殼寡糖對擴(kuò)展青霉菌體生長和毒素分泌量的影響

姜 辣, 王麗婷, 陳海燕, 孟祥紅

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

殼寡糖對擴(kuò)展青霉菌體生長和毒素分泌量的影響

姜 辣, 王麗婷, 陳海燕, 孟祥紅*

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

為了更加全面評價(jià)殼寡糖作為抑菌劑對病原菌生長和毒素合成之間的內(nèi)在相關(guān)性，采用液體培養(yǎng)的方式，通過靜止培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，探究了殼寡糖在不同溫度培養(yǎng)條件下對擴(kuò)展青霉菌體生長和展青霉素分泌的影響。結(jié)果表明，靜止培養(yǎng)中5，10 g/L殼寡糖可明顯促進(jìn)菌體生長，但抑制了毒素的分泌；靜止培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，相同濃度的殼寡糖在4，16，25℃培養(yǎng)條件下對菌體生長的影響不同，但是均抑制了毒素分泌；不同溫度培養(yǎng)條件下，擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量的大小按培養(yǎng)溫度排序?yàn)?6，4，25℃。因此將殼寡糖用于果蔬采后病害控制時(shí)，需要注意貯藏的溫度，同時(shí)需要考慮其對毒素分泌的影響，以期達(dá)到抑菌效果和食用安全性。該研究可為殼寡糖在果蔬采后病害控制中的應(yīng)用提供參考。

殼寡糖；擴(kuò)展青霉；展青霉素；生長

一直以來，采后病原微生物的侵染是造成果蔬采后腐爛變質(zhì)的主要原因，其中擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）是最主要的病原真菌之一，它不僅會(huì)引起水果腐爛，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］，還會(huì)產(chǎn)生一種次級代謝產(chǎn)物——展青霉素（patulin）。展青霉素是一種聚酮真菌毒素，具有潛在的細(xì)胞和動(dòng)物毒性，存在致畸性、致癌性和免疫毒性［2］。該毒素普遍存在于受展青霉素污染的水果及其制品中，可通過食物鏈進(jìn)入人體［3］，嚴(yán)重危害人體健康。食品中展青霉素的殘留問題已引起世界衛(wèi)生組織的高度關(guān)注，許多國家已經(jīng)制定了相關(guān)法規(guī)，并對其最高限量做了嚴(yán)格的規(guī)定。例如，歐盟規(guī)定食品中展青霉素的最大限量為50 μg/kg，嬰兒食品中要求更高，規(guī)定其展青霉素的最大限量為10 μg/kg［4］。

目前，使用化學(xué)殺菌劑仍然是控制采后病害的主要手段，但化學(xué)殺菌劑引起的農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染以及病原菌耐藥性的問題，已引起全社會(huì)廣泛關(guān)注［5］。因此，尋求安全、高效的抑菌物質(zhì)代替化學(xué)殺菌劑，控制果蔬采后病害，逐漸成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。殼寡糖是殼聚糖經(jīng)過降解后，聚合度為2～20，分子質(zhì)量一般低于5 000 u的衍生物。它不僅具有殼聚糖無毒、可生物降解和生物相容性等特性，還具有良好的水溶性，更容易被吸收利用［6］。殼寡糖作為一種聚陽離子的多糖化合物，具有廣譜的抑菌活性。有研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖對細(xì)菌、酵母、真菌都有很好的抑菌活性［7-9］，同時(shí)，殼寡糖還能激發(fā)果實(shí)的防御系統(tǒng)，誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)生抗病性［9］，因此，將其開發(fā)成一種新型的殺菌保鮮劑具有安全廣闊的應(yīng)用前景。有關(guān)殼寡糖的抑菌作用，已有的研究主要集中在殼寡糖對抑制菌絲的生長，孢子的萌發(fā)、芽管的伸長和真菌毒力因子產(chǎn)生等不同的生理階段［10］的影響方面，但有關(guān)殼寡糖對真菌生長及毒素分泌之間相關(guān)性方面的研究卻鮮有報(bào)道。

本研究擬運(yùn)用液體培養(yǎng)的方式，通過靜止培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，揭示殼寡糖在不同溫度培養(yǎng)條件下對擴(kuò)展青霉菌體生長和展青霉素分泌的影響，以期為殼寡糖在果蔬采后病害控制中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

擴(kuò)展青霉由實(shí)驗(yàn)室從感染青霉病的發(fā)病蘋果果實(shí)中分離純化，回接驗(yàn)證所得（經(jīng)鑒定編號為M1），于4℃PDA斜面培養(yǎng)基中保存；殼寡糖乙酰化度2%～10%，分子質(zhì)量小于2 000 u，大連中科格萊克生物技術(shù)有限公司；乙腈（Merck，德國）和冰乙酸為色譜純，其他試劑均為分析純（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma，美國，純度≥98%）；超純水（Millipore，美國）。

1.2 主要儀器設(shè)備

BMJ-250C型霉菌培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BK5000-LEDR型光學(xué)顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司；Agilent-1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；IS-RDS3型恒溫振蕩器，美國精騏有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海榮生化學(xué)儀器廠；YGC-12型氮吹儀，鄭州寶晶電子科技有限公司；酸度計(jì)，滅菌鍋，無菌操作臺。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 擴(kuò)展青霉孢子懸浮液及殼寡糖母液的制備

將擴(kuò)展青霉接種到新鮮PDA斜面上，25℃下培養(yǎng)7 d后，加入無菌生理鹽水，將菌落表面的孢子刮下，用滅菌的4層紗布過濾除去菌絲等雜質(zhì)，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子濃度調(diào)整至106CFU/mL。

準(zhǔn)確稱量2.5 g殼寡糖粉末，經(jīng)紫外殺菌后，在無菌操作臺中加入無菌水中，待殼寡糖在水中完全溶解后，定容到100 mL，制備成質(zhì)量濃度為25 g/L的殼寡糖溶液。

1.3.2 擴(kuò)展青霉菌體生長和產(chǎn)毒實(shí)驗(yàn)

取不同體積的殼寡糖母液按照比例加入到滅菌的PDB母液中，制備成殼寡糖質(zhì)量濃度為0，1.0，5.0，10.0 g/L的PDB培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為自然狀態(tài)?；靹蚝笠悦科?0 mL添加量置于250 mL無菌錐形瓶中，接入0.4 mL濃度為1×106CFU/mL的擴(kuò)展青霉孢子懸浮液［11］。將錐形瓶置于25℃，相對濕度90%的霉菌培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)第2，4、6，8，10 d取樣，抽濾收集菌體，于60℃下烘干至恒重，稱重。量取10 mL抽濾所得濾液，用于提取測量展青霉素含量，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，重復(fù)3次。

將殼寡糖質(zhì)量濃度為0，5 g/L的處理組分別置于25，16，4℃，濕度為90%的霉菌培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，分別于2，3，20 d后開始取樣，以后分別隔2，3，5 d取樣，用來測定不同溫度培養(yǎng)條件下擴(kuò)展青霉菌體重量和展青霉素含量變化，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

另將殼寡糖質(zhì)量濃度為0，5 g/L的處理組分別置于25，4℃的搖床（200 r/min）中進(jìn)行培養(yǎng)，分別于2，15 d后開始取樣，以后分別隔2，3 d取樣，用來測定搖床培養(yǎng)條件下擴(kuò)展青霉菌體重量和展青霉素含量變化，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 展青霉素的測定

展青霉素測定采用高效液相色譜法。展青霉素的提取與測定參照測定方法［12］，并稍做修改。向待測樣品中加入15 mL乙酸乙酯震蕩提取1 h，靜置分層后，收集上層的乙酸乙酯相。重復(fù)2次，合并有機(jī)相，加入10 mL Na2CO3溶液15 g/L，震蕩1 min，靜置分層后，再用10 mL的乙酸乙酯對Na2CO3層提取1次，合并乙酸乙酯提取液，于40℃水浴上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至液體剩余1～2 mL，將濃縮液轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，于40℃下氮?dú)獯蹈桑?.0 mL pH值為4.0的乙酸水溶液溶解殘留物，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，用HPLC進(jìn)行測定。測定條件：色譜柱 Agilent SBC18柱，250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm；流動(dòng)相，乙腈-水（體積比10∶90）；流速 1.0 mL/min；柱溫 30℃；檢測波長 276 nm；進(jìn)樣量 20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)所有處理均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS（Version 20.0）軟件進(jìn)行。比較兩個(gè)以上數(shù)據(jù)時(shí)，采用單因素方差分析，且先對平均數(shù)進(jìn)行Levene's等方差性分析。若方差齊性，則用Ducan's檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較；若不滿足方差齊性，則用Dunnett's T3檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。比較兩個(gè)平均數(shù)時(shí)，采用雙獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。p＜0.05時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖濃度對擴(kuò)展青霉菌體生長和毒素分泌量的影響

液體培養(yǎng)方式下，不同濃度殼寡糖對擴(kuò)展青霉菌體生長和毒素分泌量的影響，結(jié)果如圖1。由圖1（a）可見，在培養(yǎng)的2～4 d內(nèi)，擴(kuò)展青霉菌體生長迅速，與對照組相比，不同濃度的殼寡糖對擴(kuò)展青霉菌體生長并沒有顯著性影響。但是隨著時(shí)間的延長，質(zhì)量濃度為5，10 g/L的殼寡糖處理組卻明顯地促進(jìn)了菌體的生長，且呈現(xiàn)濃度依賴性，而質(zhì)量濃度為1 g/L的殼寡糖處理組與對照組沒有顯著性差異。與對照相比，殼寡糖處理組延緩了菌體生長達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間。菌體在生長的過程中會(huì)分泌毒素，隨著時(shí)間的推移，毒素含量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。與對照組相比，殼寡糖處理能夠降低菌體對毒素的分泌，與其他濃度相比，5 g/L的殼寡糖處理組對毒素分泌的抑制效果最大（圖1（b））。為了能夠更加準(zhǔn)確的判斷殼寡糖濃度對毒素分泌量的影響，我們分析了單位菌體產(chǎn)毒量，它能更好的比較菌體分泌毒素能力的變化。由圖1（c）可見，1 g/L的殼寡糖處理組與對照組相比沒有顯著性差異，高濃度的殼寡糖能夠降低擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量，但是5，10 g/L的殼寡糖處理組除培養(yǎng)第8，10天外差異并不明顯。與毒素含量變化趨勢一致，隨著時(shí)間的延長，擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。說明殼寡糖處理能降低擴(kuò)展青霉的展青霉素分泌量。其中5 g/L的殼寡糖對降低擴(kuò)展青霉的展青霉素分泌量有較好的效果。

2.2 不同溫度培養(yǎng)條件下殼寡糖對擴(kuò)展青霉菌體生長和毒素分泌量的影響

選擇4，16，25℃作為培養(yǎng)溫度，主要是因?yàn)?℃是目前普遍使用的果蔬產(chǎn)品低溫貯藏溫度，而江曙等［11］報(bào)道20～30℃均有利于菌體的生長，其中25℃為最適溫度，而16℃作為一個(gè)中間溫度被考慮來用于測定擴(kuò)展青霉菌體生長和展青霉素分泌的情況。液體培養(yǎng)方式及不同溫度培養(yǎng)條件下，殼寡糖對擴(kuò)展青霉菌體生長和毒素分泌量的影響結(jié)果如圖2。

圖1 液體培養(yǎng)方式下不同濃度殼寡糖對擴(kuò)展青霉菌體生長和毒素分泌量的影響Fig.1 Effects of oligochitosan with different concentrations on mycelial growth and content of patulin of P.expansum cultured in liquid medium

圖2 液體培養(yǎng)方式及不同溫度培養(yǎng)條件下，殼寡糖對擴(kuò)展青霉菌體生長和毒素分泌量的影響Fig.2 Effects of oligochitosan on mycelial growth and content of patulin of P.expansum cultured in liquid medium under different temperatures

由圖2可見，不同溫度培養(yǎng)條件下，殼寡糖對擴(kuò)展青霉菌體生長的影響并不相同。在25℃與16℃培養(yǎng)條件下，5 g/L殼寡糖處理組促進(jìn)了擴(kuò)展青霉菌體的生長，且這種促進(jìn)作用具有時(shí)間依賴性。在擴(kuò)展青霉菌體生長時(shí)期，隨著時(shí)間的延長，促進(jìn)作用一直增加，當(dāng)達(dá)到穩(wěn)定期后，促進(jìn)作用保持穩(wěn)定。25℃培養(yǎng)條件下，在菌體生長后期，殼寡糖處理組擴(kuò)展青霉菌體干重有下降的趨勢，16℃培養(yǎng)條件下，殼寡糖處理組擴(kuò)展青霉菌體干重呈現(xiàn)先上升后保持平穩(wěn)的趨勢，但是在培養(yǎng)后期，殼寡糖處理組擴(kuò)展青霉菌體干重明顯高于對照組（圖2（a）、2（c））。由圖2（e）可以看出，與25℃和16℃培養(yǎng)條件下菌體生長情況不同，4℃培養(yǎng)條件下，殼寡糖能夠明顯抑制擴(kuò)展青霉菌體的生長，在菌體生長的過程中，殼寡糖處理組菌體干重始終明顯地低于對照組。但在培養(yǎng)的后期，5 g/L殼寡糖處理組菌體質(zhì)量有降低的趨勢。上述現(xiàn)象說明，在4℃的培養(yǎng)條件下可能更有利于殼寡糖發(fā)揮抑菌作用。

與殼寡糖對擴(kuò)展青霉菌體生長的影響作用并不相同，不同溫度培養(yǎng)條件下，殼寡糖對展青霉素的分泌均有較好的抑制作用。在25℃和16℃培養(yǎng)條件下，5 g/L殼寡糖處理組的擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量均明顯低于對照組（圖2（d）、2（f））。而4℃的培養(yǎng)條件下，除第35天殼寡糖處理組單位菌體產(chǎn)毒量高于對照組外，其他時(shí)間殼寡糖處理組均能夠降低單位菌體產(chǎn)毒量（圖2（b））。不同溫度培養(yǎng)條件下，擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量的大小按培養(yǎng)溫度排序?yàn)椋?6，4，25℃。

2.3 搖床培養(yǎng)條件下殼寡糖對擴(kuò)展青霉菌體生長和毒素分泌量的影響

16℃與25℃靜止培養(yǎng)條件下，殼寡糖對擴(kuò)展青霉菌體生長和毒素分泌的影響具有一致性，因此選擇了4℃和25℃作為搖床培養(yǎng)的條件來用于測定擴(kuò)展青霉菌體生長和展青霉素分泌的情況，結(jié)果如圖3。由圖3（a）可以看出，在4℃搖床培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)的前15天，殼寡糖能夠明顯抑制擴(kuò)展青霉菌體生長，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，殼寡糖處理組與對照組菌體干重沒有顯著性差異。25℃搖床培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)的前2天，殼寡糖能夠抑制擴(kuò)展青霉菌體生長，但與4℃殼寡糖對擴(kuò)展青霉菌體生長的影響不同，隨著時(shí)間的增加，殼寡糖能夠明顯地促進(jìn)擴(kuò)展青霉菌體的生長（圖2（c））。4℃和25℃搖床培養(yǎng)條件下，擴(kuò)展青霉菌體干重均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，且菌體干重的最大值要顯著高于靜止培養(yǎng)。4℃搖床培養(yǎng)條件下，擴(kuò)展青霉的菌體生長曲線也要明顯的早于靜止培養(yǎng)。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，搖床培養(yǎng)條件下，菌體產(chǎn)孢少，且菌體容易聚集并呈現(xiàn)橢圓形小球的現(xiàn)象。

由圖3（b）可以看出，與靜止培養(yǎng)殼寡糖對擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量的影響相同，4℃搖床培養(yǎng)條件下，殼寡糖處理組擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量明顯的低于對照組，而25℃搖床培養(yǎng)條件下，殼寡糖處理組除第4，6天擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量與對照組相當(dāng)外，其他時(shí)間均明顯低于對照組（圖3（d））。說明在搖床培養(yǎng)條件下，殼寡糖對降低展青霉毒素的分泌也有較明顯的效果。與靜止培養(yǎng)條件下擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量變化趨勢一致，搖床培養(yǎng)條件下擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量也呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。但是與靜止培養(yǎng)相比，25℃搖床培養(yǎng)條件下，其擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量要明顯降低，可能與產(chǎn)孢量少有關(guān)。而4℃搖床培養(yǎng)條件下，對照組的擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量的最大值高于靜止培養(yǎng)4℃培養(yǎng)條件下的最大值。可能與菌體處于低溫的不利環(huán)境中，會(huì)增加毒素等次級代謝產(chǎn)物的分泌量有關(guān)。搖床培養(yǎng)條件下，擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量的大小按培養(yǎng)溫度排序?yàn)?，25℃。

圖3 液體培養(yǎng)方式下?lián)u床培養(yǎng)對殼寡糖對擴(kuò)展青霉菌體生長和毒素分泌量的影響Fig.3 Effects of oligochitosan on mycelial growth and content of patulin of P.expansum cultured in liquid medium under shaking conditions

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，液體培養(yǎng)方式下，不同濃度的殼聚糖對擴(kuò)展青霉的菌體生長和毒素分泌的影響并不一致。1 g/L的殼寡糖處理組對擴(kuò)展青霉菌體生長和毒素分泌的影響與對照組相比，沒有顯著性差異，說明低濃度的殼寡糖對擴(kuò)展青霉菌體生長和毒素分泌不會(huì)造成影響。但是隨著濃度的升高，5 g/L與10 g/L殼寡糖處理組卻可以明顯的促進(jìn)菌體的生長，這與多數(shù)研究殼寡糖能夠抑制擴(kuò)展青霉菌絲生長的結(jié)果不同［9，13］。針對上述現(xiàn)象，我們分析可能的原因?yàn)橐酝难芯慷贾饕腔诠虘B(tài)平板培養(yǎng)，而本研究采用的是液體培養(yǎng)，殼寡糖作為一種聚陽離子多糖與菌體表面的吸附作用是不容忽視的，而Xu等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖的抑菌特性僅僅在一定程度上歸于殼寡糖的聚陽離子特性；其次，也有可能是殼寡糖試劑中低聚和度的寡糖促進(jìn)了菌絲的生長。Li等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，500 mg/L殼聚糖乙酸鹽溶液能促進(jìn)細(xì)菌的生長，可能是因?yàn)樵谠摑舛葪l件下殼聚糖乙酸鹽不足以抑制細(xì)菌的生長，殼聚糖可能會(huì)被微生物體內(nèi)的酶降解作而作為能量物質(zhì)促進(jìn)生長。與殼寡糖對菌體生長的影響不同，5 g/L與10 g/L殼寡糖處理均可以顯著降低展青霉素分泌與擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量。關(guān)于抑菌劑對于菌體生長和產(chǎn)毒不一致的情況在其他的研究中也有報(bào)道。例如，文獻(xiàn)［15］的研究發(fā)現(xiàn)，含有槲皮素和其他酚類物質(zhì)的苦楝樹葉提取物不能抑制擴(kuò)展青霉菌體生長，但是卻能夠抑制展青霉毒素的分泌。而Paterson等［16］研究發(fā)現(xiàn)，2-脫氧葡萄糖（2-deoxy-D-glucose）作為一種抑菌劑在抑制菌絲生長的同時(shí)卻能夠提高展青霉素及其他類似的次級代謝產(chǎn)物的合成。Zong等［17］的研究表明，不同的碳源、氮源以及pH值對擴(kuò)展青霉產(chǎn)生展青霉素有很大的影響，他們主要是通過調(diào)控展青霉素合成的轉(zhuǎn)錄水平而影響展青霉素的分泌。殼寡糖是殼聚糖降解后的產(chǎn)物，作為自然界唯一的堿性多糖，殼寡糖是碳和氮的良好來源。因此，本研究中，5，10 g/L殼寡糖對展青霉素的抑制作用，可能是殼寡糖參與了調(diào)控展青霉素合成的轉(zhuǎn)錄水平，從而降低了展青霉素的分泌。

液體培養(yǎng)方式及不同溫度條件下，殼寡糖對菌體生長的影響并不相同。25℃與16℃條件下，殼寡糖都促進(jìn)了菌體的生長，而4℃培養(yǎng)條件下，殼寡糖處理組菌體重量始終明顯低于對照組?？赡芘c低溫環(huán)境下菌體的新陳代謝受到較大影響有關(guān)，因而更有利于殼寡糖發(fā)揮抑菌作用。除4℃培養(yǎng)條件下，第35天5 g/L殼寡糖處理組擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量高于對照組外，殼寡糖在不同溫度條件下對毒素分泌都有很好的抑制效果。說明不同溫度培養(yǎng)條件下，殼寡糖對展青霉素分泌的影響具有一致性。不同溫度培養(yǎng)條件下，對照組與殼寡糖處理組擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，Reddy等［18］的研究中也發(fā)現(xiàn)了展青霉素在培養(yǎng)后期出現(xiàn)降解的現(xiàn)象。Varga等［19］認(rèn)為毒素可以被菌體自身降解，同時(shí)由于營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，真菌毒素的產(chǎn)生或積累可以被終止。因此對于本研究中，擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量降低的原因可能是在菌體生長后期，營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，導(dǎo)致毒素的合成被終止，同時(shí)由于菌體生長進(jìn)入衰亡期，細(xì)胞內(nèi)容物滲出，培養(yǎng)環(huán)境發(fā)生改變，如pH值發(fā)生改變等，導(dǎo)致展青霉素的降解，從而使單位菌體產(chǎn)毒量降低。不同溫度培養(yǎng)條件下，擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量的大小按培養(yǎng)溫度排序?yàn)?6，4，25℃，這可能與菌體處于低溫的不利環(huán)境中，會(huì)增加毒素等次級代謝產(chǎn)物的分泌量有關(guān)。Garcia等［20］認(rèn)為，環(huán)境因素對擴(kuò)展青霉菌體生長和毒素產(chǎn)生有很大影響，當(dāng)菌體處于不利的環(huán)境狀況時(shí)，可能會(huì)增加其毒素的產(chǎn)生，并且發(fā)現(xiàn)在1℃培養(yǎng)條件下，擴(kuò)展青霉的產(chǎn)毒量要低于20℃培養(yǎng)條件下擴(kuò)展青霉的產(chǎn)毒量。這與本研究中4℃單位菌體產(chǎn)毒量小于16℃的產(chǎn)毒量相符合，而25℃被認(rèn)為是擴(kuò)展青霉菌體生長和產(chǎn)毒的最適溫度［11］，但其單位菌體產(chǎn)毒量均小于16℃與4℃，可能與擴(kuò)展青霉菌種的特異性有關(guān)。例如Reddy等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，4℃與25℃培養(yǎng)條件下，不同種擴(kuò)展青霉菌株分泌展青霉素量有很大不同。

液體培養(yǎng)方式下，4℃與25℃搖床培養(yǎng)條件下，擴(kuò)展青霉菌體干重均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。且在培養(yǎng)前期對擴(kuò)展青霉菌體生長都有一定的抑制作用。但是隨著時(shí)間的延長4℃搖床培養(yǎng)條件下，殼寡糖處理組與對照組之間沒有顯著性差異。這與4℃靜止培養(yǎng)條件下，殼寡糖對擴(kuò)展青霉菌體生長的抑制作用不同?？赡苁且?yàn)閿U(kuò)展青霉是一種好氧性絲狀真菌，搖床培養(yǎng)條件下，氧氣比較充分，因此有利于菌體的生長。25℃搖床培養(yǎng)條件下，殼寡糖對菌體生長具有明顯的促進(jìn)作用，這與25℃靜止培養(yǎng)時(shí)，殼寡糖對擴(kuò)展青霉菌體生長的促進(jìn)作用相同。說明在該溫度下，培養(yǎng)方式并不會(huì)影響殼寡糖對菌體生長的作用。搖床培養(yǎng)與靜止培養(yǎng)對擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量的影響是一致的，即隨著時(shí)間的延長，擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，同時(shí)殼寡糖處理均降低了展青霉素的分泌。搖床培養(yǎng)條件下，擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量的大小按培養(yǎng)溫度排序?yàn)?，25℃。但與靜止培養(yǎng)不同的是，搖床培養(yǎng)條件下擴(kuò)展青霉的單位菌體產(chǎn)毒量明顯降低。這可能與搖床培養(yǎng)條件下，擴(kuò)展青霉主要進(jìn)行營養(yǎng)生長產(chǎn)孢量少有關(guān)。Calvo等［21］認(rèn)為次級代謝產(chǎn)物與真菌的產(chǎn)孢過程有關(guān)，有毒的代謝產(chǎn)物是在菌體生長接近產(chǎn)孢時(shí)形成的，這與本研究結(jié)果一致。

本研究表明，液體培養(yǎng)方式下，不同濃度殼寡糖處理促進(jìn)了擴(kuò)展青霉菌體的生長，但是卻能夠降低展青霉素的分泌。不同溫度培養(yǎng)條件下，同一濃度殼寡糖處理在不同培養(yǎng)方式下對擴(kuò)展青霉菌體生長的影響不同，但是均能夠降低展青霉素的分泌。不同溫度培養(yǎng)條件下，擴(kuò)展青霉單位菌體產(chǎn)毒量的大小按培養(yǎng)溫度排序?yàn)椋?6，4，25℃。以往的研究中往往只注重抑菌劑處理對菌體生長和果實(shí)品質(zhì)的影響，而忽略了對毒素分泌的影響，然而擴(kuò)展青霉在果實(shí)中的存在會(huì)比腐爛本身對人類造成更為嚴(yán)重的危害。因此，采用抑菌劑對果蔬采后病害進(jìn)行控制時(shí)，需要注意貯藏的溫度，在考慮其對菌體生長影響的同時(shí)，更應(yīng)該重視其對毒素分泌的影響。

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Effects of Oligochitosan on Growth of Penicillium expansum and Production of Patulin

JIANG La， WANG Liting， CHEN Haiyan， MENG Xianghong*
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

In order to evaluate the antifungal activity of oligochitosan on pathogen growth and mycotoxin production in a comprehensive way，effects of oligochitosan on the growth of Penicillium expansum and the production of patulin were investigated at different temperatures by static and shaking cultivation cultured in liquid medium.The results showed that oligochitosan with concentration of 5，10 g/L had the obvious promoting effect on the growth of Penicillium expansum，but the inhibitory effect on the production of patulin.The same concentration oligochitosan inhibited the production of patulin，but had different effects on the growth of Penicillium expansum at 4，16℃，and 25℃.The highest and lowest ratios of patulin and P.expansum（mg：g）were obtained at 16，25℃.This study indicated that application of oligochitosan for postharvest disease should take into account the effect of storage temperature and the production of patulin in order to obtain the antifungal effect and food safety.

oligochitosan；Penicillium expansum；patulin；growth

葉紅波）

TS255.3；TS201.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.05.005

2095-6002（2015）05-0023-08

姜辣，王麗婷，陳海燕，等.殼寡糖對擴(kuò)展青霉菌體生長和毒素分泌量的影響［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2015，33（5）：23-30.

JIANG La，WANG Liting，CHEN Haiyan，et al.Effects of oligochitosan on growth of Penicillium expansum and production of patulin［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（5）：23-30.

2014-09-02

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31171762）；國家科技計(jì)劃課題資助項(xiàng)目（2012AA101607）。

姜 辣，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣弋a(chǎn)品生物污染物分析和脫除技術(shù)；*孟祥紅，男，教授，博士，主要從事食品貯藏加工中品質(zhì)變化和控制的生化基礎(chǔ)研究。通信作者。