正交試驗研究枇杷清肺顆粒的醇提工藝

汪海斌, 吳電彩，馬　玲,張　毅,陳師農(nóng)，孫　備，黃順旺,，宋少江

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥　230031；2.安徽省藥物研究所·安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，

安徽 合肥　230022；3.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽　110016)

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正交試驗研究枇杷清肺顆粒的醇提工藝

汪海斌1, 吳電彩1，馬玲2,張毅2,陳師農(nóng)2，孫備2，黃順旺2,3，宋少江3

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥230031；2.安徽省藥物研究所·安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，

安徽 合肥230022；3.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽110016)

摘要：目的優(yōu)選枇杷清肺顆粒的最佳醇提工藝。方法醇提工藝以鹽酸小檗堿含量和浸膏得率為指標(biāo),采用正交試驗優(yōu)選枇杷清肺顆粒最佳醇提工藝。結(jié)果醇提最佳工藝條件為加10倍量70%乙醇,回流提取3次, 每次2 h。結(jié)論優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定，主要有效成分轉(zhuǎn)移率高，為枇杷清肺顆粒的成型工藝研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：枇杷清肺顆粒；正交試驗；高效液相色譜法；鹽酸小檗堿

枇杷清肺飲是《外科大成》中的名方，由枇杷葉、黃連、黃柏等六味藥材組成。具清肺除痤、解毒散結(jié)之功效，用于治療痤瘡、粉刺[1-2]。原方用以湯劑，使用不便，為此，我們將湯劑改為顆粒劑。根據(jù)處方中藥材所含成分的理化性質(zhì)，我們對處方中黃連、黃柏、枇杷葉等五味藥材進(jìn)行醇提，以處方中黃連、黃柏藥材的主要有效成分鹽酸小檗堿含量與干浸膏得率為指標(biāo)[3]，考察不同濃度乙醇提取效率，優(yōu)選出最佳乙醇提取濃度；采用正交試驗考察醇提時加醇量、回流時間、回流次數(shù)對醇提工藝的影響，優(yōu)選出枇杷清肺顆粒醇提工藝的最佳條件。

1儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀；Waters-2998紫外檢測器；Waters Empower色譜工作站；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AR1140型電子天平(上海加惠儀器儀表有限公司)；真空干燥箱(上海越眾儀器設(shè)備有限公司)；微壓循環(huán)中藥煎藥機(北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

枇杷葉、黃連、黃柏等六味藥材均購自合肥市樂家老鋪中藥飲片有限公司，經(jīng)鑒定符合《中國藥典》2010年版相關(guān)項下規(guī)定。鹽酸小檗堿對照品(批號：0713-201212，含量測定用)購自中國藥品生物制品檢定所，乙腈、甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2乙醇提取工藝

2.1乙醇濃度考察枇杷清肺顆粒中的枇杷葉、黃連、黃柏等藥材所含有效成分大多溶于乙醇，且不易被破壞。首先，對乙醇提取的濃度進(jìn)行考察。稱取藥材(285 g)4份，分別加入10倍量不同濃度乙醇回流提取3次，每次1.5 h，回收乙醇至無醇味，濃縮后減壓干燥，得干膏，備用。以鹽酸小檗堿含量(C20H17NO4·HCl)、浸膏得率為指標(biāo)，實驗結(jié)果見表1。根據(jù)表1可知，50%的乙醇提取的浸膏得率最高，但其鹽酸小檗堿含量不高，而70%的乙醇提取鹽酸小檗堿含量最高，干浸膏得率適中，因此，選用70%乙醇作為提取溶劑。

表1　不同乙醇濃度的考察

2.2正交試驗設(shè)計[4]以鹽酸小檗堿、干浸膏率為指標(biāo)，選擇加醇量、回流時間、回流次數(shù)三個因素，每因素選取3個水平進(jìn)行L9(34)正交設(shè)計，因素水平見表2。

表2　乙醇提取因素水平表

2.3鹽酸小檗堿和干浸膏的提取按表1設(shè)計9組試驗，根據(jù)處方比例取枇杷葉等五味藥材285 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加一定量的乙醇，加冷凝管，加熱提取，停止加熱后，取下冷凝管，將提取液合并，濾過，濾液濃縮至稠浸膏,置恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，60℃減壓干燥至完全后,分別測定提取液中鹽酸小檗堿含量及干浸膏得率。

2.4鹽酸小檗堿含量測定[3]

2.4.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗COSMOSIL 5C18-MS-II柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱溫為室溫；流動相為乙腈：0.1 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液：0.025 mol·L-1十二烷基硫酸鈉溶液(50∶25∶25)；檢測波長為345 nm；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL；理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計算應(yīng)不低于5 000。

2.4.2對照品溶液的制備取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1 mL中約含鹽酸小檗堿0.1 mg，即得。

2.4.3供試品溶液的制備取本品約1 g，研磨成細(xì)粉，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸(100 ∶1)的混合溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，加甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定，即得。見圖1~2。

2.5正交試驗方法與結(jié)果按處方比例取藥材(285 g)，試驗安排及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3　乙醇提取工藝試驗安排及結(jié)果

表4　方差分析

由表3、4試驗結(jié)果方差可以看出，影響干浸膏得率的因素大小順序為C>A>B，得到最佳工藝條件A3B3C3，影響鹽酸小檗堿提取率的因素大小順序為C>B>A，得到最佳工藝條件A2B3C3。以干浸膏得率為考核指標(biāo)，因素C對檢測指標(biāo)具有極其顯著性影響(P<0.01)，因素A對檢測指標(biāo)具有顯著性影響(P<0.05),因素B對檢測指標(biāo)影響不顯著(P>0.05)；以鹽酸小檗堿提取率為考核指標(biāo)，因素C對檢測指標(biāo)具有顯著性影響(P<0.05)，因素A，B對檢測指標(biāo)影響不顯著(P>0.05)。

綜合考慮，兼顧干浸膏得率和鹽酸小檗堿提取率，確定醇提取最佳工藝為A3B3C3, 即10倍量70%乙醇回流提取3次, 每次2 h，合并煎液，濾過，濾液靜置，取上清液備用。

2.6工藝驗證取3份藥材，將A3B3C3組合平行試驗3次，結(jié)果見表5。

表5　最佳工藝條件驗證結(jié)果

上述試驗結(jié)果顯示：三組試驗的醇提干膏率平均為17.31%，鹽酸小檗堿提取率平均為88.68%，與上述正交試驗結(jié)果相吻合，證明醇提工藝穩(wěn)定合理。

3討論

3.1醇提工藝的選擇黃連、黃柏藥材中共有的主要有效成分小檗堿對金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、白喉桿菌、痢疾桿菌等均有抑制作用[5]。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道[6]：小檗堿水煎損失約60%～90%，濃縮再損失50%~60%，致使轉(zhuǎn)移到成品中的數(shù)量只有5%左右，而采用乙醇回流提取黃連、黃柏，小檗堿提取率增加到82%，建議：含有黃連或黃柏的中藥復(fù)方制劑,工藝過程中應(yīng)采取措施,或?qū)⒍巻为毺崛?或避免水提等,以避免鹽酸小檗堿的損失,提高成品含量。因此，本處方中黃連、黃柏、枇杷葉等五味藥材，我們采用醇提工藝。

3.2正交試驗指標(biāo)的選擇本品處方由六味藥材組成，其中鹽酸小檗堿為清肺除痤的主要有效成分之一，具有良好的醇溶性，其含量可反映醇溶性成分提出效果，因此選用鹽酸小檗堿含量作為醇提工藝正交試驗的主要考核指標(biāo)，本品為復(fù)方中藥制劑，干浸膏得率直接影響到制劑的成型性，因此我們選用干浸膏得率作為醇提工藝的考核指標(biāo)之一。

3.3含量測定方法的選擇有關(guān)小檗堿含量測定方法的文獻(xiàn)報道[5]有四苯硼鈉直接滴定法、酸性染料比色法、一階導(dǎo)數(shù)紫外光譜法、薄層層析—比色法、薄層掃描法、熒光掃描法、高效液相法、流動注射分析法等。我們采用高效液相色譜法測定本制劑中小檗堿的含量，該方法簡便、專屬、靈敏、重現(xiàn)性好。參考相關(guān)文獻(xiàn)[3]和試驗摸索，流動相選擇為乙腈∶0.1 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液∶0.025 mol·L-1十二烷基硫酸鈉溶液(50 ∶25 ∶25)，流速1.0 mL·min-1，結(jié)果鹽酸小檗堿峰保留時間適中，且分離度良好。

3.4鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率的計算依據(jù)中國藥典[7]，我們分別對處方中黃連、黃柏藥材中鹽酸小檗堿的含量進(jìn)行測定，同時根據(jù)處方中黃連、黃柏所占比例，計算出醇提優(yōu)化工藝得到的干膏中鹽酸小檗堿的含量，其轉(zhuǎn)移率穩(wěn)定在88%左右，轉(zhuǎn)移率高。

本試驗通過正交試驗設(shè)計，得出最佳醇提工藝，經(jīng)小試驗證，中試放大，干膏得率適中，有利于制劑成型，同時，鹽酸小檗堿提取率高，確保枇杷清肺顆粒的質(zhì)量和臨床療效。

參考文獻(xiàn):

[1]張源,黃艷.枇杷清肺飲加減治療尋常型痤瘡135例療效觀察[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2011,27(3)：334-335.

[2]蔡虹,黃桂香,趙雅梅,等.加味枇杷清肺飲治療馬拉色菌毛囊炎作用機理研究[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2012,18(22)：129-130.

[3]李菲,鄭國成,孔德憲，等.高效液相色譜法測定連蘇膠囊中鹽酸小檗堿含量[J].中國藥業(yè)，2012,21(10)：42-43.

[4]劉定遠(yuǎn) 主編.醫(yī)藥數(shù)理統(tǒng)計方法[M].3版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2002:135.

[5]鄭虎占.中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用(第5卷) [M]. 北京:學(xué)苑出版社，1998：4354,4671.

[6]魏剛,黃月純.鹽酸小檗堿在中藥制劑中的動態(tài)變化和含量分析[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2000,6(4):61-62.

[7]國家藥典委員會.中國藥典:(一部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:285-286.

Study on ethanol process for extraction of

Pipa Qingfei granules by orthogonal test

WANG Hai-bin1, WU Dian-cai1, MA Ling2,et al

(1.AnhuiUniversityofTCM，Hefei230031China; 2.AnhuiInstituteofMateriaMedica,

AnhuiProvincialKeyLaboratoryofR&DofChineseMedicine,Hefei,Anhui230022China)

Abstract：Objective To optimize the ethanol extracting process of Pipa Qingfei granules.Methods The obtaining rate of extraction and the content of the berberine were taken as indexes for the ethanol extraction process. The ethanol extraction process of Pipa Qingfei granules was optimized by orthogonal design.Results The optimal conditions for the ethanol extraction of Pipa Qingfei granules were using 10 times of 70% ethanol solution, reflux three times, 2 hours each time.Conclusion The optimal ethanol extracting method was stable, active ingredient had a high rate of transfer, and it could provide a basis for molding technology of Pipa Qingfei granules．

Key words：Pipa Qingfei granules；orthogonal test；HPLC；berberine

(收稿日期：2014-08-20，修回日期：2014-10-09)

通信作者：黃順旺，男，副主任藥師，研究方向：新藥研究與開發(fā)，E-mail：huangsw5503@163.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.005