絨山羊次級(jí)毛囊生長(zhǎng)調(diào)控基因的篩選

李曉燕，張 璐，王樂樂，鄔 嬌，宋慧子，涂藩鏡，張燕軍

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物遺傳育種與繁殖自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018）

絨山羊作為中國(guó)特色地方畜種，其絨毛具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是重要出口產(chǎn)品。研究絨毛生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，為絨產(chǎn)量與絨品質(zhì)提升提供理論基礎(chǔ)，對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有重要意義。絨毛是毛囊的衍生物，毛囊則是形態(tài)和結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的皮膚附屬結(jié)構(gòu)，由內(nèi)根鞘、外根鞘、真皮鞘、毛球和毛干幾個(gè)部分組成［1］。毛囊分為初級(jí)毛囊和次級(jí)毛囊，初級(jí)毛囊形成髓質(zhì)發(fā)達(dá)的粗毛，而次級(jí)毛囊產(chǎn)生無髓質(zhì)的絨毛。毛囊密度和次級(jí)毛囊與初級(jí)毛囊比值（S／P）隨羊的品種不同而存在很大差異［2］。絨山羊體表既生長(zhǎng)初級(jí)毛囊也生長(zhǎng)次級(jí)毛囊，而奶山羊的體表一般只有粗毛即只生長(zhǎng)初級(jí)毛囊，不生長(zhǎng)次級(jí)毛囊［3］。此外，哺乳動(dòng)物的毛囊呈周期性生長(zhǎng)，一般在一個(gè)生物年內(nèi)毛囊要經(jīng)歷生長(zhǎng)期、退行期和休止期3個(gè)階段［4］。研究發(fā)現(xiàn)，絨山羊次級(jí)毛囊生長(zhǎng)周期為一年，在4-11月份為生長(zhǎng)期，9月份進(jìn)入興盛期，12-1月份逐漸進(jìn)入退行期，2-3月份進(jìn)入休止期，但周期中各個(gè)時(shí)期界限并不絕對(duì)［5］。近年來，許多學(xué)者從分子水平上對(duì)次級(jí)毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理進(jìn)行探索，篩選出一些與次級(jí)毛囊生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)基因?qū)ζつw及毛囊發(fā)育的調(diào)控是一個(gè)多方位、多層次、多角度、多基因微效的時(shí)空動(dòng)態(tài)過程。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路在毛囊的發(fā)育和分化中起重要的作用［6］；SH H信號(hào)可能參與上皮細(xì)胞與間充質(zhì)細(xì)胞之間的信息交換，影響表皮分化和毛囊發(fā)育［7-8］；MAPK信號(hào)通路能夠調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡與炎癥反應(yīng)，EGF、FGF、PDGF、BDNF等為該途徑成員，以上成員均被證明參與毛囊生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控［9-13］；TGFβ1、TGF-β2、BMP2、BMP4等均為TGFβ超家族成員，被證明能夠影響毛囊周期性生長(zhǎng)，調(diào)控毛囊生長(zhǎng)周期［14-16］；此外，TNF信號(hào)途徑影響細(xì)胞的凋亡，參與毛囊的退行調(diào)控［17-18］；Notch通路能夠調(diào)控毛囊分化且與其他通路之間存在著緊密的聯(lián)系［19-20］。但是，絨山羊毛囊生長(zhǎng)發(fā)育與周期性變化的機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步深入研究。

本研究選取遺傳背景相似，以3、6、9、12月份絨山羊和奶山羊皮膚樣品為材料，運(yùn)用RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，結(jié)合KEGG等生物信息學(xué)方法，分析絨山羊與奶山羊差異表達(dá)基因及絨山羊4個(gè)時(shí)期之間差異表達(dá)基因，以期獲得調(diào)控次級(jí)毛囊周期性生長(zhǎng)相關(guān)調(diào)控基因，為次級(jí)毛囊生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制的闡明及絨纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的提升提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

根據(jù)絨山羊次級(jí)毛囊周期生長(zhǎng)變化特點(diǎn)，分別于3月份（休止期）、6月份（生長(zhǎng)期）、9月份（興盛期）、12月份（退行期）的中旬，在4只內(nèi)蒙古絨山羊成年母羊和4只薩能奶山羊成年母羊體側(cè)部位割取1 cm2左右大小的皮膚樣品，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 研究方法

用TRIZOL進(jìn)行樣品總RNA提取，所得總RNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)其純度，采用分光光度計(jì)（BioRad）檢測(cè)RNA的濃度和OD260nm／OD280nm的比值。純化RNA進(jìn)行mRNA捕獲，將捕獲的mRNA片段化，加入接頭進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄再擴(kuò)增。本試驗(yàn)將同一物種同一時(shí)期的4個(gè)體混為一個(gè)樣本混樣建庫，建好的測(cè)序文庫采用Illumina Hiseq2000進(jìn)行雙端測(cè)序。測(cè)序獲取原始序列，經(jīng)fastx-toolkit軟件去掉含有兩個(gè)N的reads，去掉序列中的adaptor，截掉低質(zhì)量值的reads，剩余的長(zhǎng)度仍在16 nt及其以上的reads為clean reads。將有效RNA-seq序列用Tophat2（http：／／goat.kiz.ac.cn／GGD／download.htm）以每個(gè)reads容1 nt的錯(cuò)配比對(duì)到山羊的參考基因組上，采用RPKM值表征每個(gè)基因的表達(dá)豐度，以消除mRNA長(zhǎng)度和樣本測(cè)序豐度差異帶來的偏差。選用軟件edgeR做基因的差異表達(dá)分析，認(rèn)定fold change≥2或≤0.5，P-value≤0.01為差異表達(dá)基因。使用WEGO（http：／／wego.genomics.org.cn）與KEGG（http：／／www.genome.jp／kegg／pathway.html）在線平臺(tái)對(duì)這些基因進(jìn)行功能及pathway分析。不同組織樣品的總RNA利用Prime Script RT reagent Kit（Ta KaRa公司）反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（TaKaRa公司）在MX3000P熒光定量PCR儀（Agilent公司）上采用SYBR green熒光染料法進(jìn)行Real time-PCR，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，采用相對(duì)定量2-ΔCt法進(jìn)行結(jié)果分析。所有實(shí)時(shí)定量試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，所得數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，Excel繪制基因表達(dá)量柱形圖，并用SAS7.0軟件進(jìn)行方差分析，P＜ 0.01為差異極顯著。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)基因的引物序列（表1），送上海生工生物工程有限公司合成。

表1 RT-qPCR引物Table1 List of primers used in RT-qPCR analysis

2 結(jié) 果

2.1 絨山羊及奶山羊皮膚轉(zhuǎn)錄組組裝

測(cè)序獲取原始數(shù)據(jù)去掉低質(zhì)量序列，獲得clean reads，本研究獲得有效clean reads均在28 435 878以上，為后續(xù)研究提供豐富的原始數(shù)據(jù)。將有效clean reads用Tophat2比對(duì)到山羊的參考基因組上，77%～82%的reads都能map上，其中90%～92%的reads為單位置比對(duì)，結(jié)果見表2。

表2 有效RNA-seq序列及山羊參考基因組定位Table 2 High-quality clean reads and mapping on the goat’s genome

2.2 差異表達(dá)基因篩選

采用RPKM值（Reads per kilo bases per million reads）表征每個(gè)基因的表達(dá)豐度，以消除mRNA長(zhǎng)度和樣本測(cè)序豐度差異帶來的偏差。通過差異表達(dá)基因（fold change≥2或≤0.5，P-value≤ 0.01）分析發(fā)現(xiàn)，絨山羊與奶山羊相同時(shí)期共有2 409個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中上調(diào)差異表達(dá)基因1 175個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因1 234個(gè)，絨山羊不同生長(zhǎng)時(shí)期顯著差異表達(dá)基因共550個(gè)，其中上調(diào)差異表達(dá)基因302個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因248個(gè)（表3）。

表3 各樣本差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 3 Total number of differentially expressed genes

2.3 差異基因的GO功能分類

對(duì)絨山羊與奶山羊同時(shí)期差異基因進(jìn)行GO注釋，從圖1可以看出，差異基因根據(jù)GO功能注釋分為細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過程3大類，在細(xì)胞組分中細(xì)胞、細(xì)胞部分與細(xì)胞器部分富集較顯著；在生物過程中細(xì)胞過程、生物調(diào)控以及代謝過程是最大的3個(gè)功能結(jié)點(diǎn)；而在分子功能中，結(jié)合所占比例最大，其次是催化，說明轉(zhuǎn)錄組序列與結(jié)合和催化相關(guān)的功能基因非常豐富。絨山羊不同時(shí)期差異基因GO功能注釋結(jié)果表明，差異表達(dá)基因再次顯著富集在以上功能，同絨山羊與奶山羊同時(shí)期差異基因GO注釋結(jié)果一致。

2.4 差異基因Pathway分析

利用KEGG平臺(tái)對(duì)DEG進(jìn)行pathway分析，更深入地了解基因功能及其之間的互相聯(lián)系，共42個(gè)基因富集在毛囊相關(guān)WNT、SH H、TGFβ、TNF、MAPK、Notch信號(hào)途徑中（表4），作為毛囊生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)候選功能基因，后期進(jìn)行功能驗(yàn)證研究。

2.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析

選取10個(gè)富集在WNT信號(hào)途徑中的差異表達(dá)基因WNT 11、WNT 16、FZD10、CTN NB1、VANGL 2、FOSL 1、MMP7、SFRP2、SFRP4和WIF 1進(jìn)行real-time PCR分析，檢測(cè)其在絨山羊4個(gè)發(fā)育時(shí)期mRNA表達(dá)情況（圖2）。與RNA-Seq測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，CTNNB1、SFRP4、WNT 16、MMP7、WIF 1、WNT 11、FZD10等7個(gè)基因表達(dá)模式與測(cè)序結(jié)果一致，說明測(cè)序所產(chǎn)生的差異表達(dá)基因生物學(xué)重復(fù)好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 討 論

圖1 絨山羊較奶山羊差異基因GO注釋Fig.1 Gene ontology of cashmere goat vs dairy goat differential expression genes

表4 富集于毛囊調(diào)控通路中的差異基因Table 4 DEG in hair follicle growth related pathway

本次測(cè)序共獲得38G數(shù)據(jù)，平均每個(gè)樣品4.7G，說明測(cè)序深度足夠，建庫質(zhì)量較好。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，單位置比對(duì)多數(shù)來自成熟的mRNA，多位置比對(duì)則以r RNA和t RNA為主，本研究獲得了90%～92%的單位置比對(duì)率，奠定了后續(xù)分析的準(zhǔn)確性。從8個(gè)樣品中檢出的山羊基因總數(shù)為20 780，而山羊參考基因組基因總數(shù)為21 389，推算覆蓋度達(dá)到97.15%，說明基因信息代表性充足。絨山羊與奶山羊相同時(shí)期共有2 409個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中上調(diào)差異表達(dá)基因1 175個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因1 234個(gè)，由于奶山羊并不具有次級(jí)毛囊，所以推測(cè)差異基因可能與次級(jí)毛囊生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)。絨山羊不同生長(zhǎng)時(shí)期顯著差異表達(dá)基因共550個(gè)，鑒于絨山羊毛囊呈周期性生長(zhǎng)，推測(cè)該550個(gè)差異基因可能調(diào)控次級(jí)毛囊的周期性生長(zhǎng)。差異表達(dá)基因GO分類結(jié)果與許騰發(fā)表的絨山羊皮膚毛囊生長(zhǎng)期與靜息期基因差異表達(dá)的研究成果相一致，表明差異表達(dá)基因可能通過結(jié)合與催化功能，參與生物調(diào)控、細(xì)胞過程、代謝過程等生物過程，調(diào)控毛囊生長(zhǎng)，但具體機(jī)制有待解析［21］。利用KEGG平臺(tái)對(duì)DEG進(jìn)行pathway分析，大量基因富集在代謝、疾病、細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相互作用等途徑中，但以上途徑與毛囊生長(zhǎng)的關(guān)系，有待深入研究。本研究結(jié)合前人研究成果，從已報(bào)道與毛囊生長(zhǎng)相關(guān)的WNT、SH H、TGFβ、TNF、MAPK、Notch等信號(hào)途徑中篩選出42個(gè)差異表達(dá)基因，推測(cè)其為毛囊生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)候選功能基因。

圖2 絨山羊不同時(shí)期部分WNT通路基因mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Part of WNT pathway gene relative expression levels in different period of cashmere

WNT信號(hào)通路是調(diào)控毛囊的起始發(fā)育和成纖維細(xì)胞的增殖的重要通路，Wnt分子能夠與位于細(xì)胞膜表面跨膜的Frizzle受體結(jié)合，激活胞質(zhì)dishevelled（Dvl），Dvl是組織細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的胞漿蛋白，能夠阻止胞質(zhì)內(nèi)游離的β連環(huán)蛋白（β-catenin）降解，β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)積累到一定量后進(jìn)入細(xì)胞核，與核內(nèi)淋巴樣增強(qiáng)因子及T細(xì)胞因子（LEF／TCF）形成復(fù)合物，激活下游FOSL 1、MMP7等基因的轉(zhuǎn)錄。本研究中有10個(gè)差異表達(dá)基因富集在該信號(hào)通路。分別是WNT 11、WNT 16、FZD10、CTNNB1、VANGL 2、FOSL 1、MMP7、SFRP2、SFRP4和WIF 1。WNT 11、WNT 16是Wnt家族成員，實(shí)時(shí)定量結(jié)果顯示較其他基因Wnt11與Wnt16的表達(dá)較低。FZD10是Frizzle卷曲蛋白家族成員，9月份有極顯著的上調(diào)（P＜0.01）與次級(jí)毛囊9月份進(jìn)入生長(zhǎng)興盛期表型相符。β-catenin基因在4個(gè)時(shí)期中的表達(dá)量要高于其他基因，在9月份表達(dá)量最高，且較3月份上調(diào)極顯著，6月份與12月份的表達(dá)量也顯著高于3月份（P＜0.05），同樣符合次級(jí)毛囊周期生長(zhǎng)規(guī)律。然而MMP7表達(dá)模式則相反，3月份表達(dá)量最高，之后各時(shí)期較前一時(shí)期表達(dá)量均下調(diào)。VANGL 2能夠指導(dǎo)Dvl在細(xì)胞中的定位，其作用模式與Frizzle導(dǎo)致Dvl激活類似，可能通過招募Dvl競(jìng)爭(zhēng)或促進(jìn)WNT信號(hào)通路［22］，呈現(xiàn)3、6、12月份的表達(dá)量均很低，9月份卻有顯著上調(diào)的表達(dá)模式。SFRP2及SFRP4均為FRP家族成員，因其結(jié)構(gòu)與Frizzle相似，能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制Wnt因子與Frizzle受體結(jié)合，從而影響下游基因激活［23］，SFRP2基因表達(dá)量在3月份較12月份有顯著上調(diào)，符合次級(jí)毛囊在3月份處于休止期，生長(zhǎng)確實(shí)受到抑制的現(xiàn)實(shí)。SFRP4表達(dá)量的變化同F(xiàn)OSL1一致，在3個(gè)時(shí)期中的表達(dá)量都較低，只有在6月份有顯著的上調(diào)。WIF 1是Wnt的抑制因子，可以直接與Wnt分子結(jié)合，抑制Wnt分子與受體細(xì)胞膜上的Frizzled受體及輔助受體LRP5／6形成三聚體復(fù)合物，從而抑制了信號(hào)傳導(dǎo)［24］。以上10個(gè)基因雖然在WNT信號(hào)通路中具有十分重要的作用，但除β-catenin之外，其余基因在毛囊生長(zhǎng)調(diào)控中的研究極少。

4 結(jié) 論

本研究以有次級(jí)毛囊的絨山羊和無次級(jí)毛囊的奶山羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，利用Illumina Hiseq 2000對(duì)絨山羊與奶山羊皮膚樣品進(jìn)行了RNA-Seq測(cè)序，共獲得38G數(shù)據(jù)，檢出20 780個(gè)山羊基因。通過差異表達(dá)基因分析發(fā)現(xiàn)，絨山羊與奶山羊相同時(shí)期共有2 409個(gè)差異表達(dá)基因，絨山羊不同生長(zhǎng)時(shí)期差異表達(dá)基因共550個(gè)。GO功能注釋分類顯示，差異表達(dá)基因主要在細(xì)胞與細(xì)胞部分、細(xì)胞器部分、結(jié)合、催化、生物調(diào)控、細(xì)胞過程、代謝過程等功能富集。KEGG pathway分析發(fā)現(xiàn)，42個(gè)差異表達(dá)基因富集在與毛囊生長(zhǎng)相關(guān)的WNT、SH H、TGFβ、TNF、MAPK和Notch信號(hào)通路中，由此推測(cè)其可能參與次級(jí)毛囊生長(zhǎng)調(diào)控過程。

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