SPE-UHPLC測定淀粉及淀粉制品中丁烯二酸類酸度調(diào)節(jié)劑

別 瑋, 李小林, 張朝暉, 郝 欣

（北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，北京 100026）

SPE-UHPLC測定淀粉及淀粉制品中丁烯二酸類酸度調(diào)節(jié)劑

別 瑋, 李小林, 張朝暉*, 郝 欣

（北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，北京 100026）

建立固相萃取-超高效液相色譜法測定淀粉及淀粉制品中的順丁烯二酸、順丁烯二酸酐和反丁烯二酸含量的檢測方法。樣品經(jīng)ProElut PWA混合型弱陰離子交換固相萃取柱凈化，超高效液相色譜分析，采用Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱，洗脫液為φ（磷酸）=0.10%水溶液與甲醇的體積比為98∶2，檢測波長214 nm，流速0.2 mL·min-1。在此條件下，順反丁烯二酸分離良好且無雜質(zhì)峰干擾，樣品加標回收率83.81%～108.03%，相對標準偏差（n=8）小于10%，順丁烯二酸和反丁烯二酸的定量限為0.25 mg·kg-1，能夠滿足實際檢測需要。

淀粉；順丁烯二酸；反丁烯二酸；順丁烯二酸酐；固相萃??；超高效液相色譜

淀粉是指以谷類、薯類、豆類為原料，不經(jīng)過任何化學方法處理，也不改變淀粉內(nèi)在的物理和化學特性加工制成的食用淀粉，包括谷類淀粉、薯類淀粉和豆類淀粉［1］。淀粉是葡萄糖的高聚體，在餐飲業(yè)又稱芡粉。人類膳食中最為豐富的碳水化合物就是淀粉。淀粉制品是指以谷類、薯類、豆類或其制成的食用淀粉為原料，經(jīng)多道工序加工制成的淀粉制品，包括粉絲、粉條、粉皮［2］。

順丁烯二酸俗稱馬來酸（maleic acid），順丁烯二酸酐俗稱馬來酸酐（maleic anhydride），可用于制造食品接觸的包裝材料［3］。我國食品安全國家標準GB 2760—2011《食品添加劑使用標準》未將順丁烯二酸和順丁烯二酸酐列為食品添加劑，它們屬于非法添加物。由于順丁烯二酸酐與食用淀粉結(jié)合后可產(chǎn)生糊化溫度低、黏度高、穩(wěn)定性好、黏膠性強的改性淀粉，因此不法生產(chǎn)商將順丁烯二酸酐添加到食品級改性淀粉中，用以增加食物的彈性、黏性及外觀光亮度。反丁烯二酸又稱富馬酸（fumaric acid），在食品、醫(yī)藥和化工等領域廣泛運用。反丁烯二酸是GB 2760—2011中允許使用的食品添加劑，常用作酸度調(diào)節(jié)劑，可用于生濕面制品、焙烤食品餡料及表面用掛漿、面包、糕點、餅干等含淀粉類食品，在餅干和糕點中最大使用量為3.0 g/kg［4］。

2013年5月13日，臺灣地區(qū)“衛(wèi)生署”發(fā)布公告，多家臺灣食品生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的粉圓等食品中檢測出順丁烯二酸，經(jīng)查證確認系淀粉中違法使用順丁烯二酸酐所致。據(jù)調(diào)查，順丁烯二酸（酐）在大陸也發(fā)現(xiàn)大量出售信息，并且不少以食品添加劑的名義出售。順丁烯二酸酐遇水會轉(zhuǎn)化成順丁烯二酸，順丁烯二酸對人體會產(chǎn)生一定危害，據(jù)歐盟評估資料，成人每公斤體重順丁烯二酸的每日耐受量（tolerable daily intake，TDI）為0.5 mg，以60 kg的成年人計算，每日食用量不應超過30 mg［3］。

上述事件曝光后，順丁烯二酸（酐）的檢測成為關(guān)注焦點，但由于順丁烯二酸和食品中允許使用的反丁烯二酸互為同分異構(gòu)體，分子量和分子式相同，理化性質(zhì)近似，吸收光譜圖也一致，在檢測中容易出現(xiàn)假陽性。因此，在檢測順丁烯二酸的同時，需要同時檢測反丁烯二酸，以減少誤判，因此研究建立多種食品中順丁烯二酸（酐）和反丁烯二酸的檢測方法具有重要的現(xiàn)實意義。

近年來，反丁烯二酸作為食品中的酸度調(diào)節(jié)劑應用較廣，因此國內(nèi)外有關(guān)食品中對其含量檢測的文獻報道較多［5-10］，但對于分離檢測淀粉和淀粉制品中反丁烯二酸含量的報道不多。順丁烯二酸（酐）的檢測方法主要集中在色譜法［11-15］，我國現(xiàn)有的國家標準GB/T 23296.21—2009也是采用高效液相色譜及內(nèi)標法對食品模擬物中順丁烯二酸及順丁烯二酸酐進行分離與測定［14］。但文獻報道的色譜法檢測順丁烯二酸（酐）的前處理不適于復雜基質(zhì)。本文針對前處理方法進行了系統(tǒng)的研究，建立了適用于淀粉和淀粉食品中順丁烯二酸、順丁烯二酸酐和反丁烯二酸含量測定的固相萃取-超高效液相色譜分析方法，方法易于操作，便于推廣。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ProElut PWA型固相萃取小柱（500 mg/6 mL），中國迪馬科技；HSS T3型Waters Acquity色譜柱，（2.1 mm×150 mm×1.8 μm），美國Waters公司；0.2 μm微孔濾膜（Whatman，nylon，Puradisc 13），美國GE公司；甲酸，φ=96%，色譜純，美國ROE公司；氨水，分析純，北京化工廠；乙腈，色譜純，美國Fisher公司；甲醇，色譜純，美國Fisher公司；超純水，自制；磷酸，色譜純，中國迪馬科技。

標準物質(zhì)順丁烯二酸和反丁烯二酸，純度均大于99.0%，美國Arocs公司。由于順丁烯二酸酐遇水即水解，在提取后儀器實際檢測的為順丁烯二酸，所以購買的標準品僅為順丁烯二酸。

實驗所選用樣品的面條、粉絲、芋圓、珍珠粉圓、木薯淀粉、紅薯淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、小麥粉等均購自超市。

1.2 儀器與設備

Nexera LC-30A型超高效液相色譜儀，配有二極管矩陣紫外檢測器及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，日本Shimadzu公司；3k15型高速冷凍離心機，德國Sigma公司；KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；MS 3 basic型旋渦混合器，德國IKA公司；Milli-Q型超純水儀，美國Millipore公司；Omni THQ型數(shù)字組織均質(zhì)機，美國Omni公司；電子分析天平（感量0.000 1 g），德國Sartorius公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

分別準確稱取順丁烯二酸和反丁烯二酸，用超純水溶解后，容量瓶定容，配成500 mg/L的標準儲備液，4℃冷藏。使用前用φ（磷酸）=0.1%水溶液分別稀釋制0.10，0.20，0.50，1.00，5.00，10.00，20.00，30.00，50.00 mg/L的標準工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

芋圓、珍珠粉圓屬于黏性大的淀粉樣品是準確稱取樣品2.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入甲酸水溶液（pH值=5）25 mL，用組織均質(zhì)機在提取液中均質(zhì)樣品2 min。

紅薯淀粉、粉絲等其他黏性小的淀粉樣品是固體類的淀粉樣品用粉碎機磨碎后，準確稱取樣品2.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入甲酸水溶液（pH值=5）25 mL，用旋渦混合器渦旋2 min混勻。

將處理過的樣品超聲提取10 min后，離心，取上清溶液5 mL于ProElut PWA柱（預先用5 mL甲醇、5 mL φ（甲酸）=2%的水溶液活化處理過），以1 mL·min-1的流速過柱，再依次加入淋洗液5 mL φ（甲酸）=2%水溶液、5 mL乙腈和5 mL甲醇，用10 mL φ（氨水）=8%的甲醇溶液洗脫，控制洗脫液流速不超過1 mL·min-1，收集洗脫液，在45℃水浴中氮吹至近干，加入1 mL φ（磷酸）=0.1%水溶液復溶，溶液經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾，濾液供UHPLC分析。

1.3.3 色譜條件

流動相φ（磷酸）=0.10%水溶液與甲醇的體積比為98∶2；流速0.2 mL/min；柱溫30℃；進樣量10 μL；檢測波長214 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動相的選擇

用反相色譜分析順丁烯二酸、反丁烯二酸時，為了使分析物盡可能地以分子形式存在，通常需控制流動相的pH值來抑制其離子化，使其在反相柱上得到保留，從而達到分離的目的。通過文獻檢索，常用的流動相為磷酸鹽和磷酸水溶液，分別考察了磷酸二氫鉀（用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.0）和φ（磷酸）= 0.1%水溶液這2種流動相，色譜峰峰型和分離度均較好，但φ（磷酸）=0.1%水溶液配制簡單易行，所以實驗選用φ（磷酸）=0.1%水溶液為流動相。

2.1.2 色譜柱的選擇

考察了Phenomenex Luna C18色譜柱和Waters HSS T3色譜柱，結(jié)果表明，混合標準品進樣時，Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱能較好地分離待測組分。后者顯示出對極性化合物具有更好的保留同時對非極性化合物不產(chǎn)生過強的保留，它能夠耐受100%的純水流動相不會出現(xiàn)“柱塌陷”的問題，而且在低pH流動相條件下具有極好的柱壽命。結(jié)合待測化合物極性和流動相條件，選擇Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱。

2.2 提取條件的選擇

2.2.1 對高黏性基質(zhì)的處理

某些淀粉類食品如芋圓、珍珠粉圓等熟制后黏性較大，用粉碎機粉碎效果較差，在提取液中分散效果也不好，不利于目標化合物的提取。針對上述問題，采用Omni THQ數(shù)字組織均質(zhì)機在提取液中對上述樣品進行均質(zhì)，可使基質(zhì)均勻分散于提取液中，可得到較好的提取效果。

2.2.2 提取液的選擇

結(jié)合文獻和順丁烯二酸、反丁烯二酸的理化性質(zhì)，對水、φ（乙醇）=5%水溶液、φ（甲酸）=2%水溶液和pH值=5甲酸水溶液這4種提取液對淀粉及淀粉制品的陰性加標樣品的提取效率進行考察，結(jié)果如圖1，φ（甲酸）=2%水溶液（pH值=2.5）和pH值=5甲酸水溶液對順、反丁烯二酸的提取率均能達到90%以上，由于順丁烯二酸的pKa1=1.92，pKa2=6.23，反丁烯二酸的pKa1=3.02，pKa2=4.38，為使順丁烯二酸和反丁烯二酸在提取液中盡可能的離子化，有利于下一步的固相萃取凈化，選擇pH值=5甲酸水溶液。

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

2.3.1 固相萃取柱的選擇

鑒于順丁烯二酸和反丁烯二酸的pKa值，實驗分別考察了Oasis WAX、Oasis HLB、ProElut PWA、Strata SAX和Strata X-AW這5種固相萃取柱對順丁烯二酸和反丁烯二酸回收率的影響，結(jié)果如圖2，ProElut PWA對順丁烯二酸和反丁烯二酸的回收率都能達到80%以上，故選擇ProElut PWA固相萃取柱。

圖1 不同提取溶劑對提取效率的影響Fig.1 Effects of different extraction solutions on extraction yield

圖2 固相萃取小柱對順丁烯二酸和反丁烯二酸回收率的影響Fig.2 Effects of different solid phase extraction cartridges on recoveries of maleic acid and fumaric acid

2.3.2 洗脫溶劑及用量對回收率的影響

對于混合型弱陰離子交換小柱，常見的洗脫溶劑為φ（氨水）=5%甲醇溶液，但對目標化合物的回收率稍差，在70%～76%之間。因此考慮增加氨水濃度，配制8%氨水甲醇溶液能夠?qū)⒛繕嘶衔锿耆疵?，回收率?5%～97%之間，但洗脫液pH值偏大，因此采用流動相0.1%的磷酸水溶液進行復溶后上機，可避免目標化合物在堿性條件下出現(xiàn)離子化現(xiàn)象。

實驗對洗脫液的用量進行了研究，以3 mL為單位，分別收集3，6，9，12 mL的洗脫液時，回收率分別為54.61%，74.32%，94.64%和96.18%，所以實驗選擇洗脫液體積為10 mL，既節(jié)省溶劑，又提高了檢出限。

2.4 線性范圍、標準曲線和定量限

分別配制一系列濃度的順丁烯二酸和反丁烯二酸的混合標準溶液按1.3.1節(jié)進行配制，順丁烯二酸的回歸方程y=86 610.0x-5 344.64，相關(guān)系數(shù)0.9997，線性范圍0.10～50 mg/L，定量限0.25 mg/kg；反丁烯二酸的回歸方程y=110 202x+2 505.95，相關(guān)系數(shù)0.999 6，線性范圍0.10～50 mg/L，定量限0.25 mg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度測定

選取馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉、小麥粉、木薯淀粉、玉米淀粉、粉絲、面條、芋圓和珍珠粉圓共9種樣品基質(zhì)，分別添加一定量的順丁烯二酸和反丁烯二酸的標準溶液，按1.3節(jié)方法進行3個水平的加標回收率測定，每一加標水平平行測定5次，考察方法的回收率和精密度，同時做樣品空白實驗。結(jié)果表明，不同樣品在不同加標水平下的回收率較穩(wěn)定。加標回收率和精密度見表1。標準品的超高效液相色譜見圖3。圖4為加標樣品直接進樣和加標樣品凈化后進樣的色譜圖比較，由圖可看出，凈化后的樣品基質(zhì)干擾顯著降低，雜質(zhì)峰個數(shù)明顯減少。

表1 順丁烯二酸和反丁烯二酸在9種樣品基質(zhì)中的回收率和相對標準偏差Tab.1 Recoveries and RSDs of maleic acid and fumaric acid in spiked samples

2.6 實際樣品的檢測

利用本方法對市場上采購的玉米淀粉（2份），馬鈴薯淀粉（2份），木薯淀粉（2份），粉絲（2份），魚丸（2份）和芋圓（2份）進行順丁烯二酸（酐）和反丁烯二酸含量的測定，未發(fā)現(xiàn)有非法添加順丁烯二酸的樣品，添加反丁烯二酸的檢測結(jié)果均在GB 2760—2011允許的添加范圍內(nèi)。

圖3 0.10 mg·L-1的順丁烯二酸和反丁烯二酸標準品的超高效液相色譜圖Fig.3 UHPLC/DAD chromatogram of 0.10 mg·L-1maleic acid and fumaric acid

圖4 未經(jīng)凈化處理和經(jīng)固相萃取凈化的1.50 mg·kg-1紅薯淀粉加標的超高效液相色譜圖Fig.4 UHPLC/DAD chromatograms of 1.50 mg·kg-1maleic acid and fumaric acid in sweet potato starch without/with SPE purification

3 討論與結(jié)論

以上實驗結(jié)果表明，本方法結(jié)合實際應用，以常見的淀粉及淀粉制品，如馬鈴薯淀粉，玉米淀粉，粉絲和珍珠粉圓等為研究對象，采用固相萃取（SPE）這種簡便、快速的樣品前處理凈化技術(shù)和超高效液相色譜法，建立了淀粉及淀粉制品中順丁烯二酸（酐）和反丁烯二酸的系統(tǒng)、有效且快捷的前處理技術(shù)平臺和高靈敏度的快速、準確且易操作的含量檢測方法。通過對上述各種實驗條件的優(yōu)化選擇，本方法的定量限為0.25 mg·kg-1，優(yōu)于參考文獻中給出的定量限（結(jié)果比對見表2）［5，11-12］。

表2 與文獻的實驗結(jié)果對比Tab.2 Comparison of experimental results with references

因此，本方法準確性、重復性良好，適用于淀粉及淀粉制品中順丁烯二酸（酐）和反丁烯二酸的含量的批量檢測。

［1］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.關(guān)于印發(fā)糖果制品等13類食品生產(chǎn)許可證審查細則的通知（國質(zhì)檢監(jiān)〔2004〕557號）［EB/OL］.（20051026）［20140801］http：∥www.hfgjj.com/n7216006/ n9417014/n9417487/n9423044/n9423277/9473889.html.

［2］Ann C E.Starch in food：structure，function and applications［M］.Cambridge：Woodhead Publishing，2004：57-81.

［3］European Union.No 10/2011 on plastic materials and articles intended to come into contact with food［S］.Aberdeen：Official Journal of the European Union，2011.

［4］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 2760—2011食品安全國家標準食品添加劑使用標準［S］.北京：中國標準出版社，2011.

［5］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.SN/T 2007—2007進出口果汁中乳酸、檸檬酸、富馬酸含量檢測方法高效液相色譜法［S］.北京：中國標準出版社，2007.

［6］Jessika H.Analysis of low-molecular-mass organic acids using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2003，988（1）：127-133.

［7］Silvia S，Inés M，José F H，et al.Rapid determination of minority organic acids in honey by high-performance liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2002，955（2）：207-214.

［8］Ching Lin Hsu，Wang Hsien Ding.Determination of lowmolecular-weight dicarboxylic acids in atmospheric aerosols by injection-port derivatization and gas chromatogra-phy-mass spectrometry［J］.Talanta，2009，80（2）：1025 -1028.

［9］Mato I，Suárez-Luque S，Huidobro J F.A review of the analytical methods to determine organic acids in grape juices and wines［J］.Food Research International，2005，38（10）：1175-1188.

［10］Stella R，Anna K，Heli S，et al.Determination of the carboxylic acids in acidic and basic process samples by capillary zone electrophoresis［J］.Journal of Chromatography A，2010，1217（8）：1407-1413.

［11］李紅艷，陳萬勤，王瑾，等.高效液相色譜法測定淀粉及淀粉制品中的順丁烯二酸與順丁烯二酸酐總含量［J］.分析測試學報，2012，31（8）：1013-1016.

［12］蒙泳，黎德勇，甘露，等.高效液相色譜法測定淀粉中的順丁烯二酸［J］.洛陽理工學院學報：自然科學版，2012，22（2）：1-4.

［13］高翠英，李彥威，賈皓旭.色譜法同時測定富馬酸和馬來酸的含量［J］.廣東化工，2008，35（8）：140-143.

［14］李金昶，赫奕，孫顏，等.用反相高效液相色譜法分離和測定丁烯二酸的順反異構(gòu)體［J］.分析測試學報，2000，19（2）：72-76.

［15］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T 23296.21—2009食品接觸材料高分子材料食品模擬物中順丁烯二酸及順丁烯二酸酐的測定高效液相色譜法［S］.北京：中國標準出版社，2009.

Determination of Maleic Acid and Fumaric Acid in Starch and Starch Products Using SPE-UHPLC Method

BIE Wei， LI Xiaolin， ZHANG Zhaohui*， HAO Xin
（Inspection and Quarantine Testing Center of Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China）

In the present study，a solid-phase extraction ultra high performance liquid chromatographic（UHPLC）method was established for the analysis of maleic acid，fumaric acid，and maleic anhydride in starch and starch products.Starch samples were cleaned up by ProElut PWA mixed-mode weak anion exchanger SPE columns.Waters Acquity UPLC HSS T3 was used for chromatographic separation and the separation condition was 0.10%phosphoric acid aqueous solution and methanol（98∶2，V/V），detection wavelength 214 nm，and flow rate 0.2 mL·min-1.The average spiked recoveries were in the range of 83.81%and 108.03%with RSDs（n=8）less than 10%and the LOQs of maleic acid and fumaric acid were 0.25 mg·kg-1.The method could satisfy with the requirement for the determination of maleic acid and fumaric acid in actual samples.

starch；maleic acid；fumaric acid；maleic anhydride；solid-phase extraction；ultra high performance liquid chromatography

李 寧）

TS237

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.05.009

2095-6002（2015）05-0052-06

別瑋，李小林，張朝暉，等.SPE-UHPLC測定淀粉及淀粉制品中丁烯二酸類酸度調(diào)節(jié)劑［J］.食品科學技術(shù)學報，2015，33（5）：52-57.

BIE Wei，LI Xiaolin，ZHANG Zhaohui，et al.Determination of maleic acid and fumaric acid in starch and starch products using SPE-UHPLC method［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（5）：52-57.

2014-09-24

北京檢驗檢疫局科技計劃項目（2013BK002）；“十二五”國家農(nóng)村領域國家科技計劃課題（2011BAD23B05-4）。

別 瑋，女，工程師，碩士，主要從事食品添加劑和非法添加物檢測方面的研究；*張朝暉，男，高級工程師，博士，主要從事食品安全檢測方面的研究。通信作者。