HPLC-ELSD法測定葛蘭心寧軟膠囊中絞股藍皂苷XL IL的含量

閻　博，吳　芳，劉海靜，，唐瑜蓉，喬蓉霞

(1．陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽　712046；2.陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安　710061)

?

HPLC-ELSD法測定葛蘭心寧軟膠囊中絞股藍皂苷XL IL的含量

閻博1，吳芳2，劉海靜1，2，唐瑜蓉1，喬蓉霞2

(1．陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽712046；2.陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安710061)

摘要:目的建立以HPLC-ELSD法測定葛蘭心寧軟膠囊中絞股藍皂苷XL IX含量的方法。方法色譜柱為Kromasil C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈—水(35∶65)，檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器，流速2.8 L·min-1，漂移管溫度105℃。結(jié)果絞股藍皂苷XL IL的線性良好，Y(峰面積)=1.56X+5.25，r=0.999，平均回收率(n=6)為101.56%，絞股藍皂苷XL IX在0.513～10.254 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。。結(jié)論該方法專屬性強、重復(fù)性良好，可用于葛蘭心寧軟膠囊的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞:葛蘭心寧軟膠囊；HPLC；絞股藍皂苷XL IX；含量測定

葛蘭心寧軟膠囊處方由葛根總黃酮、山楂提取物和絞股藍總苷組成，有活血化瘀，通絡(luò)止痛的功效，用于瘀血閉阻所致的冠心病、心絞痛。絞股藍中主要含皂苷類成分，此外還含有黃酮類、氨基酸、糖、微量元素等成分。對機體代謝、應(yīng)激性反應(yīng)、抗癌作用、對神經(jīng)系統(tǒng)的影響、增強機體免疫功能。據(jù)文獻記載，絞股藍皂苷具有較好的抗癌作用并且能明顯提高小鼠空斑形成細胞和血凝抗體[1]；也有采用熒光光譜法研究絞股藍皂苷對人血清白蛋白(HSA)的猝滅作用[2]。葛蘭心寧軟膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未對絞股藍總苷進行質(zhì)量控制。絞股藍總苷的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中薄層色譜鑒別項和含量測定項均以絞股藍皂苷-A為對照品，但絞股藍皂苷-A對照品不能從中國食品藥品檢定研究院和其他機構(gòu)獲得，故目前標(biāo)準(zhǔn)中未對絞股藍總苷進行有效的控制。

葛蘭心寧軟膠囊是2012年國家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高行動計劃品種，根據(jù)國家藥典委員會要求，我們對處方中絞股藍總苷的質(zhì)量控制方法進行了研究。近年來我省食品藥品行業(yè)通過測定絞股藍皂苷XL IL的含量控制絞股藍總苷的質(zhì)量。我們使用購自西安鴻程生物科技有限公司的絞股藍皂苷XL IL對照品進行了以下含量測定方法學(xué)試驗，本文參考相關(guān)文獻[3-4]，采用HPLC-ELSD法測定絞股藍皂苷XL IL的含量，以對絞股藍相關(guān)制品質(zhì)量控制提高參考依據(jù)。

1儀器、試劑及試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(Waters HT系統(tǒng)、Waters Allance系統(tǒng))，Alltech 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器，德國塞多利斯公司BP2110電子分析天平，BS224S電子分析天平。

1.2試劑乙腈(色譜純，TEDIA公司)、葛蘭心寧軟膠囊(批號分別為20120221、20120222、20120223、20120224、20120225、20120226、20120227、20120228、20120229、20120231)、高純水，其余試劑均為分析純。

1.3樣品絞股藍皂苷XL IX對照品購自西安鴻程生物科技有限公司，批號為20100718，HPLC純度為99.9%。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱(Kromasil 100-5C18250 mm×4.6 mm,E59030)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35℃；Alltech ELSD 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器，流動相為乙腈—水(35∶65)，流速2.8 L·min-1，漂移管溫度105℃；理論板數(shù)按絞股藍皂苷XL IL峰計應(yīng)不低于2 000。

2.2溶液的配制

2.2.1對照品溶液的制備稱取80 ℃減壓干燥3 h的絞股藍皂苷XL IX對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備取本品10粒內(nèi)容物(盡量取盡膠囊內(nèi)壁殘留)，將內(nèi)容物混勻，取約1.5 g，置錐形瓶中，加10%甲醇40 mL，水浴回流40 min，用少量棉花濾過，用10 mL水洗滌玻璃容器和棉花，濾液合并于分液漏斗中，用乙醚40 mL振搖提取，棄去乙醚液，水液用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次40 mL，合并正丁醇液，再分別用氨試液30 mL和正丁醇飽和的水30 mL洗滌，棄去洗滌液。正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇并定容于10 mL容量瓶中，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3測定法分別精密吸取對照品溶液10、20 μL，與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，以外標(biāo)兩點法對數(shù)方程計算，即得。

2.3專屬性試驗按上述方法制備缺絞股藍總苷提取物的陰性溶液、對照品溶液、供試品溶液，分別進入液相色譜儀，陰性樣品的色譜圖在與絞股藍皂苷XL IX對照品色譜峰相同保留時間處未見明顯色譜峰,見圖1。

2.4線性關(guān)系考察稱取絞股藍皂苷XL IX 12.83 mg，置于25 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濃度為0.5132 g·L-1。按上述色譜條件進行測定，分別進樣1、2、4、6、8、10、15、20 μL，以對照品的進樣量(μg)對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為:Y(峰面積)=1.56X+5.25，r=0.999，結(jié)果表明絞股藍皂苷XL IX在0.513～10.254 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5重復(fù)性試驗取樣品(批號：20120226 )按供試品溶液的制備方法制備6份溶液進行測定。測得取樣量，代入公式計算。絞股藍皂苷XL IX的平均含量為每粒1.27 mg，RSD為2.1%。

2.6加樣回收率試驗精密稱定絞股藍皂苷XL IX 30.35 mg，置于25 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濃度為1.214 g·L-1。取6份上述對照品溶液2 mL置錐形瓶中，蒸干甲醇。取已知含量的樣品(批號：20120226)適量，精密稱定6份，分別置上述各錐形瓶中，按供試品溶液的制備方法制備溶液，測定回收率，結(jié)果得平均回收率為101.56%，RSD為2.4%。見表1。

表1　加樣回收率試驗結(jié)果

2.7精密度試驗取對照品溶液連續(xù)進樣6次進行測定。絞股藍皂苷XL IX的保留時間和峰面積RSD分別為0.2%和1.0%，表明精密度良好。

2.8穩(wěn)定性試驗取樣品(批號：20120226)按供試品溶液的制備方法制備5份溶液，分別于制備后0、5、10、15、19、22、26、31、35、40 h后測定峰面積，絞股藍皂苷XL IX含量的RSD為3.0%。表明樣品溶液在制備后40 h內(nèi)，絞股藍皂苷XL IX的量值穩(wěn)定。

2.9樣品測定采用上述2.1和2.2項下的方法，對 10批樣品進行含量測定，葛蘭心寧軟膠囊中絞股藍皂苷XL IX的含量為每粒1.28~1.40 mg。

3討論

3.1提取方法考察對提取溶劑甲醇、水、10%甲醇為溶劑分別進行了考察；對超聲、水浴回流等提取方式進行了考察；考察了水飽和正丁醇的提取2、3、4次的樣品的含量以及正丁醇飽和的水洗滌的效果進行了考察，根據(jù)樣品含量測定的結(jié)果，最終確定了以10%甲醇為提取溶劑進行水浴回流，以水飽和正丁醇提取3次后，以正丁醇飽和的水進行洗滌。

3.2轉(zhuǎn)移率測定取生產(chǎn)用的同批次絞股藍總苷的原料，測定其中絞股藍皂苷XL IX的含量，根據(jù)含量和處方量折算葛蘭心寧軟膠囊的理論值。實際測量值與理論含量的比值即為轉(zhuǎn)移率，測定的10批樣品的轉(zhuǎn)移率為87.5%~98.1%。

3.3關(guān)于絞股藍總苷的質(zhì)量控制方法據(jù)文獻報道：有人以參皂苷Rb1為對照，利用UV法測定含量測定[5-6]，以絞股藍皂苷為對照品進行定性鑒別[7]，進行HPLC法絞股藍皂苷含量測定時利用的對照品還有人參皂苷Rb1[8]、絞股藍中絞股藍皂苷B[9]、絞股藍皂苷A。還有采用SPME-GC-MS法對5個不同地區(qū)絞股藍中揮發(fā)性成分進行分析[10]。 以絞股藍皂苷XL IX為對照品進行質(zhì)量控制為首次報道。

參考文獻：

[1]李杰，楊舟，詹琤琤.絞股藍化學(xué)成分與藥理作用研究概況[J].湖北中醫(yī)雜志，2012，34(10):74-76.

[2]何麗君，霍彩霞，李生英,等.熒光光譜法研究絞股藍皂苷與人血清白蛋白的相互作用[J].甘肅聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2012，26(6)：41-51.

[3]李長根.HPLC-ELSD法測定十味芪術(shù)通竅合劑中黃芪甲苷含量[J].安徽醫(yī)藥,2013，17(3)：402-403.

[4]湯興球，汪伍承.HPLC-ELSD法同時測定煙腈丁醇片中鹽酸乙胺丁醇和異煙肼的含量[J].安徽醫(yī)藥，2012，16(5)：616-617.

[5]樂圓，肖婭萍，張寧,等.HPLC-ELSD法測定絞股藍中絞股藍皂苷A的含量[J].光譜實驗室，2010，19(5)：1734-1737.

[6]李風(fēng)華，陳素紅，呂圭源.7個不同產(chǎn)地絞股藍皂苷含量測定[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30(4)：887-888.

[7]熊野娟.復(fù)方絞股藍膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].藥物鑒定，2011，20(15)：29-30.

[8]陳丹,李柯,吳梅青,等.HPLC法測定湖南省不同產(chǎn)地絞股藍藥材中人參皂苷Rb1的含量[J].中國保健營養(yǎng)，2013，18(4)：557-558.

[9]劉春祥，張群，謝二磊，等.RP-HPLC法測定絞股藍中絞股藍皂苷B的含量[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2013(1)：7-9.

[10] ?？》澹I萍，姜東亮，等.5個不同地區(qū)絞股藍中揮發(fā)性成分的SPME-GC-MS 分析[J].藥物分析，2012，32(4)：578-582.

Determination of Gypenoside XL IL in Gelan

Xinning soft capsule by HPLC-ELSD

YAN Bo1，WU Fang2,LIU Hai-jing1，2，et al

(1.ShaanxiUniversityofChineseMedicine,Xianyang,Shaanxi712046，China;

2.ShaanxiInstituteforFoodandDrugControlDrugControl,Xi’an,Shaanxi710061，China)

Abstract:ObjectiveToestablishadeterminationmethodofGypenosideXLILinGelanXinningsoftcapsulebyHPLC-ELSD.MethodsSampleswereanalyzedonaKromasilC18column(250mm× 4.6mm，5μm).Themobilephasewasacetonitrile-water(35:65).TheELSDdetectorwasused,withaflowrateofatomizerat2.8L·min-1andthetemperatureofdrifttubewas105℃.ResultsThemethodhadalinearrelationshipintherangeof0.513～10.254μg(r=0.999)andtheaveragerecoveryratewas101.56%(n=6).ConclusionsThemethodishighlyspecific,accurate,sensitiveandreproducible,whichcanbeusedforthequalitycontrolofGelanXinningsoftcapsule.

Keywords:GelanXinningsoftcapsule;HPLC;GypenosideXLIL;determination

(收稿日期：2014-03-12，修回日期：2014-06-09)

通信作者：劉海靜，女，主任藥師，碩士生導(dǎo)師,研究方向：藥物分析,E-mail: liuhaijing1@163.com

作者簡介：閻博，女，碩士研究生

基金項目：陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(No 2013KTCQ03-14)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.015