殼聚糖固定化風(fēng)味蛋白酶的制備及其酶學(xué)特性

師廣波，馬艷芳，鄭明剛，孫中濤，*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安 271018；2.國家海洋局海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點實驗室，山東青島 266000）

殼聚糖固定化風(fēng)味蛋白酶的制備及其酶學(xué)特性

師廣波1，馬艷芳1，鄭明剛2，孫中濤1，*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安 271018；2.國家海洋局海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點實驗室，山東青島 266000）

研究了球形交聯(lián)殼聚糖固定化風(fēng)味蛋白酶的制備工藝及其酶學(xué)特性。以殼聚糖為載體、戊二醛為交聯(lián)劑，采用共價交聯(lián)法制備固定化風(fēng)味蛋白酶的較適條件為ω（殼聚糖）=2.5%、ω（NaOH）=3%、ω（戊二醛）=0.5%，交聯(lián)時間6 h，載體中ω（酶）=40 mg/g，于35℃、pH值5.5條件下固定化反應(yīng)10 h。固定化后，風(fēng)味蛋白酶較適反應(yīng)溫度從50℃提高至70℃，較適pH值從7.0 提高至8.0，且可在更寬溫度與pH值范圍內(nèi)保持較高的酶活力。固定化風(fēng)味蛋白酶具有良好的儲存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性，可反復(fù)多次使用，適宜于在工業(yè)生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

風(fēng)味蛋白酶；固定化；球形交聯(lián)殼聚糖；酶學(xué)特性

風(fēng)味蛋白酶是由米曲霉發(fā)酵產(chǎn)生，再經(jīng)固液分離、超濾濃縮和噴霧干燥等工序精制而成的一種蛋白酶制劑，除具有內(nèi)切酶活性外，還具有外切蛋白酶的活性，可作用于肽鏈C端或N端的疏水性氨基酸形成的肽鍵，使其水解成游離氨基酸［1-3］。在食品工業(yè)中，風(fēng)味蛋白酶廣泛應(yīng)用于各種動植物蛋白質(zhì)的水解，具有提高水解產(chǎn)物的水解度和游離氨基酸含量、減輕或脫除苦味、增強和改善風(fēng)味的作用［4-7］。例如，Benjakul等［8］用風(fēng)味蛋白酶水解美國白對蝦，不僅提高了水解物的產(chǎn)量，而且改善水解液的風(fēng)味；Tsou等［9］利用風(fēng)味蛋白酶水解大豆分離蛋白，不僅提高了水解度，而且減輕了大豆肽的苦味；謝章斌等［10］采用風(fēng)味蛋白酶對鵝肝醬中的蛋白質(zhì)進(jìn)行可控水解，顯著降低了鵝肝醬的腥味和異味；張根生等［11］利用風(fēng)味蛋白酶水解脫脂碎肉粉，水解度高達(dá)30.13%，游離氨基酸含量顯著提高，改善了產(chǎn)品風(fēng)味。

目前，國內(nèi)外對風(fēng)味蛋白酶的研究與應(yīng)用主要集中于游離態(tài)的風(fēng)味蛋白酶，而對其固定化技術(shù)與固定化酶的應(yīng)用研究較少。風(fēng)味蛋白酶價格較高，采用游離態(tài)的風(fēng)味蛋白酶對動植物蛋白進(jìn)行水解時，酶與底物分離困難，不能重復(fù)利用，且酶促反應(yīng)的進(jìn)程不易控制，這限制了風(fēng)味蛋白酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用［12］。與游離酶相比，固定化酶穩(wěn)定性好、酶促反應(yīng)過程的可控性高，生產(chǎn)工藝相對簡單，酶與底物容易分離，可重復(fù)利用，節(jié)約生產(chǎn)成本［13-14］。因此，采用適宜的載體對風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行固定化，改善其應(yīng)用特性，降低應(yīng)用成本，可以拓展風(fēng)味蛋白酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍。本實驗采用殼聚糖為載體，以戊二醛為交聯(lián)劑，對風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行固定化，并對其酶學(xué)特性進(jìn)行了研究，旨在為固定化風(fēng)味蛋白酶在食品工業(yè)中的規(guī)?；瘧?yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

殼聚糖（脫乙酰度≥90.0%）、福林試劑，北京索萊寶科技有限公司；Flavourzyme500MG型粉末狀風(fēng)味蛋白酶，諾維信生物技術(shù)有限公司；戊二醛（w=25%水溶液），中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

DHZ-D型恒溫振蕩器，蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；PHSJ-4A型pH計，上海雷磁儀器廠；Spectrumlab S22型可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；JA1003型電子天平，上海恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3.1 固定化風(fēng)味蛋白酶制備條件的優(yōu)化

稱取一定質(zhì)量的殼聚糖，加入一定體積ω（乙酸）=2%水溶液，攪拌至呈透明膠液狀，用注射器逐滴注入ω（NaOH）=3%的水溶液中，固化2 h，傾去NaOH溶液，用蒸餾水將殼聚糖球狀載體洗至中性，再以ω（戊二醛）=0.5%的水溶液于室溫下交聯(lián)6 h，然后用蒸餾水洗去戊二醛殘液，即制得交聯(lián)殼聚糖球載體［15］；向載體中加入風(fēng)味蛋白酶溶液，于4℃固定12 h，再用蒸餾水洗掉未被固定的酶分子，抽干，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩２捎脝我蛩貙嶒炘O(shè)計，依次采用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的殼聚糖和NaOH溶液制備載體，評測其形狀與機械強度，以確定較佳殼聚糖和NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)。戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)和交聯(lián)反應(yīng)時間是影響載體活化程度的重要因素，將固化好的殼聚糖載體分別加入到不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的戊二醛溶液中（ω=0.1%～2%），于常溫下交聯(lián)反應(yīng)2～12 h，然后評測其對風(fēng)味蛋白酶的固定化能力，以確定較佳戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)和交聯(lián)反應(yīng)時間。給酶量、固定化反應(yīng)時間、溫度、pH值是影響活化后的殼聚糖載體對風(fēng)味蛋白酶固定化能力的重要因素，依次采用單因素實驗設(shè)計對載體中酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（20～80 mg/g）、固定化反應(yīng)時間（2～12 h）、溫度（5～55℃）和pH值（pH值3.5～8.5）進(jìn)行優(yōu)化，以確定固定化反應(yīng)的較佳條件。

1.3.2 固定化風(fēng)味蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)

以酪蛋白為底物，分別于不同溫度和pH值下測定固定化風(fēng)味蛋白酶的酶活力，以確定固定化風(fēng)味蛋白酶的較佳酶促反應(yīng)溫度與pH值。將固定化酶置于室溫下（25℃），每隔5 d取樣并測定其酶活力，以評價其儲存穩(wěn)定性；連續(xù)多次用固定化酶于55℃水解大豆分離蛋白，每次水解時間3 h，水解完畢，濾出固定化酶，用蒸餾水沖洗干凈，然后測定殘留酶活力，以評價其操作穩(wěn)定性。

1.3.3 固定化風(fēng)味蛋白酶活力的測定

采用福林酚法（GB/T 23527—2009）。在40℃、pH值7.5的條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為一個酶活力單位，以U表示。相對酶活力以各組實驗的較高酶活力為100%進(jìn)行折算.

2 結(jié)果與分析

2.1 風(fēng)味蛋白酶較佳固定化條件的優(yōu)化

人胚腎細(xì)胞（HEK293細(xì)胞）由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院分子免疫實驗室提供。以含10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)液在恒溫37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換液，待細(xì)胞密度達(dá)75%～85%用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

2.1.1 殼聚糖和NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

隨機取10粒殼聚糖載體夾在兩蓋玻片中間，在蓋玻片上放置適量砝碼擠壓載體，觀察載體有無變形破裂，以此來表示載體的機械強度。制備殼聚糖載體時，殼聚糖與NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)對載體的成型性和機械強度的影響如表1。

表1 殼聚糖與NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)對殼聚糖載體形狀與機械強度的影響Tab.1 Effects of chitosan and NaOH concentrations on shape and mechanical strength of chitosan carrier

殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)主要影響載體的成型性和機械強度，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時，載體的成型性和機械強度較差。增加殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以提高成球性能和機械強度，但殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時，向NaOH中滴加時有拖尾現(xiàn)象，所形成的載體呈蝌蚪狀。

NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)主要影響載體的固化速度，NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時，載體固化速度慢，在重力的作用下發(fā)生形變，呈扁球狀或橢球狀，如圖1。

圖1 不規(guī)則形狀的殼聚糖載體Fig.1 Irregular shape chitosan carriers

當(dāng)ω（殼聚糖）=2.5%、ω（NaOH）=3%時，所形成的殼聚糖載體呈規(guī)則球形，機械強度大，再增加殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，而再增加NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)，對載體的形狀和機械強度的影響不再明顯。因此選擇ω（殼聚糖）=2.5%、ω（NaOH）=3%為較佳濃度。

2.1.2 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)和載體活化時間的影響

交聯(lián)劑戊二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與殼聚糖載體的活化時間影響載體上活性基團(tuán)數(shù)量，從而影響其固定化能力。戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)與活化時間對載體固定化能力的影響結(jié)果如圖2。

圖2 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)與活化時間對固定風(fēng)味蛋白化酶相對活力的影響Fig.2 Effects of glutaraldehyde concentration and activation time on relative activity of immobilized flavourzyme

圖3 載體中酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對固定化酶活力的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on relative activity of immobilized flavourzyme

ω（戊二醛）=0.5%時，固定化酶的活力較大，再增大戊二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，酶活力反而下降。其原因是戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小時，殼聚糖載體上的活性基團(tuán)數(shù)量少，固定化能力低；但戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時，殼聚糖分子上的氨基與戊二醛發(fā)生分子內(nèi)或分子間交聯(lián)，導(dǎo)致載體與酶的結(jié)合能力降低。隨著活化時間的延長，載體偶聯(lián)的戊二醛數(shù)量增加，固定化能力增強，并在第6 h時達(dá)到較大值，此時，偶聯(lián)反應(yīng)已經(jīng)平衡，再增加活化時間，載體上偶聯(lián)的戊二醛數(shù)量不再增加。

2.1.3 載體中酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對固定化酶活力的影響

載體中酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對固定化酶活力的影響如圖3。

由圖3知，固定化酶活力隨著載體中酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而逐漸增大，并在載體中酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40 mg/g載體時達(dá)到較大值，此后，再增加載體中酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，固定化酶活力的變化趨于平緩并有不同程度的下降。其原因是載體上的活性基團(tuán)數(shù)量是一定的，當(dāng)活性位點被酶分子全部占據(jù)后，再增加載體中酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，被固定的酶分子數(shù)量不再增加，且過多的酶分子會在載體網(wǎng)格內(nèi)聚集，產(chǎn)生空間位阻，影響酶與底物的正常結(jié)合，另一方面也會對固定化蛋白酶有一定的水解作用，從而導(dǎo)致固定化酶活力下降［16］。

2.1.4 固定化反應(yīng)時間的影響

固定化時間對固定化酶活力的影響如圖4。

圖4 固定化反應(yīng)時間對固定化酶活力的影響Fig.4 Effect of immobilization reaction time on relative activity of immobilized flavourzyme

隨著固定化反應(yīng)時間的增加，固定化酶活力逐漸增大，并在10 h時達(dá)到較大值，再延長反應(yīng)時間，固定化酶活力不再增加。因此，較佳固定化反應(yīng)時間為10 h。

2.1.5 固定化反應(yīng)溫度和pH值的影響

固定化反應(yīng)溫度和pH值對固定化酶活力的影響如圖5。溫度較低時，殼聚糖載體上的醛基與酶蛋白上的氨基反應(yīng)速度慢，被固定化的酶分子少，固定化酶活力較低。提高固定化反應(yīng)的溫度，可以提高固定化酶活力，并在35℃時達(dá)到較大值。再提高反應(yīng)溫度，固定化酶活力反而下降，其原因是溫度較高時，酶蛋白的穩(wěn)定性差，容易變性失活。固定化反應(yīng)的pH值對固定化酶活力的影響如圖5b，pH值的變化對固定化酶活力影響很大，其原因是反應(yīng)體系的pH值直接影響殼聚糖載體和酶蛋白的解離狀態(tài)，從而影響載體與酶蛋白的結(jié)合量。pH 5.5是固定化反應(yīng)的較佳pH值，此時固定化酶活力較大。

圖5 固定化溫度與pH值對固定化酶活性的影響Fig.5 Effects of temperature and pH on relative activity of immobilized flavourzyme

2.2 固定化風(fēng)味蛋白酶的特性

2.2.1 較適反應(yīng)溫度與pH值

風(fēng)味蛋白酶固定化后，較適反應(yīng)溫度與pH值發(fā)生了變化，如圖6。

圖6 固定化風(fēng)味蛋白酶的較適溫度與pH值Fig.6 Optimum temperature and pH of immobilized flavourzyme

游離酶與固定化酶在50～70℃范圍內(nèi)，均有較高的酶活性，但游離酶的較適反應(yīng)溫度為50℃，固定化酶的較適反應(yīng)溫度為70℃。酶固定化后較適反應(yīng)溫度升高的原因是酶分子與載體結(jié)合后，熱穩(wěn)定性提高，熱變性失活速率下降。風(fēng)味蛋白酶固定化后，較適pH值向偏堿的方向移動。游離酶在pH值7.0時酶活力較高，且較適pH值范圍較窄；而固定化酶在pH值8.0時酶活力較高，且在pH值7.5～9.0的范圍內(nèi)均能保持較高的酶活力。

2.2.2 固定化酶的儲存穩(wěn)定性與操作穩(wěn)定性

與游離蛋白酶相比，固定化風(fēng)味蛋白酶具有較好的儲存穩(wěn)定性與操作穩(wěn)定性，如圖7。

游離酶儲存10 d后酶活力損失95%以上，而固定化酶儲存10 d后，酶活力僅損失30%，儲存30 d后酶活力仍殘留51.9%。風(fēng)味蛋白酶固定化后可以反復(fù)多次使用，并表現(xiàn)出較好的操作穩(wěn)定性。重復(fù)使用5次，酶活力僅損失16%，重復(fù)使用11次，殘留酶活力仍為56.7%；同時，球形載體仍保持較好的韌性，未見有破碎或變形現(xiàn)象。良好的儲存與操作穩(wěn)定性，有利于固定化風(fēng)味蛋白酶在食品工業(yè)中的推廣與應(yīng)用，可以延長使用時間、增加使用次數(shù)，降低生產(chǎn)成本。

圖7 固定化風(fēng)味蛋白酶的儲存穩(wěn)定性與操作穩(wěn)定性Fig.7 Storage and operational stability of immobilized flavourzyme

3 結(jié) 論

可用于制備固定化酶的載體很多，但殼聚糖載體由于化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，機械強度高、比表面積較大、孔隙率高、內(nèi)擴散阻力小，被認(rèn)為是較有工業(yè)應(yīng)用潛力的固定化酶載體［17］。以殼聚糖為載體、戊二醛為交聯(lián)劑，采用共價交聯(lián)法制備固定化風(fēng)味蛋白酶的較適條件為ω（殼聚糖）=2.5%、ω（NaOH）=3%、ω（戊二醛）=0.5%，交聯(lián)時間6 h，載體中酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)40 mg/g載體，于35℃、pH 5.5條件下固定化反應(yīng)10 h。固定化后，風(fēng)味蛋白酶較適反應(yīng)溫度從50℃提高至70℃，較適pH值從7.0提高至8.0，且可保持較高酶活力的溫度與pH值范圍均有所擴大。

固定化風(fēng)味蛋白酶保持了游離酶的高效、專一及溫和的酶催化特性，具有良好的儲存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性，可反復(fù)多次使用，分離回收容易，使用效率高；酶反應(yīng)過程可以控制，大大簡化了生產(chǎn)工藝，適宜于在工業(yè)生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

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Preparation and Properties of Immobilized Flavourzyme on Globular Cross-linked Chitosan

SHI Guangbo1，MA Yanfang1，ZHENG Minggang2，SUN Zhongtao1，*
（1.College of Life Science，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China；2.Key Lab of Marine Bioactive Substance and Modern Analytical Technique of State Oceanic Administration，Qingdao 266000，China）

The preparation and properties of immobilized flavourzyme on globular cross-linked chitosan，with glutaraldehyde as crosslinking agent，were investigated.The optimal concentration of chitosan，NaOH and glutaraldehyde was 2.5%，3%，and 0.5%，respectively，and the optimal crosslinking time was 6 h.The optimal flavourzyme dosage was 40 mg/g carrier，and the optimal immobilizing reaction temperature，pH，and time was 35℃，pH 5.5，and 10h，respectively.After immobilized，the optimal reaction temperature of flavourzyme was improved from 50℃to 70℃，and the optimal pH value was improved from 7.0 to 8.0.Moreover，the ranges of temperature and pH for keeping the higher enzyme activity had been extended.The stability of storage and operation of the immobilized flavourzyme was good enough to be reused for many times，which suggested that the immobilized flavourzyme was suitable for the wide applications in industry.

flavourzyme；immobilization；globular cross-linked chitosan；enzymatic properties

李 寧）

TS201.2

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.04.006

2095-6002（2015）04-0027-06

師廣波，馬艷芳，鄭明剛，等.殼聚糖固定化風(fēng)味蛋白酶的制備及其酶學(xué)特性［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2015，33（4）:27-32.

SHI Guangbo，MA Yanfang，ZHENG Minggang，et al.Preparation and properties of immobilized flavourzyme on globular cross-linked chitosan［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（4）:27-32.

2014-09-21

國家海洋局海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點實驗室開放基金資助項目（MBSMAT-2014-05）。作者簡介:師廣波，男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程與酶工程；

*孫中濤，男，副教授，博士，主要從事發(fā)酵工程與酶工程方面的研究。

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