基于HPLC-DAD方法建立的數(shù)字對照品庫檢索平臺用于雞蛋中四環(huán)素類藥物殘留的快速篩查

張　萍，吳　敏，湯　慧，朱應(yīng)成

(安徽省蕪湖市食品藥品檢驗所，安徽 蕪湖　241000)

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基于HPLC-DAD方法建立的數(shù)字對照品庫檢索平臺用于雞蛋中四環(huán)素類藥物殘留的快速篩查

張萍，吳敏，湯慧，朱應(yīng)成

(安徽省蕪湖市食品藥品檢驗所，安徽 蕪湖241000)

摘要：目的建立了同時檢測雞蛋中8種四環(huán)素類藥物殘留的HPLC-DAD方法，建立了它們的相對保留時間和多波長檢測的峰面積比值數(shù)據(jù)庫，通過數(shù)據(jù)庫建立了一個數(shù)據(jù)檢索平臺，并將其用于雞蛋中的四環(huán)素類藥物的殘留的快速篩查。方法先建立起一個同時檢測8種藥物的HPLC-DAD色譜分析方法，然后根據(jù)所得的HPLC-DAD色譜圖中對照品的信息，建立起一個包含各對照品的相對保留時間比值和多波長檢測峰面積比值的數(shù)據(jù)庫，并以此為基礎(chǔ)建立起一個檢索平臺；實際檢測時，如果樣品中出現(xiàn)可疑物質(zhì)，則可將疑似峰的保留時間和多波長檢測的峰面積輸入庫中進(jìn)行檢索，達(dá)到快速篩查的目的。結(jié)果8種四環(huán)素類藥物在建立的色譜條件下實現(xiàn)了完全分離；數(shù)字對照品檢索數(shù)據(jù)庫在實際檢測中，顯示出簡單方便，準(zhǔn)確可靠的優(yōu)勢。結(jié)論該方法建立的數(shù)字對照品庫可以代替實際對照品，在監(jiān)督現(xiàn)場對雞蛋中是否含有四環(huán)素類藥物殘留進(jìn)行快速篩查和檢定。

關(guān)鍵詞：雞蛋；四環(huán)素類藥物；殘留；數(shù)字對照品庫；現(xiàn)場快速篩查

Rapid determination of eight tetracycline residues in eggs by a

search platform using numerical reference substance database

四環(huán)素類是由鏈菌霉產(chǎn)生的一類廣譜抗菌素[1-3]，因其價格低、抗菌譜廣、飼料報酬高等優(yōu)點在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛地應(yīng)用。此類藥物主要包括四環(huán)素、土霉素、金霉素，脫氧土霉素、米諾環(huán)素等。 在我國對于此類藥物在動物養(yǎng)殖過程中的使用有嚴(yán)格的限制，但是一些養(yǎng)殖戶為了追求經(jīng)濟(jì)利益，長期違規(guī)使用此類抗生素，造成該類藥物在禽類產(chǎn)品中大量殘留，極大的影響了獸藥的治病療效，也給人的身體健康帶來嚴(yán)重危害。

雞蛋含有人體幾乎所有需要的營養(yǎng)物質(zhì)，被人們稱做“理想的營養(yǎng)庫”，每個人幾乎每天都會食用雞蛋，因而蛋品的安全是關(guān)系到億萬國民健康和生命的頭等大事。國內(nèi)外有關(guān)檢測四環(huán)素類藥物殘留的高效液相色譜法已有報道[4-6]，但多數(shù)檢測方法繁瑣、靈敏度偏低、尤其是在等度洗脫的狀態(tài)下只能同時檢測3~4種四環(huán)素類藥物。近年來，HPLC-MS/MS檢測四環(huán)素類藥物的報道亦逐漸增多[7-8]，但是由于其儀器昂貴、操作復(fù)雜，使用和維護(hù)費用高，對于日常的食品安全監(jiān)督來說不易推廣，因此并不是常規(guī)檢測的首選方法。

本文利用基層檢驗部門現(xiàn)有的檢測儀器，建立了能同時檢出8種四環(huán)素類藥物的HPLC-DAD檢測方法。另外借鑒了目前在中藥檢測中推廣的“一測多評”的方法[9-11]以及HPLC-DAD法中多波長定性測定法[12]的思路，以HPLC-DAD數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)建立了一個數(shù)字對照品數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫由8種藥物的相對保留時間比值和4個波長下的峰面積比值組成，在工作中它們可以代替實際對照品對樣品進(jìn)行快篩，可以一次性檢測多種殘留藥物，大大縮短了檢測時間，降低了檢測成本，提高了檢測效率，可以在普通實驗室中普及。另外本法的等度洗脫模式非常適用于快檢車載高效液相色譜儀。本研究為快速準(zhǔn)確的篩查雞蛋中的是否含有四環(huán)素類抗生素殘留藥物提供了一個很好的方法學(xué)參考。

1儀器與試藥

1.1儀器及主要設(shè)備Waters液相色譜儀(2998 PAD檢測器，Empower 2工作站)，Gemini C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱，Mettler XP205十萬分之一天平。

1.2試劑與對照品4-差向四環(huán)素 (130401-200209，含量測定用)，土霉素 (130487-200703，88.8%)，脫水差向四環(huán)素(130402-200203，含量測定用)，美他環(huán)素(130499-200101，90.1%)，鹽酸四環(huán)素 (130488-200403，97.5%)，多西環(huán)素(130405-200405，含量測定用)， 鹽酸金霉素 (130489-200202，95.3%)，米諾環(huán)素(130514-200401，85.1%)，上述對照品均來自中國食品藥品檢定研究院。

甲醇、乙腈均為色譜純，高氯酸酸為分析純，水為超純水。

1.3實驗樣品雞蛋樣品來自蕪湖的大型超市和農(nóng)貿(mào)市場，共取點20個，取樣品45批次，樣品類型有普通鮮雞蛋、山雞蛋、土雞蛋、草雞蛋、頭窩蛋和本雞蛋。

2方法與結(jié)果

2.1原理

2.1.1相對保留時間定性原理相對保留值α也叫選擇因子，是某組分X(待測物) 與另一組分 (參照物) 的調(diào)整保留值之比值(α =tRx/tR參)，在色譜條件一定的情況下，它只受柱溫和固定相的影響，與其它色譜操作條件無關(guān)，所以用α定性可以消除某些條件的影響，也是色譜學(xué)上使用廣泛的一種定性方法。在固定色譜操作條件下，可以在HPLC色譜圖上選擇一個色譜峰為內(nèi)參照峰，然后將同一色譜圖中其他各峰的保留時間與其相比得到一系列的相對保留值α，當(dāng)進(jìn)行未知物質(zhì)檢測時，在同樣的色譜條件下，若未知峰的相對保留值與其中某一個相對保留值α相同，則可認(rèn)為它們?yōu)橥晃镔|(zhì)。

2.1.2多波長定性原理朗伯-比耳定律為：A =kC，在高效液相色譜中，A表示峰面積，C為溶液的濃度，k為常數(shù)。在第1個波長處, 峰面積與濃度的關(guān)系為A1=k1C，在第2個波長處, 峰面積與濃度的關(guān)系為A2=k2C , 兩個波長的峰面積之比為A1/A2=k1C/k2C =k1/k2= 常數(shù)。在試驗中選擇靈敏度較高的4個波長, 計算其中1個的峰面積與其它3個峰面積之比, 得到的數(shù)值分別以R1，R2，R3表示。若色譜條件不變, 則每次測定的R1，R2，R3這一組數(shù)據(jù)也不變。依據(jù)這一組數(shù)據(jù)可對未知組分進(jìn)行準(zhǔn)確定性。

2.2方法

2.2.1對照品儲備液及混合對照品溶液的制備準(zhǔn)確稱取4-差向四環(huán)素，土霉素，脫水差向四環(huán)素，美他環(huán)素，鹽酸四環(huán)素，多西環(huán)素，鹽酸金霉素，米諾環(huán)素對照品各適量分別置于10 mL的容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋制至刻度，制成相應(yīng)的濃度約為1 g·L-1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，儲備液冷藏保存，保存期為2個月。

精密量取4-差向四環(huán)素，土霉素，脫水差向四環(huán)素，美他環(huán)素，多西環(huán)素對照品儲備液1 mL，鹽酸四環(huán)素和米諾環(huán)素對照品儲備液2 mL及鹽酸金霉素3 mL同置于20 mL的容量瓶中，加流動相稀釋至刻度即得混合對照品儲備液。

2.2.2雞蛋的處理取雞蛋兩枚，用料理機(jī)混勻后，取混勻樣品5 g，置錐形瓶中，精密加入5%高氯酸酸溶液25 mL，25℃超聲20 min，放冷至室溫后，取上清液過濾后備用。

2.2.3液相色譜條件取對照品的混合儲備液，過濾后進(jìn)液相色譜儀，色譜條件如下：色譜柱： Gemini C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：[0.15 mol·L-1醋酸銨溶液-0.01 mol·L-1EDTA-三乙胺(100 ∶10∶1)(用醋酸調(diào)節(jié)pH至8.5)]：乙腈(81∶19)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：DAD掃描范圍為190~400 nm，圖1為其中4個波長下的色譜圖。從圖中可以看出各色譜峰與其相鄰峰的分離度良好分離度值在1.5～5.8范圍內(nèi)。各峰的理論塔板數(shù)也較高，均不低于4 000。

圖18種四環(huán)素類藥物在不同波長處的色譜圖

注：1.4-差向四環(huán)素；2.土霉素；3.脫水差向四環(huán)素；4.美他環(huán)素；5.鹽酸四環(huán)素；6.多西環(huán)素；7.鹽酸金霉素；8.米諾環(huán)素。

2.3數(shù)字對照品譜庫的建立

2.3.1相對保留時間數(shù)據(jù)庫的建立實驗中將米諾環(huán)素選為內(nèi)參物質(zhì)，通過其他峰的保留時間和它進(jìn)行比較得到了一系列的相對保留值，結(jié)果如下表1。從表中的結(jié)果可以看出使用相同的色譜柱，每種物質(zhì)在不同的色譜儀上的相對保留值變化不大，表明使用同一根色譜柱，在相同的色譜條件下以相對保留值對色譜峰進(jìn)行定性準(zhǔn)確性良好。

2.3.2基于多波長測定的峰面積比值數(shù)據(jù)庫的建立多波長測定是HPLC-DAD方法中一種比較簡單的定性的方法。因各組分在不同波長處的峰面積之比為一組定值，故可選擇4個或多個靈敏度較高的波長進(jìn)行同時檢測，再選擇其中1個波長與其它波長處的峰面積相比，得到一組定值，建立起一個面積比值的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫。我們計算了355 nm波長處的峰面積與270 nm、370 nm和390 nm波長處峰面積的比值A(chǔ)270/A355，A370/A355，A390/A355，將這3個峰面積之比分別以R1，R2，R3表示，色譜圖見圖1。我們選擇不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，測定了8 種藥物在4個波長處的峰面積，計算了它們的峰面積之比，10次測定結(jié)果如表2。從表2中可以看出，10次測定的峰面積比均在一定的范圍內(nèi)。

2.3.3數(shù)字對照品庫檢索平臺的建立及樣品的檢測本文將“2.3.1”和“2.3.2”中相對保留時間比值和多波長測定的峰面積比值數(shù)據(jù)庫通過Excel表格的編程功能集成為一個8種四環(huán)素類藥物的數(shù)字對照品檢索平臺。在現(xiàn)場快篩時如果樣品中出現(xiàn)了可疑物質(zhì)，則可將樣品的HPLC-DAD色譜圖中可疑峰的保留時間和內(nèi)參米諾環(huán)素峰的保留時間輸入檢索平臺中的相對保留時間比值數(shù)據(jù)庫中，數(shù)據(jù)庫直接就會得出是否為以下的哪種可疑物質(zhì)；然后再將樣品可疑峰的多波長檢測的峰面積輸入檢索平臺的峰面積比值數(shù)據(jù)庫中，數(shù)據(jù)庫直接就會判定出該可疑物質(zhì)的具體品種。

表1　相同色譜柱上8種四環(huán)素類藥物在不同色譜儀上的相對保留時間比值

注：A為Gemini C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；B為Luna C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

表2　8種四環(huán)素類藥物在4個波長下的峰面積比一覽表

3討論

3.1色譜條件的選擇

3.1.1色譜柱的選擇考慮到方法應(yīng)用的通用性以及四環(huán)素類藥物的分子中大多數(shù)含酚羥基和烯酸型羥基，具有一定極性，所以選擇了檢測分析中常用的C18反相柱。本實驗考察了以下不同牌號的色譜柱，(1)Gemini C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱；(2)Luna C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱；(3) Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱；(4) Aglient ZORBAX SB C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)柱；(5) Kromasil C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)柱；(6)MG II C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)柱；結(jié)果表明8種藥物在長柱上都達(dá)到了基線分離，而在短柱上的有的峰還不能完全分開，因此實驗選用了長柱。

3.1.2流動相的選擇本實驗選用了幾種文獻(xiàn)報道的測定四環(huán)素類藥物的流動相體系包括：甲醇—水—草酸、甲醇—磷酸氫二鈉、乙腈—甲醇—醋酸、甲醇—乙腈—甲酸、醋酸銨—EDTA—三乙胺—乙腈，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8種組分在醋酸銨—EDTA—三乙胺—乙腈體系中色譜保留行為較好，另外還考察了此體系各溶液間的不同配比以及流動相pH值對檢測的影響，結(jié)果顯示在本法所用流動相體系下，各組分間的分離度均達(dá)到了要求，并且峰形也較好。

3.1.3檢測波長的選擇利用二極管陣列檢測器(DAD)，記錄190~400 nm波長段的光譜圖，通過觀察混合對照溶液在該波長段的3D光譜圖，發(fā)現(xiàn)在上述色譜條件下，在270、355、370和390 nm波長處8種物質(zhì)的信號值響應(yīng)較強(qiáng)，干擾較小，色譜分離度符合要求，因此選擇在將上述波長作為檢測波長。

3.2樣品前處理條件的選擇近年來對于雞蛋樣本前處理凈化方法已有報道[13-14]，大部分都采用三氯乙酸-MeIlvaine-EDTA 為提取液進(jìn)行多步提取，然后再過固相小柱凈化，最后用氮氣吹干后，再取合適的溶液進(jìn)行稀釋。這些方法都可以把基質(zhì)中的四環(huán)素類抗生素提取出來，但使用的提取體系比較復(fù)雜，另外還要經(jīng)過較為繁瑣的過柱、淋洗、蒸發(fā)、濃縮等過程，不但被測組分容易損失，而且不利于今后在監(jiān)督現(xiàn)場進(jìn)行快速檢驗。本實驗以5%高氯酸酸溶液為提取液，采用超聲方法提取四環(huán)素類藥物，提取液經(jīng)濾膜過濾后直接就可以進(jìn)樣，這種方法也可以獲得良好的提取效果，大大節(jié)約了凈化時間和檢測成本，非常有利于今后在食品監(jiān)督現(xiàn)場的快檢。

4結(jié)論

本實驗建立了等度洗脫模式下HPLC-DAD方法同時檢測雞蛋中8種四環(huán)素類藥物的高效色譜分析方法，然后利用HPLC-DAD色譜圖的信息建立了一個數(shù)字對照品庫的檢索平臺，此平臺可以用來快篩雞蛋中是否含有四環(huán)素類藥物的殘留。

本實驗建立起來的檢索平臺雖然只包含了8種藥物的數(shù)字對照品的數(shù)據(jù)，但是以此為方法學(xué)參考可以建立起包含更多種類的藥物殘留的綜合檢索平臺，為今后的食品安全監(jiān)督檢查提供更為便捷和準(zhǔn)確的快篩手段。

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based on HPLC-DAD spectrums

ZHANG Ping, WU Ming, TANG Hui,et al

(WuhuInstituteofFoodandDrug,Wuhu241000,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a rapid determination of eight tetracycline residues in eggs by HPLC-DAD, including 4-epianhydrotetracycline oxytraoycline, epitetracycline hydrochloride, methacycline, tetracycline, doxycycline, chlortetracycline and minocycline. Based on the HPLC-DAD spectrums, a numerical reference substance database including the adjusted relative retention times and the peak area rations was developed. A data search platform was integrated with the database and used for rapid screening of eight tetracycline residues in eggs. MethodsFirstly, HPLC-DAD spectrums were collected. Then a numerical reference substance database including the adjusted relative retention times and the peak area rations was established. Based on this database, a digital reference substance search platform was set up. For a suspicious substance in testing, we can compare its relative retention time and the peak area rations with the information in the database to identify this substance.Results8 tetracyclines were well separated based on the chromatographic conditions. This method has been successfully applied to real sample analysis.ConclusionThe reference substance database can be used to rapidly screen the eggs to judge whether the tetracycline residues are in eggs when surveillance on-site .

Key words:eggs; tetracycline; residues; numerical reference substance database; rapid screening

(收稿日期：2014-04-10，修回日期：2014-06-22).

基金項目：2012年安徽省食品藥品監(jiān)督管理局科研項目(No 009)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.014