于未孢子化卵囊和子孢子階段（圖4）。分別以上述E.tenella四種不同階段總蛋白質(zhì)為模板，同時檢測Etcat B和參照蛋白質(zhì)（tubulin）的表達，結果顯示Etcat B以未成熟和成熟兩種形式均在，蛋白質(zhì)大小分別為57和35 ku，Etcat B在配子體和裂子體時期表達較高，未孢子化和子孢子階段表達相對較低（圖5）。以孢子化不同階段（0、6、12、18、24和48 h）cDNA為模板，同時檢測Etcat B和參照基因（β-actin）的表達，計算孢子化不同階段Etcat B基因表達的相對水平，結果顯示Etcat B mRNA水平在孢子化過程中，基本保持一致（圖6）。以孢子化不同階段（3、6、12、18、24和48 h）總蛋白為模板，同時檢測Etcat B和參照蛋白（tubulin）的表達，結果顯示Etcat B在孢子化過程中，未成熟蛋白質(zhì)和成熟蛋白質(zhì)的水平略有上升趨勢（圖7）。

圖4 E.tenella Houghton株各發(fā)育階段Etcat B mRNA水平Fig.4 The mRNA levels of Etcat B in E.tenella Houghton strain in difference life stage

圖5 E.tenella Houghton株各發(fā)育階段Etcat B Western blot結果Fig.5 The result of Western blot of Etcat B in E.tenella Houghton strain in difference life stage

圖6 E.tenella Houghton株孢子化不同階段Etcat B mRNA水平Fig.6 The mRNA levels of Etcat B in E.tenella Houghton strain during sporulation

圖7 E.tenella Houghton株孢子化不同階段Etcat B Western blot結果Fig.7 The result of Western blot of Etcat B in E.tenella Houghton strain during sporulation

3 討 論

蛋白酶是寄生蟲的一種重要的毒力因子，它們在感染宿主的過程中起了關鍵作用，可作為預防和治療寄生蟲的新型藥物靶點，因此越來越受到大家的重視。研究表明，在S.mansoni中，組織蛋白酶B可分泌到腸腔中，幫助蟲體降解血紅蛋白［10］。G.lamblia含有3個組織蛋白酶B，在蟲體的脫囊和成囊過程中發(fā)揮作用［11］。T.brucei的組織蛋白酶B參與對吞噬的宿主蛋白的降解，且為生存所必需的蛋白質(zhì)［12-13］。有研究表明在艾美爾球蟲的生活史中，蛋白酶參與了諸如宿主細胞入侵［14］和卵囊壁形成等重要的生理過程［15］。但組織蛋白酶B在其中具體參與了何種生理過程及對球蟲防控的影響尚不明確。

本課題組通過RT-PCR手段與國外兩家實驗室［16-17］幾乎同時克隆并表達柔嫩艾美爾球蟲的組織蛋白酶B，通過p BLAST比較發(fā)現(xiàn)，柔嫩艾美耳球蟲的組織蛋白酶B（Etcat B）與T.gondii（Ac.No.EPR63374.1）相似性最高，可達49%，與其相似性較高的寄生蟲還有E.siliculosus（Ac.No.CBN78981.1）、T.spiralis（Ac.No.XP＿003379650.1）、S.mansoni（Ac.No.XP＿002574974.1），相似性分別是43%、40%、39%。與禽類相比（Ac.No.AAA87075.1），盡管在保守區(qū)域相似性較高（可達40%），但Etcat B全長含有512個氨基酸，而雞的cathepsin B僅含有340個氨基酸，兩者對比發(fā)現(xiàn)，在組成結構上，特別是N端起調(diào)節(jié)作用的結構域上區(qū)別很大，研究表明，cathepsin B的這一結構域不僅在蛋白質(zhì)加工折疊中起作用，也可以抑制蛋白酶的活性［18］。由此可見，二者的親緣關系較遠，這為以其作為設計藥物治療或者免疫預防奠定了基礎。

本試驗中，利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)成功表達重組蛋白質(zhì)Etcat B。該蛋白質(zhì)在37℃誘導6 h條件下以包涵體的形式存在，雖然包涵體對表達產(chǎn)物純化和表達產(chǎn)量提高非常有利，但難以獲得活性良好的包涵體蛋白，為了后期進行蛋白質(zhì)活性檢測，試驗中對表達條件進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在16℃過夜誘導的條件下蛋白質(zhì)可以部分以上清的形式表達。通過明膠酶譜法我們確定所得蛋白質(zhì)有一定的活性，結果顯示不僅在57和35 ku有兩條特異性條帶，推測分別是Etcat B未成熟和成熟形式。

作者對重組蛋白質(zhì)進行酶動力學研究，通過熒光ELISA的方法，利用Z-Phe-Phe-AMC檢測低濃度的Etcat B活性，結果顯示原核表達的重組蛋白質(zhì)的活性較低，這一結果和M.Schaeffer等［19］的結果一致。M.Schaeffer通過試驗表明，酵母系統(tǒng)表達所得產(chǎn)物具有較好的蛋白酶活性，說明Etcat B蛋白結構的適度糖基化和修飾對其發(fā)揮活性至關重要。

2012年，M.Katrib等［20］首次利用半定量的方式對Etcat B不同時期的表達進行了初步分析，2013年，A.Rieux等［16］用測定酶活的方法進一步確定了Etcat B孢子化過程中的表達水平。隨后M.Matsubayashi等［17］用半定量法分析了Etcat B在孢子化過程中的表達，并用Western blot的方法檢測了不同發(fā)育階段的表達情況。本試驗中，作者利用Real-time PCR和Western blot的方法進一步檢測了Etcat B在球蟲發(fā)育不同階段和孢子化不同階段的表達水平，結果顯示Etcat B在配子體和裂子體時期表達較高，子孢子和未孢子化階段表達相對較低，孢子化過程中變化不明顯。本研究為探討Etcat B在球蟲的發(fā)育和入侵中的功能及尋找與其互作蛋白質(zhì)，并為尋找其合適的特異性抑制藥物等奠定了基礎。

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