牛偏愛密碼子優(yōu)化后的Beta蛋白多克隆抗體制備

齊 昱，邢燕平，周歡敏，房 君，錢 呈，王海濤

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，呼和浩特010019）

同源重組是基因工程研究中常用的技術手段，在研究基因功能和制作轉(zhuǎn)基因生物方面具有重要作用。傳統(tǒng)的同源重組方法效率較低，操作繁瑣，成本高。近幾年來，一種基于λ噬菌體Red重組酶作用的同源重組技術逐漸成為基因工程研究的熱點之一，并取得了一系列重要進展。Red同源重組系統(tǒng)由λ噬菌體exo、bet、gam 3個基因組成，它們分別編碼Exo、Beta、Gam 3種蛋白質(zhì)［1-2］。Beta蛋白是Red同源重組系統(tǒng)中最關鍵的酶，在重組過程中起著決定性的作用，只需40 bp的同源區(qū)域既能介導同源重組，且在無Red系統(tǒng)中其他兩種蛋白參與的情況下即可使單鏈DNA與染色體上的同源區(qū)域發(fā)生重組。

研究發(fā)現(xiàn)將某一物種的基因在其他物種細胞中進行表達時，表達效率通常會有所下降。這是由于不同物種間對密碼子偏愛性差異導致的。不同物種間密碼子偏好性的出現(xiàn)是由于同義密碼子的使用頻率存在顯著差異［3-4］，可能是由不同物種中氨基酸特異性t RNA的含量、特異性及編碼效率［5］或mRNA轉(zhuǎn)錄效率決定的［6］。密碼子優(yōu)化是提高蛋白表達水平的可行途徑之一。

迄今尚沒有關于利用瞬時表達Beta蛋白對牛體細胞進行高效同源重組的報道。鑒定Beta蛋白是否在牛體細胞中瞬時表達以及表達量的多少都離不開Beta蛋白的抗體，目前市場上尚無利用牛偏愛密碼子進行優(yōu)化后的Beta蛋白的抗體出售。本研究以牛偏愛密碼子對bet基因進行改造并利用基因工程法表達并純化了Beta蛋白，制備其多克隆抗體，為下一步在牛體細胞中實現(xiàn)Beta蛋白的重組功能提供檢測抗體，并為進一步研究bet基因的功能和Beta蛋白在牛及其他哺乳動物同源重組方面的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 試驗動物 5只2月齡雄性CD1小鼠購自內(nèi)蒙古大學動物中心。

1.1.2 試劑 E.coli BL21和表達載體p ET28a由本實驗室保存；DNA maker、Primer Star PCR酶和連接酶Ligation High均購自Ta KaRa公司；限制性內(nèi)切酶Bam H I和Not I購自Themo Scientific公司；Trans T1感受態(tài)細胞購自全式金公司；IPTG、蛋白maker購自Fermentas公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自天根公司；膠回收試劑盒、引物合成和DNA測序均由上海生工生物工程有限公司完成；菌體蛋白提取試劑盒購自QIAgen公司；His tag純化試劑盒購自Promega公司；弗氏佐劑、鼠源His tag抗體和磷酸酯酶標記的山羊抗鼠IgG均購自Sigma公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗鼠IgG購自深圳達科為公司；

1.2 方法

1.2.1 bet基因的優(yōu)化與擴增 將已公布的λ噬菌體bet基因序列（登錄號為AP005153），在不改變氨基酸序列的前提下，根據(jù)牛（Bos taurus）偏愛密碼子采用GenScript公司OptimumGene Codon Optimization Analysis在線軟件（http：／／www.genscript.com.cn）對bet基因密碼子優(yōu)化并進行全基因組合成。優(yōu)化參數(shù)主要包括密碼子適應指數(shù)（Codon adaptation index，CAI）、GC含量調(diào)整及優(yōu)勢密碼子頻率（Frequency of optimal codons，F(xiàn)OP）等。根據(jù)優(yōu)化后的序列設計引物，上游引物：5′-AAGGATCCATGAGTACAGCCCTAG-3′（下劃線處為限制性核酸內(nèi)切酶Bam H I位點）；下游引物：5′-AAGCGGCCGCGGCAGCAACCTTCTG-3′（下劃線處為限制性核酸內(nèi)切酶Not I位點）。擴增條件：94℃預變性5 min；94℃1 min，58℃1 min，72℃2 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.2 bet原核表達載體的構建 PCR產(chǎn)物和p ET28a載體分別經(jīng)Bam H I和Not I雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。將酶切后的PCR產(chǎn)物和載體片段混合加入Ligation High，16℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans T1感受體細胞中，用菌落PCR和酶切鑒定的方法篩選含有目的基因的重組質(zhì)粒，并對篩選出的質(zhì)粒進行測序分析。

1.2.3 重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21菌株中誘導表達 將經(jīng)序列測序分析后完全正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21感受態(tài)細胞中，形成重組菌。按1∶100的體積比將重組菌接種到含50 mg·L-1Kan的LB液體培養(yǎng)基中，200 r·min-1，37℃震蕩培養(yǎng)至菌液OD600nm＝0.4～0.6后，向菌液中加入終濃度為0.4 mmol·L-1IPTG，25℃120 r·min-1誘導4 h，收集菌液。

1.2.4 融合蛋白的純化和檢測 收集的菌液用His LinkTMspin protein purification system試劑盒（Promega公司）進行純化，步驟詳見說明書。將純化過程中產(chǎn)生的裂解液上清，過柱液和洗脫液進行SDS-PAGE凝膠電泳和Western blot鑒定（一抗為鼠源His tag抗體，二抗為山羊抗鼠IgG）。

1.2.5 Beta蛋白多克隆抗體的制備 免疫前，先分別采集5只試驗鼠的眥血分離血清，作為后續(xù)抗體檢測試驗的陰性對照樣品。初次免疫時免疫劑量為每只試驗鼠0.5 mg抗原，純化的融合蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合，超聲乳化后對試驗鼠進行皮下和腹腔下多點注射；初次免疫兩周后，對試驗鼠進行二次免疫，免疫計量同樣為0.5 mg，與弗氏不完全佐劑等體積混合乳化；10 d后第3次免疫，免疫計量為0.1 mg。第3次免疫1周后，心臟采血分離血清，采用Western blot方法檢測抗體的特異性（一抗為制備的多克隆抗體，二抗為山羊抗鼠IgG）；用ELISA測定抗體滴度（用純化后的蛋白包板，一抗為制備的多克隆抗體，二抗為HRP標記的山羊抗鼠IgG）。

2 結(jié) 果

2.1 bet基因的優(yōu)化

參考λ噬菌體bet基因序列，以牛偏愛的密碼子對bet基因進行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化后CAI相對頻率明顯增加（圖1）。基因序列中GC含量應為50%～70%，過高或過低會嚴重影響基因的表達效率，優(yōu)化后bet基因的GC含量略優(yōu)于優(yōu)化前（圖2）。影響基因表達的另一項重要因素是低使用頻率密碼子在基因中的含量，為提高基因的表達效率，在不改變氨基酸序列的前提下，盡量用高使用頻率的密碼子代替低使用頻率的密碼子。優(yōu)化后bet基因的優(yōu)勢密碼子比例達到62%，明顯優(yōu)于密碼子優(yōu)化前（圖3）。優(yōu)化前后bet基因序列比對分析顯示原始bet基因核苷酸序列多處密碼子發(fā)生改變，但編碼的氨基酸序列并沒有改變（圖4）。

2.2 bet基因的擴增

經(jīng)PCR擴增后，得到大小約為780 bp的基因片段，與理論值783 bp大小吻合（圖5）。

2.3 原核表達載體的構建和鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)Bam HⅠ和NotⅠ雙酶切和1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得大小約為780 bp的片段，與理論值783 bp相符的（圖6）。測序比較后與優(yōu)化后的bet基因序列完全一致。

圖1 密碼子優(yōu)化前（A）后（B）bet基因的密碼子適應指數(shù)Fig.1 CAI of original（A）and optimized（B）bet gene

圖2 密碼子優(yōu)化前（A）后（B）bet基因的GC含量Fig.2 GC content of original（A）and optimized（B）bet gene

圖3 密碼子優(yōu)化前（A）后（B）bet基因的優(yōu)勢密碼子頻率Fig.3 FOP of original（A）and optimized（B）bet gene

2.4 重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21菌株中誘導表達和融合蛋白純化

用0.8 mmol·L-1IPTG同時誘導轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒p ET28a-bet的菌BL21（BL21／p ET28a-bet），轉(zhuǎn)化原始載體p ET28a的菌BL21（BL21／p ET28a），以及未轉(zhuǎn)化任何質(zhì)粒的菌BL21（BL21／-）。經(jīng)SDSPAGE分析，BL21／p ET28a-bet的菌體蛋白出現(xiàn)大小約為33 ku的特異性條帶，而BL21／p ET28a和BL21／-的菌體蛋白中都未出現(xiàn)該條帶（圖7）。該特異性條帶與His-Beta融合蛋白預期大小相符。經(jīng)過HisLinkTMSpin Protein Purification System試劑盒純化后，His-Beta融合蛋白呈現(xiàn)出一條帶，純度較高（圖8）。純化前后的菌體蛋白樣品經(jīng)Western blot檢測均呈現(xiàn)單一條帶（圖9），證明純化得到的蛋白為His-Beta融合蛋白。

2.5 Beta蛋白多克隆抗體特異性與滴度檢測

分別以純化前后的His-Beta融合蛋白樣品為抗原，獲得的鼠免疫血清稀釋1∶2 000作為一抗，磷酸酯酶標記的山羊抗鼠的IgG 1∶4 000稀釋作為二抗，進行Western blot檢測，顯色后出現(xiàn)分子質(zhì)量約為33 ku的條帶（圖10）。說明本文獲得的Beta蛋白多克隆抗體具有很強的特異性。

將純化后的Beta蛋白包被ELISA板，以免疫前的5只鼠血清為陰性對照（200倍稀釋，平均OD值為0.098 2），分別測定5只試驗鼠不同稀釋倍數(shù)血清的OD值，取平均值。通過ELISA檢測，檢測結(jié)果顯示，Beta抗體滴度可達1∶41 700，并具有良好的量效關系（R2＝0.904 3）（圖11）。

3 討 論

圖4 密碼子優(yōu)化前后的bet基因序列Fig.4 Original and optimized bet gene sequence

圖5 bet基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定Fig.5 Identified the PCR result of the bet gene by agarose gel electrophoresis

Red同源重組系統(tǒng)由λ噬菌體exo、bet、gam 3個基因組成，它們分別編碼Exo、Beta、Gam 3種蛋白質(zhì)。Exo蛋白是種核酸外切酶，可結(jié)合在雙鏈DNA的末端，從DNA雙鏈的5′端向3′端降解DNA，產(chǎn)生3′突出端。Gam蛋白可與Rec BCD核酸外切酶結(jié)合，抑制其對外源DNA的降解作用［7］。Beta蛋白是一種退火蛋白，在溶液中，Beta蛋白自發(fā)地形成環(huán)狀結(jié)構，緊緊地結(jié)合在單鏈DNA3′突出端，防止DNA被單鏈核酸酶降解，同時介導互補單鏈DNA退火，其機制有兩種：一種是鏈入侵，另一種為單鏈退火［8-9］。

圖6 重組質(zhì)粒pET28a-bet酶切鑒定Fig.6 Identified the recombinant plasmid pET28a-bet by endonucleases digestion Bam H I and Not I

圖7 SDS-PAGE分析pET28a-bet表達產(chǎn)物Fig.7 SDS-PAGE analysis of expression products of pET28a-bet

圖8 SDS-PAGE分析His-Beta純化產(chǎn)物Fig.8 SDS-PAGE analysis of purified His-Beta fusion protein

圖9 His-beta融合蛋白的Western blot檢測Fig.9 Detection of His-beta fusion protein by Western blot

圖10 Western blot檢測Beta蛋白多克隆抗體的特異性Fig.10 Western blot detection of specificity of polyclonal anti-beta antibody

圖11 ELISA檢測Beta蛋白抗體效價Fig.11 Beta polyclonal antibody titer evaluation by ELISA

K.C.Murphy［10］較早利用質(zhì)粒p TP223表達Red重組酶，使線性DNA片段與染色體發(fā)生重組，使大腸桿菌基因缺陷株KM22重組效率大大提高。H.M.Ellis等［11］研究發(fā)現(xiàn)，單鏈DNA可與染色體上的同源序列（40～70 bases）發(fā)生重組。與雙鏈DNA重組機制不同，這種單鏈DNA重組只需要Beta蛋白作用，無需Exo和Gam蛋白參與。近年來，Beta蛋白在微生物的生物工程學改造方面得到廣泛應用。但是關于Beta蛋白在哺乳動物或大型家畜細胞中的同源重組方面的研究和應用卻鮮有報道。2000年，Y.Zhang等［12］構建含有red（bet）基因的載體pcDNA redβ／PGKneo＊，將其轉(zhuǎn)入小鼠ES細胞，電轉(zhuǎn)入兩側(cè)各含28個堿基同源序列的單鏈DNA，成功地將neo基因突變修復，這說明單鏈DNA重組技術在哺乳動物細胞中也可以實現(xiàn)。因此，制備經(jīng)牛偏愛密碼子優(yōu)化后的Beta蛋白的多克隆抗體，可以為今后研究Beta蛋白在牛及大型哺乳動物和家畜的轉(zhuǎn)基因應用方面奠定基礎。

很多與融合蛋白誘導表達相關的研究中提到重組菌誘導表達后，在細胞破碎的上清中很難找到融合蛋白，表達產(chǎn)物幾乎全部以包涵體的形式存在［13-14］。這可能與p ET系統(tǒng)的高效表達有關。蛋白表達量越高越容易形成包涵體，其原因可能是蛋白合成的速度太快，以至于沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確地配對。為了解決這一問題，筆者擬通過降低IPTG濃度，降低溫度和轉(zhuǎn)速達到控制和降低蛋白表達速度的目的。IPTG是β-半乳糖苷酶的活性誘導物質(zhì)，它能夠誘導外源基因的表達并普遍應用于原核表達系統(tǒng)，使其表達量增加。IPTG具有使表達產(chǎn)物穩(wěn)定、易鑒定、易純化等優(yōu)點，但對于特定的外源基因，其最佳誘導條件往往有所不同。因此，對IPTG最佳誘導濃度、誘導時間、誘導溫度以及轉(zhuǎn)速等因素的摸索就成為整個抗體制備過程中的重要環(huán)節(jié)。經(jīng)過反復試驗和比對最終確定誘導Beta蛋白的最佳條件為IPTG終濃度為0.4 mmol·L-1，25℃120 r·min-1誘導4 h。本研究通過優(yōu)化IPTG誘導條件成功解決了這一問題，誘導出Beta融合蛋白并使融合蛋白在細胞破碎后的上清液中大量存在，從而不必再獲取和處理包涵體，簡化了試驗過程。

4 結(jié) 論

本研究以牛偏愛密碼子將bet基因優(yōu)化并成功構建于原核表達載體p ET28a上，形成重組質(zhì)粒p ET28a-bet；目的蛋白在大腸桿菌BL21中高效表達；純化得到預期大小的融合蛋白His-Beta；制備了特異性較高的Beta蛋白多克隆抗體，為進一步研究bet基因的功能和Beta蛋白在牛及其他真核生物同源重組過程中的應用奠定基礎。

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