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    黑木耳“黑皮病”病原菌鑒定

    2015-03-06 05:55:04劉佳寧馬銀鵬王玉文張介馳張丕奇
    黑龍江科學 2015年1期
    關鍵詞:孢菌菌袋分生孢子

    劉佳寧,馬銀鵬,王玉文,張介馳,張丕奇

    (黑龍江省科學院微生物研究所,哈爾濱 150010)

    木耳(Auricularia auricular judae)別名黑木耳、光木耳,真菌學分類屬擔子菌綱、木耳目、木耳科。其擔子果膠質,圓盤形或耳形,新鮮時軟,干后收縮,色澤黑褐,質地柔軟,味道鮮美,營養(yǎng)豐富,是強身健體的理想食品。它還具有很高的藥用價值,是世界公認的高營養(yǎng)保健食品[1]。我國的栽培規(guī)模逐年擴大,木耳產業(yè)已經(jīng)成為東北部分地區(qū)的主導產業(yè),在農業(yè)總產值中占有較大比重。

    近年來,東北地區(qū)特別是黑龍江東寧、尚志、伊春和吉林蛟河等地區(qū)的栽培面積不斷擴大,部分地域由一年一季生產變?yōu)榇呵飪杉旧a。但由于栽培環(huán)境的惡化,連年重復生產的老耳房,環(huán)境滅菌的次數(shù)和間隔時間達不到要求,造成在高溫、陰暗、潮濕、通風不良、衛(wèi)生條件差的環(huán)境條件下大量生產,極易發(fā)生雜菌侵染性病害,致使木耳減產,嚴重影響收益。

    近期在以上地區(qū)就發(fā)生了一種高危侵染性病害,其發(fā)病特點為病原菌生長迅速,在接菌后7~10d,長覆蓋菌袋表面,整個菌袋表面迅速變?yōu)楹谏?在菌袋與培養(yǎng)基中間形成一層致密的黑色菌絲覆蓋層,并伴有大量黑色的凸起產生。該病具有發(fā)病快、傳播廣的特點。生產第一線種植戶將這種病害稱之為“黑木耳黑皮病”。目前,關于該病害病原菌的分類地位、危害狀況、遺傳分化狀況等情況均未見報道,更缺乏對該病害的防治方法。為防止該病害蔓延,減少農民收益損失,迫切需要對該病害進行深入而系統(tǒng)地研究,夯實基礎,為研發(fā)出適合的綜合防治方法提供依據(jù)。

    從4個木耳主產區(qū)采集多個病原樣品,根據(jù)科赫法則的基本步驟進行了一系列分離培養(yǎng)、病原菌回接等試驗,確定病原菌為一種黑色腐生真菌,并且通過形態(tài)觀察比對,確定了該病原菌的分類地位,利用I TS序列分析,進一步對該菌株進行鑒定及遺傳多樣性分析。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    試驗所用病原菌菌種由病原地采集獲得。對照試驗所用木耳菌種為“黑29”,由黑龍江省科學院微生物研究所提供。I TS序列擴增所用引物為I TS1-F:5′-CTT GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和ITS4-B∶

    5′-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG-3′,引物由大連寶生物有限公司合成。試驗用培養(yǎng)基配方為:第一,改良PDA培養(yǎng)基,配方為:水1000m L、馬鈴薯200g、葡萄糖 20g、瓊脂 20g、磷酸二氫鉀 3g、硫酸鎂1.5g。第二,改良P D液體培養(yǎng)基,配方為:水1000m L、磷酸二氫鉀3g、硫酸鎂1.5g、馬鈴薯200g、葡萄糖20g。第三,三級種配方為:木屑78%、麥麩20%、石膏1%、石灰1%。

    1.2 方法

    1.2.1 病害調查與病原菌菌株獲取

    采集具有典型病害特征的樣品(見圖1)進行分離培養(yǎng),獲取純病原菌菌株。該病典型發(fā)病特征為:初期菌絲潔白生長迅速,7~10d,長滿袋(袋規(guī)格為16cm×33cm)。長滿袋后7~10 d菌袋變?yōu)楹谏?,于菌袋與培養(yǎng)基之間形成大量黑色凸起。大約20~24d左右,在黑色凸起處產生黃色絲狀物質并隨風傳播。菌袋內黑木耳菌絲由于沒有足夠生長空間,造成產量劇減甚至絕產。將分離出的病原菌暫時定名為未知真菌unknownfungi,以便于后期應用分子生物學方法進行數(shù)據(jù)分析使用。4d,用挑取適量菌絲在顯微鏡下觀察照相并測量。用刀片切取真子座型載孢體截面觀察結構和其內部的分生孢子形態(tài)。

    圖1 黑木耳“黑皮病”病害樣品圖Fig.1 Sample of black skin of Auricularia auricular

    1.2.4 菌絲體培養(yǎng)及DNA提取

    將病原菌菌種接種于液體P D培養(yǎng)基中,25℃培養(yǎng)3~5 d,收集菌絲,濾紙吸干后冷凍保存。采用CTAB法提取DNA,DNA提取物于-20℃冰箱貯藏備用。

    1.2.5 I TS序列提取、對比與分析

    對未知真菌unknownfungi進行ITS序列的擴增。引物為PCR反應在Gene Amp PCRSystem 9700 PCR儀上進行擴增,20μL的反應體系內各種成分反應濃度(見表1)。擴增程序為:94℃預變性5min,94℃變性 30s,56 ℃退火 45 s,72 ℃延伸 2min,30 個循環(huán),最后在72℃延伸10min,每次反應均設置一個空白對照,以去離子水代替模板,以排除系統(tǒng)誤差。PCR擴增產物用1.0%的瓊脂糖(含0.5μg/m LEB)電泳,在U VP凝膠成像系統(tǒng)下成像保存。測序由上海生物工程有限公司完成。

    試驗選用樣本正反向測序。用BioEdit的ClustalW分別進行序列對位排列分析,對有N值和計算機誤讀的個別剪輯進行人工校對。對獲得的序列進行序列分析。將測得的I TS序列在Gene Bank進行BLAST,從GeneBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進行比對,獲得相似率較高、親源關系較近的物種,研究其中的系統(tǒng)發(fā)育關系。采用ME G A4.0系統(tǒng)發(fā)育分析軟件中的UPGMA法構建系統(tǒng)進化樹[2,3]。

    1.2.2 回接試驗復制病害典型特征

    根據(jù)科赫式法則進行回接試驗,將分離出的真菌分別與黑木耳菌進行回接試驗,定期觀察,記錄發(fā)病情況。同期將病原菌unknownfungi和黑木耳“黑29”轉入養(yǎng)基配方、體積、重量、接菌時間、培養(yǎng)時間及培養(yǎng)條件等完全相同的菌袋中,并保留空白菌袋做對照。經(jīng)過2w的培養(yǎng)以后,載有病原菌unknownfungi菌袋出現(xiàn)了與病原地所采集樣品同樣的發(fā)病特征,證明病原菌unknownfungi即為黑木耳“黑皮病”的致病菌。

    1.2.3 病原菌宏觀形態(tài)鑒定

    1.2.3.1 病原菌菌落形態(tài)

    用直徑為5mm的打孔器沿菌落邊緣,打取菌齡一致的菌餅,接種于改良PDA培養(yǎng)基斜面中央,然后于25℃恒溫箱中培養(yǎng)。從第3 d開始,每隔24 h測量一次菌落直徑,直到菌絲最前端接近平板培養(yǎng)基邊緣為止。

    1.2.3.2 菌絲、分生孢子及真子座型載孢體形態(tài)

    將病原菌菌株轉接至改良PDA培養(yǎng)基上,培養(yǎng)

    表1 ITS序列擴增反應體系表Tab.1 System table of ITS sequence amplified reaction

    2 結果與分析

    2.1 形態(tài)學鑒定

    2.1.1 菌落形態(tài)

    斜面(見圖2)內菌絲萌發(fā)時為白色,菌落具有發(fā)達的菌絲體。在24℃的培養(yǎng)條件下,菌絲長勢旺盛,在固體培養(yǎng)基中,菌絲向培養(yǎng)基內深入,在距離表面約1mm厚的區(qū)域內形成菌絲層。隨著培養(yǎng)時間的延長,菌絲向氣相延展,并開始變色,菌絲大量聚集的區(qū)域變?yōu)樯詈谏?,斜面末端呈黑灰色,后期全部變?yōu)楹谏T摼谛泵嬷兄挥^察到菌絲,未能觀察到其他結構。

    圖2 菌落形態(tài)圖Fig.2 Aspectgraph of colony

    2.1.2 菌絲、分生孢子形態(tài)及真子座型載孢體

    2.1.2.1 菌絲(見圖3-A)

    菌絲體初期白色,逐漸變?yōu)楹稚?后期逐漸變?yōu)楹谏?,呈擴散狀生長,有氣生菌絲,接種后6d長滿直徑9 cm平板,生長速度平均為0.75c m/d,菌絲體寬度(2.4)3~7(8.5)μm,有隔,光滑,菌絲體中段有分叉,形成新的菌絲體。

    2.1.2.2 真子座型載孢體(見圖3-B、C)

    真子座型載孢體,黑色,呈球形或近球形,大小為(89)105~260(285)μm×(89)105~260(285)μm,有明顯的外壁,外壁厚度(9)11~17(18.5)μm。分生孢子通過分生孢子梗連接于載孢體內壁,頂端無凸起或短小凸起,有頂孔,用于釋放分生孢子。

    2.1.2.3 分生孢子(見圖 3-E、F、G、H)

    分生孢子呈橢圓形或亞圓形,表面光滑,兩端鈍圓,初期無隔,無色,大小為(10.7)14~18(22.7)μm×(7.5)8.2~11(13.7)μm。后期于孢子中間產生一個隔膜,形成二孢結構,且孢子變?yōu)楹稚蚝谏7稚咦俞尫乓院?,形成分生孢子束,分生孢子束肉眼可見,淺黃色或黃色,直徑0.4~1.0mm。

    圖3 病原菌結構顯微觀察圖Fig.3 Microscopic graph of pathogen

    該菌形態(tài)特征與已知品種可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae基本一致,初步確定該菌株為可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae。

    2.2 序列分析

    2.2.1 I TS擴增結果及分析

    I TS-PCR產物電泳結果如圖4所示,M ar k er為D L2000,1號泳道為病原菌,2號泳道為去離子水對照。供試菌株的I TS產物大小在500~750 b p,測序結果顯示,供試菌株I TS序列為533 b p(見圖5)。

    圖4 ITS產物擴增電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of ITS products amplified

    圖5 病原菌ITS序列圖Fig.5Sequence diagram of ITS pathogen

    2.2.2 I TS序列系統(tǒng)發(fā)育分析

    用已經(jīng)獲得的病原菌ITS序列在GenBank中比對,與相似度最高的11個不同品種的已知序列建立進化樹,各品種序列名稱及GenBank號見表2。

    表2 毛雙孢屬Lasiodiplodia(Botryosphaeria為有性階段)Tab.2 Lasiodiplodia(Botryosphaeria in perfect stage)11個種的ITS序列名稱及號碼表

    由圖6可知,各分枝內菌株間的最大遺傳距離在0.003 892,最小為0.0000,說明各分枝內菌株的ITS 差異很小,11 個品種具有極強的相似性,但又略有區(qū)別,證明所有品種來源于同一個屬,即毛雙孢屬Lasiodiplodia 。其中病原菌(unknown fungi)與已知種Lasiodiplodia theobromae,GenBank 編號EU918707 的序列遺傳距離差異為0.0000,經(jīng)比對其相似度為99.999 %,結合宏觀經(jīng)典分類學數(shù)據(jù)進一步確定該病原菌為可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae。其生物學分類為子囊菌綱Ascomycetes、假球殼目Pleosporales、葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae、毛雙孢屬Lasiodiplodia、可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae。

    圖6 病原菌(unknown fungi)菌株與毛雙孢屬Lasiodiplodia 11個種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of pathogen strains and 11 species of Lasiodiplodia

    3 結論

    黑木耳“黑皮病”的病原菌,經(jīng)過分離純化、形態(tài)鑒定和分子生物學鑒定后,確定為可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae。

    4 討論

    通過與GenBank中的序列比對,在已公布序列的菌種中,本文中的病原菌菌株與可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae遺傳距離最近,且相似度最高。結合宏觀形態(tài)和分子生物學分析結果可以確定該病原菌為可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae。本文中可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae,是該菌的無性世代,該菌還有異名Botryosphaeria theobromae.和Diplodia gossypina等。該菌的有性型屬于子囊菌葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae屬,在本次試驗中未能觀察到。

    目前,國內外鮮有可可毛色二孢菌作為黑木耳病害的研究報道,尤其在我國東北黑木耳主產區(qū)該病害出現(xiàn)的時間不長,但是污染規(guī)模和造成的損失有逐年遞增的趨勢。隨著研究的不斷深入,我們也發(fā)現(xiàn)該病害如果在黑木耳菌絲成活以后侵染黑木耳菌袋,則不會造成黑木耳絕產。通過拮抗實驗發(fā)現(xiàn)病原菌與黑木耳菌絲之間有明顯的分割線,說明黑木耳菌絲體對該病有一定的抵抗能力,可與其共生,在黑木耳子實體形成期也可獲得部分黑木耳子實體,但是整體產量將大幅下降。由于該病原菌與黑木耳菌絲生長、生殖所必須的營養(yǎng)、溫度、濕度、pH、水分等基礎條件有巨大的交集,因此對可可毛色二孢菌病害的防治造成較大困難,目前只能通過嚴格控制其進入菌袋,隔絕其接觸菌袋內的培養(yǎng)基來防止這類病害的發(fā)生。目前缺乏病原菌侵入菌袋后的治療方法,希望通過后續(xù)研究能夠找到應對該病害的合理措施。

    [1] 李慧蓉.白腐真菌生物學和生物技術[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005:76-88.

    [2] 劉佳寧,宋瑞清.扎龍濕地水生真菌多樣性研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學,2008.

    [3] 宋瑞清,余江勇,冀瑞卿.四個姬松茸菌株rDNA ITS序列比較[J].林業(yè)科技,2007,(03):23-24.

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