聲動力治療對荷瘤鼠腫瘤微環(huán)境巨噬細(xì)胞的影響

王曉龍，王姍，鄭金華，郭福林

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聲動力治療對荷瘤鼠腫瘤微環(huán)境巨噬細(xì)胞的影響

王曉龍，王姍，鄭金華，郭福林

目的 檢測聲動力治療前后荷瘤鼠腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞數(shù)量以及細(xì)胞因子的變化。方法 選取12只BALB/C小鼠制備荷瘤模型，隨機(jī)分為2組，對照組6只，未予任何處理；SDT組6只，給予小鼠腹腔注射5-ALA(250mg/kg)，并進(jìn)行超聲照射，超聲強(qiáng)度為2.0W/cm2；2周后停止治療，檢測腫瘤生長情況及荷瘤鼠體質(zhì)量變化情況，并采用免疫組化染色檢測CD68及細(xì)胞因子IFN-γ和IL-10水平變化。結(jié)果 治療期結(jié)束2周時(shí)，對照組小鼠腫瘤體積為(810±78)mm3，SDT組為(432±58)mm3，SDT組腫瘤體積抑制率為46.67%。對照組小鼠體質(zhì)量為(24.00±0.58)g,SDT組小鼠為(24.20±0.61)g，2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比較，SDT組CD68表達(dá)水平提高(t=-3.756，P=0.032)，IL-10表達(dá)下降(t=8.015，P=0.01)，IFN-γ表達(dá)增高(t=-5.034，P=0.008)。結(jié)論 聲動力治療可影響腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞因子的變化。

聲動力治療；腫瘤微環(huán)境；巨噬細(xì)胞；BALB/C小鼠

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.03.019

聲動力治療基于超聲聯(lián)合聲敏劑的協(xié)同作用[1，2]，于1990年由Umemura等[3]首次提出。超聲波具有相對較低的組織衰減系數(shù)，具有非侵入性穿透深部生物組織的能力。此外，超聲波的能量可以聚焦在惡性腫瘤部位，從而局部激活優(yōu)先累積在腫瘤組織中的聲敏劑，造成對靶細(xì)胞的損傷，而對周圍健康組織的損害最小。目前，聲動力治療的研究主要集中在對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用[4～8]，引起腫瘤細(xì)胞凋亡[9～13]、自噬[14，15]和壞死等。但是聲動力治療對腫瘤微環(huán)境，尤其是腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)的影響仍然不明確。腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞屬于固有免疫相關(guān)重要的免疫細(xì)胞，在免疫激活的過程中，腫瘤微環(huán)境的巨噬細(xì)胞最先被激活，成為抗腫瘤免疫的重要橋梁?，F(xiàn)通過檢測CD68、IFN-γ 與IL-10表達(dá)的變化探討聲動力治療對移植腫瘤微環(huán)境巨噬細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)試劑：聲敏劑5-氨基酮戊酸(5-amino-levulinic acid,5-ALA)購自西格瑪奧德里奇公司；多克隆兔抗CD68、IFN-γ和IL-10試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。(2)腫瘤細(xì)胞：人舌鱗癌細(xì)胞SAS細(xì)胞(Health Science Research Resources Bank，大阪，日本)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中,放置于37℃、5%CO2濕度孵箱內(nèi)。(3)器械：超聲治療儀由哈爾濱工業(yè)大學(xué)自主制造。參數(shù)分別為1.1 MHz、2.0 W/cm2、10 %占空比。天平購買于長沙市秋龍儀器設(shè)備有限公司。(4)動物：雄性BALB/C無胸腺小鼠，12只，4周齡，購買于中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 模型制備 將SAS細(xì)胞懸液(1×106細(xì)胞/ml)于小鼠右側(cè)背部皮下注射，當(dāng)移植瘤生長至 100 mm3, 對荷瘤鼠進(jìn)行治療。

1.3 治療方案 體質(zhì)量相近、背部腫瘤大小均一的BALB/C荷瘤小鼠12只，隨機(jī)分為2組，對照組6只：未予任何處理；SDT組6只：5-ALA濃度為250 mg/kg，小鼠腹腔注射，避光下飼養(yǎng)孵育4 h 后，超聲強(qiáng)度為2.0W/cm2；對皮下腫瘤進(jìn)行局部超聲照射治療，此操作在黑暗條件下進(jìn)行，目的為避免光線照射引起動物皮膚炎性反應(yīng)的發(fā)生。每個(gè)腫瘤照射時(shí)間為5 min，每周1、4治療，2周后停止。

1.4 觀測項(xiàng)目 治療期間每天均用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑和寬徑，并計(jì)算出腫瘤體積大小，繪制腫瘤生長曲線。用天平測量荷瘤小鼠體質(zhì)量，并繪制體質(zhì)量變化曲線。腫瘤體積=(π/6)× A × B2(A和B分別是腫瘤的長、寬徑)。

1.5 計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)分析 實(shí)驗(yàn)染色指標(biāo)經(jīng)過Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行定量轉(zhuǎn)換。用40×目鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，通過軟件計(jì)算每張圖片的積分光密度值，取其平均值作為指標(biāo)定量數(shù)值。所有積分光密度值從小到大排列后分為4等分：積分光密度值0～25%為陰性表達(dá)，>25%～50%為弱陽性表達(dá)，>50%～75%為中等陽性表達(dá)；>75%～100%為強(qiáng)陽性表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤生長情況 經(jīng)過治療，對照組荷瘤鼠腫瘤體積為(810±78)mm3，SDT組腫瘤體積為(432±58)mm3，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療期結(jié)束2周時(shí)，SDT組腫瘤體積的抑制率為46.67%。見圖1。

注：與對照組比較，aP<0.05圖1 聲動力治療對腫瘤體積的影響

2.2 體質(zhì)量變化 對照組小鼠體質(zhì)量為(24.00±0.58)g,SDT組小鼠體質(zhì)量為(24.20±0.61)g，2組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖2。

圖2 聲動力治療對小鼠體質(zhì)量的影響

2.3CD68、IL-10和IFN-γ表達(dá)CD68、IL-10和IFN-γ表達(dá)于免疫細(xì)胞的細(xì)胞漿中，呈現(xiàn)棕黃色染色顆粒。CD68出現(xiàn)在移植瘤的周邊。IL-10表達(dá)主要集中在腫瘤間質(zhì)中，腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞中散在中等量的IL-10陽性細(xì)胞，經(jīng)過SDT治療后腫瘤實(shí)質(zhì)中散在的IL-10幾乎消失轉(zhuǎn)而集中在腫瘤邊緣表達(dá)。值得注意的是，對照組腫瘤發(fā)生壞死部位無法充分激活免疫細(xì)胞釋放IFN-γ，而經(jīng)過SDT處理后，IFN-γ大量出現(xiàn)在腫瘤碎片中,在不發(fā)生壞死的區(qū)域內(nèi)對照組較少表達(dá)IFN-γ，SDT組中散在出現(xiàn)IFN-γ陽性細(xì)胞(圖3見封3)。與對照組比較，SDT組CD68表達(dá)水平升高(t=-3.756，P=0.032)，IL-10表達(dá)下降(t=8.015，P=0.01)，IFN-γ表達(dá)增高(t=-5.034，P=0.008)。見圖4。

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01 圖4 2組CD68、IL-10、TFN-γ表達(dá)的比較

3 討 論

聲動力治療是光動力療法基礎(chǔ)之上發(fā)展起來的腫瘤治療方法，一定頻率的超聲波結(jié)合聚集在腫瘤細(xì)胞中的聲敏劑，可引起腫瘤細(xì)胞的凋亡、自噬和壞死的發(fā)生。以往關(guān)于聲動力治療的研究也主要集中在聲動力治療對腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞的損傷上。不可否認(rèn)的是當(dāng)腫瘤細(xì)胞在受到損傷沖擊后必定會引起腫瘤微環(huán)境免疫系統(tǒng)的震蕩。Galon等[16]研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)目前對于腫瘤局部免疫狀態(tài)的評估是對于預(yù)后更加準(zhǔn)確的判定指標(biāo)，對于臨床患者的預(yù)后評估以及開展腫瘤生物學(xué)治療都具有重要的意義。因此了解SDT治療對腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)的影響對SDT深入免疫治療提供了研究依據(jù)。

聲動力治療對腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞及其相關(guān)因子的研究，檢測指標(biāo)為CD68、IL-10和IFN-γ。首先，通過荷瘤鼠腫瘤大小的變化證實(shí)了聲動力治療在抑制腫瘤生長方面具有顯著性，聲動力治療引起腫瘤細(xì)胞的凋亡、自噬或者壞死。腫瘤細(xì)胞死亡引起巨噬細(xì)胞的增加是聲動力治療方式引起的主要表現(xiàn)。CD68主要在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表面表達(dá)，通過免疫組化檢測CD68發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞在聲動力治療后顯著增加[17，18]。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，CD68的過高表達(dá)可能會影響一些腫瘤患者的預(yù)后而在另一些腫瘤中則不存在這種意義。這可能與腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的性質(zhì)有關(guān)?，F(xiàn)有研究已經(jīng)表明M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的存在可能加強(qiáng)了患者的不良預(yù)后。因?yàn)镃D68也表達(dá)在一些M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞上，所以單純檢測CD68高表達(dá)對抗腫瘤免疫是積極的并不充分；同時(shí)Wang等[19]發(fā)現(xiàn)在一小部分沒有顯著M2型巨噬細(xì)胞的口腔鱗狀細(xì)胞癌的患者中，依然存在不良預(yù)后的表現(xiàn)，于是我們檢測了細(xì)胞因子IL-10和IFN-γ。

IL-10是一種多細(xì)胞源、多功能的細(xì)胞因子，目前公認(rèn)為炎性反應(yīng)與免疫抑制因子，在體內(nèi)的來源主要是單核巨噬細(xì)胞與輔助性T細(xì)胞，它能夠顯著地抑制單核巨噬細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，降低炎性反應(yīng)的規(guī)模，在促進(jìn)腫瘤免疫耐受方面起作用。本研究顯示SAS細(xì)胞系建立的裸鼠移植瘤模型中，聲動力治療可以較充分地抑制IL-10的釋放，這也從側(cè)面說明活動在移植瘤周圍的巨噬細(xì)胞可能具有更為積極的抗腫瘤作用。在我們建立的B16F10黑色素瘤鼠模型中，發(fā)現(xiàn)IL-10在經(jīng)過SDT后表達(dá)也呈現(xiàn)上升[20]。而這種“矛盾”的原因可能為移植瘤所選擇的腫瘤細(xì)胞系不同，另外更為重要的是多種分泌IL-10的細(xì)胞必須受到特定的刺激，受損的組織類型和某種免疫反應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)不同也可能是結(jié)果不同的原因[21]。

IFN-γ的生物學(xué)功能主要是免疫調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)多種抗原提呈細(xì)胞表達(dá)MHC-I/II分子，活化單核、巨噬細(xì)胞。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SDT組中IFN-γ數(shù)量出現(xiàn)顯著增加，對照組IFN-γ數(shù)量較少，在發(fā)生壞死的組織周圍也極少能觀察到IFN-γ。在SDT組，細(xì)胞碎片周圍散在大量的IFN-γ，這說明雖然2組都表現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞的死亡，但是經(jīng)過SDT的介入能夠充分地刺激IFN-γ的產(chǎn)生，而IFN-γ的出現(xiàn)是刺激巨噬細(xì)胞等相關(guān)免疫細(xì)胞活化的基礎(chǔ)，故在SDT組中CD68表達(dá)升高，這說明IFN-γ的高表達(dá)極有可能激活了腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞表達(dá)，而這些巨噬細(xì)胞所呈現(xiàn)的性質(zhì)應(yīng)為抗腫瘤免疫特質(zhì)。在下一步的研究中，我們將會觀察荷瘤鼠預(yù)后情況，以期更加充分說明SDT對荷瘤鼠治療效果的影響。

總之，聲動力治療作為一種具有前途的方法不僅能夠引起腫瘤細(xì)胞的死亡，而且還會引起腫瘤免疫的發(fā)生。本次實(shí)驗(yàn)僅探討了巨噬細(xì)胞和2個(gè)細(xì)胞因子的變化，初步認(rèn)定SDT治療引起的免疫變化是積極的，為開展以聲動力治療為基礎(chǔ)的免疫治療提供一些參考。

(志謝：感謝哈爾濱工業(yè)大學(xué)聲光診療室提供的超聲治療儀器)

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Effect of sonodynamic therapy on tumor mircoenvironment macrophages in SAS bearing mice

WANGXiaolong*,WANGShan,ZHENGJinhua,GUOFulin.

*DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,FirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,ChinaCorrespondingauthor:GUOFulin,E-mail:Flguo1967@126.com

Objective To detected the changes in the number of macrophages in tumor bearing mice in the tumor microenvironment and cytokine before and after sonodynamic therapy.Methods Selected 12 BALB/C miceto establish tumor model, they were randomly divided into 2 groups, 6 rats in the control group, without any treatment; 6 rats in SDT group, mice were given intraperitoneal injection of 5 ALA (250 mg/kg), and ultrasound irradiation, ultrasonic intensity was 2.0 W/cm2; 2 weeks after stopping treatment, the growth of tumor and tumor bearing mice body weight changes were detected, and immunohistochemical staining was used to detect changes of CD68 and cytokine IFN-γ and IL-10 level.Results At the end of the treatment period of 2 weeks, the control group rats’ tumor volume was (810±78) mm3, SDT group was (432±58) mm3, SDT group’s tumor volume inhibition rate was 46.67%.Body weights of the control group mice was (24.00±0.58) g, SDT group mice was (24.20±0.61) g, the difference between the 2 groups had no statistical significance (P>0.05).Comparedwiththecontrolgroup,theexpressionlevelofCD68inSDTgroupwasincreased(t=-3.756,P=0.032),IL-10expressionwasdecreased(t=8.015,P=0.01),expressionofIFN-γwasincreased(t=-5.034,P=0.008).Conclusion Sonodynamic therapy can change the number of cytokines in the tumor microenvironment of macrophage.

Sonodynamic therapy; Tumor microenvironment; Macrophages;BALB/C rats

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.11511168)

150001 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科(王曉龍、郭福林)； 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室(王姍、鄭金華)

郭福林，E-mail:Flguo1967@126.com

2014-11-21)