人血漿中痕量炔雌醇衍生化LC-MS/MS測(cè)定方法的建立及其藥動(dòng)學(xué)研究

辛?xí)造常瑓?琰，賀彥娜，丁 黎

中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析教研室，南京210009

人血漿中痕量炔雌醇衍生化LC-MS/MS測(cè)定方法的建立及其藥動(dòng)學(xué)研究

辛?xí)造?，?琰，賀彥娜，丁 黎*

中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析教研室，南京210009

目的：建立柱前衍生化測(cè)定人血漿中痕量炔雌醇的LC-MS/MS方法，并研究中國(guó)健康女性受試者空腹口服左炔諾孕酮炔雌醇片（每片含0.02 mg炔雌醇和0.1 mg左炔諾孕酮）后炔雌醇的藥動(dòng)學(xué)特征。方法：血漿樣品經(jīng)過(guò)環(huán)己烷-乙醚（7∶1）提取吹干后，殘?jiān)芙庥趐H 10.5的碳酸氫鈉溶液中，并用丹酰氯丙酮溶液在60℃反應(yīng)6 min后進(jìn)行LC-MS/MS分析。以Hedera ODS-2（2.1 mm×150 mm，5 μm）為分析柱，流動(dòng)相為含0.1%甲酸的水溶液-甲醇（13∶87），梯度洗脫。炔雌醇丹酰氯衍生物和內(nèi)標(biāo)米非司酮的檢測(cè)離子分別為m/z 530.2→171.1和m/z 430.1→372.2，對(duì)中國(guó)健康女性受試者空腹口服左炔諾孕酮炔雌醇片后，血漿中炔雌醇的濃度進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果與結(jié)論：炔雌醇的血藥濃度在1.059~211.7 pg·mL-1范圍內(nèi)線性良好，中國(guó)健康女性受試者單次和連續(xù)21 d口服左炔諾孕酮炔雌醇片后炔雌醇的cmax分別為（58.1±25.1）pg·mL-1和（76.5±19.7）pg·mL-1，tmax分別為（1.8±0.6）h和（1.9±0.9）h，AUC分別為（611±223）pg·h·mL-1和（762±189）pg·h·mL-1，t1/2分別為（12.36±4.42）h和（15.44±3.81）h。以上炔雌醇的藥動(dòng)學(xué)特征為首次報(bào)道。

柱前衍生化；炔雌醇；丹酰氯；LC-MS/MS；藥代動(dòng)力學(xué)

左炔諾孕酮炔雌醇片的炔雌醇和左炔諾孕酮為避孕藥的常用成分，能通過(guò)抑制卵巢活性達(dá)到避孕目的。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，該制劑連續(xù)服藥后炔雌醇的人體穩(wěn)態(tài)血藥濃度為（77±30）pg·mL-1，穩(wěn)態(tài)時(shí)最低血藥濃度為（10.5±5.1）pg·mL-1[1]，因此，為研究該制劑在中國(guó)健康女性受試者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，需建立高靈敏度的方法對(duì)血漿中痕量的炔雌醇進(jìn)行測(cè)定。國(guó)內(nèi)外建立了測(cè)定炔雌醇的多種方法仍有局限：免疫法[2]專(zhuān)屬性差；GC-MS/MS法[3]樣品前處理繁瑣且分析時(shí)間長(zhǎng)，不適合高通量樣本分析；HPLC法[4]靈敏度不夠；LC-MS/MS法[5]可在電噴霧離子化（ESI）或大氣壓化學(xué)離子化（APCI）負(fù)離子條件下測(cè)定炔雌醇，但是靈敏度仍無(wú)法達(dá)到本試驗(yàn)的測(cè)定要求；柱前衍生化[6]測(cè)定炔雌醇的樣品處理過(guò)程須進(jìn)一步優(yōu)化，以滿足本試驗(yàn)的測(cè)定要求（定量下限為1 pg·mL-1），且衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性須進(jìn)一步考察。為此，本文建立了測(cè)定人血漿中炔雌醇的LC-MS/MS法，定量下限為1 pg·mL-1，為目前報(bào)道的最低值，可用于炔雌醇的藥動(dòng)學(xué)研究。此外，本文首次報(bào)道了中國(guó)健康女性受試者空腹口服左炔諾孕酮炔雌醇片后炔雌醇的人體藥動(dòng)學(xué)特征。

1 材 料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng) （美國(guó)Agilen公司）；API 4000三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配備電噴霧離子化接口，Analyst Software 1.5.2數(shù)據(jù)采集軟件（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

1.2 藥品和試劑

左炔諾孕酮炔雌醇片 （北京紫竹藥業(yè)有限公司，批號(hào)：43121123，規(guī)格：21片，每片含左炔諾孕酮0.1 mg，炔雌醇0.02 mg）；炔雌醇對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100052-200609，純度：99.5%）；米非司酮對(duì)照品（USP，批號(hào)：FDH385）；丹酰氯（日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：R6U2NTN，含量98.0%）；甲醇和乙腈（為色譜純，德國(guó)Mer-ck公司）；其余試劑均為市售分析純；水為去離子水。

2 方 法

2.1 色譜、質(zhì)譜條件

色譜柱：Hanbon Hedera ODS-2（2．1mm×150mm，5 μm，江蘇漢邦科技有限公司）；流動(dòng)相：甲醇-0．1%甲酸水溶液，梯度洗脫（0～3．0min，維持87%甲醇；3．0～3．1 min，87%甲醇線性升至100%甲醇；3．1～7．0 min，維持100%甲醇；7．0～7．1min，100%甲醇線性降至87%甲醇；7．1～10．0 min，維持87%甲醇）；流速：0．5 mL· min-1；進(jìn)樣量：15 μL；進(jìn)樣器控溫：15℃；柱溫：35℃。

多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）；氣動(dòng)輔助電噴霧離子化（ESI）；離子極性：正離子；檢測(cè)對(duì)象：炔雌醇的丹酰氯衍生物，m/z 530．2→171．1；內(nèi)標(biāo)（米非司酮），m/ z 430．1→372．2；碰撞氣壓力：68．9 kPa；氣簾氣壓力：206．8 kPa；離子源氣體1壓力：413．7 kPa；離子源氣體2壓力：344．7 kPa；離子噴射電壓：5500 V；離子源溫度：500℃。其它參數(shù)見(jiàn)表1。待測(cè)物質(zhì)子化分子離子的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

表1 待測(cè)物的質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置

圖1 待測(cè)物質(zhì)子化分子離子的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖

2.2 溶液的配制

以甲醇為溶劑，配制1．059 mg·mL-1的炔雌醇儲(chǔ)備液，并以甲醇逐級(jí)稀釋?zhuān)玫綕舛确謩e為105．9、10．59、1．059 μg·mL-1；105．9、10．59、1．059 ng·mL-1；529．3、132．3、52．93 pg·mL-1；6．352、3．176、1．588 ng· mL-1的炔雌醇系列對(duì)照品溶液。以甲醇為溶劑，配制1．042mg·mL-1米非司酮的儲(chǔ)備液，并以甲醇逐級(jí)稀釋?zhuān)玫綕舛葹?．210 μg·mL-1的米非司酮對(duì)照品溶液。

配制濃度為1．086 mg·mL-1的丹酰氯丙酮溶液。

配制濃度為100．8 mmol·L-1的碳酸氫鈉水溶液，用氫氧化鈉調(diào)pH至10．5。

2.3 血漿樣品的提取及衍生化處理

于10 mL離心管中精密加入血漿樣品1 mL，加入內(nèi)標(biāo)溶液（5．210 μg·mL-1）20 μL，旋渦混勻，再加入環(huán)己烷-乙醚（7∶1）4．0 mL，渦旋3 min，于4000 r· min-1離心8 min。取上層有機(jī)相3 mL，于37℃水浴以氮?dú)饬鞔蹈?。在提取好的血漿殘?jiān)鼧悠分屑尤?00 mmol·L-1碳酸氫鈉溶液100 μL（pH 10．5），渦旋1 min，再加入1 mg·mL-1的丹酰氯丙酮溶液100 μL，渦旋1 min，60℃水浴加熱6 min。再以15600 r·min-1離心3 min，取上層澄清溶液于自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，進(jìn)樣量15 μL，進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.4 臨床試驗(yàn)方案

12名健康女性受試者，年齡26～43歲，身高（163．1±2．4）cm，體重 （60．9±2．3）kg，體重指數(shù)（22．9±0．8）kg·m-2。體格檢查顯示血壓、心肝腎功能和血、尿常規(guī)無(wú)異常。受試者于試驗(yàn)前兩周及試驗(yàn)期間未服用其他任何藥物。本試驗(yàn)遵守《赫爾辛基宣言》有關(guān)倫理準(zhǔn)則，試驗(yàn)方案經(jīng)中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)倫理委員會(huì)審議通過(guò)，受試者自愿參加試驗(yàn)并簽署知情同意書(shū)。

采用單中心、開(kāi)放、隨機(jī)試驗(yàn)。選擇符合入選標(biāo)準(zhǔn)的健康成年女性受試者12人進(jìn)行單次（1片左炔諾孕酮炔雌醇片）及多次給藥試驗(yàn)。

單次給藥藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)：12名健康女性受試者，空腹給藥1次（8∶00），在給藥前（0 h）和給藥后10、20、30、45 min，1、1．5、2、2．5、3、4、6、9、14、24、36、48、72 h分別采集靜脈血5 mL于肝素試管中，離心5 min（4000 r·min-1），分離血漿，置-80℃保存待測(cè)。

多次給藥藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)：12名健康女性受試者單次給藥結(jié)束后，立即（單次給藥的第4天為多次給藥第1天）進(jìn)行多次給藥人體藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。每天1次（8∶00），每次1片，連續(xù)給藥21 d。多次給藥第21天 （試驗(yàn)的第24天）受試者禁食12 h后，早晨空腹給藥，給藥后4 h進(jìn)統(tǒng)一食譜的標(biāo)準(zhǔn)餐。多次給藥第19天、第20天的采血點(diǎn)為受試者的谷濃度點(diǎn)，即19、20 d。達(dá)穩(wěn)態(tài)后，多次給藥第21天給藥前（0 h）和給藥后 10、20、30、45 min，1、1．5、2、2．5、3、4、6、9、14、24、36、48、72 h分別采集靜脈血5 mL，離心5min（4000r·min-1），分離血漿，置-80℃保存待測(cè)。

用LC-MS/MS法測(cè)定血漿中炔雌醇的濃度，采用DAS 2．0軟件計(jì)算主要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

3 結(jié) 果

3.1 特異性考察

炔雌醇和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為4．28 min和1．74 min，無(wú)雜峰干擾測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 炔雌醇色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及定量下限

配制含炔雌醇濃度分別為1．059、3．176、10．59、31．76、63．52、127．0、211．7 pg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿各1 mL，在每支標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿離心管中精密加入內(nèi)標(biāo)溶液（5．210 μg·mL-1）20 μL，旋渦混勻，按“2．3”項(xiàng)下方法操作后進(jìn)行分析，計(jì)算炔雌醇丹酰氯衍生物的峰面積As與內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f（f=As/Ai）。以峰面積比值f分別對(duì)炔雌醇的血藥濃度c作權(quán)重回歸計(jì)算，得炔雌醇的回歸方程：f=0．00516c+0．00148，r=0．9985，權(quán)重系數(shù)w=1/c2。結(jié)果顯示，炔雌醇的血藥濃度在1．059～211．7 pg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為1．059 pg·mL-1，信噪比為48。

3.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)

在定量下限，低、中、高質(zhì)控樣品（含炔雌醇濃度分別為1．059、2．647、21．17、169．4 pg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿）4個(gè)濃度水平，采用3個(gè)分析批，每批每個(gè)濃度5份樣品，對(duì)該方法進(jìn)行準(zhǔn)確度與批內(nèi)和批間精密度考察，結(jié)果見(jiàn)表2。炔雌醇的準(zhǔn)確度與批內(nèi)和批間精密度符合生物樣品分析要求。

3.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)

按文獻(xiàn)報(bào)道的方法[7]，配制并處理炔雌醇濃度分別為2．647、21．17、169．4 pg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，考察提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)（ME）。測(cè)定得血漿中內(nèi)標(biāo)的回收率為 （88．2±1．8）%，ME為 （97．3± 2．6）%，血漿中炔雌醇和內(nèi)標(biāo)的回收率及ME見(jiàn)表2。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)條件下炔雌醇和內(nèi)標(biāo)的回收率均良好，血漿基質(zhì)對(duì)其離子化及測(cè)定無(wú)影響。

表2 血漿中炔雌醇LC-MS/MS測(cè)定方法的精密度、準(zhǔn)確度、回收率和基質(zhì)效應(yīng)（±s，n=5）

表2 血漿中炔雌醇LC-MS/MS測(cè)定方法的精密度、準(zhǔn)確度、回收率和基質(zhì)效應(yīng)（±s，n=5）

質(zhì)量濃度/ pg·mL-1RSD/%批內(nèi)批間準(zhǔn)確度/ %提取回收率/ %基質(zhì)效應(yīng)/ % 1．059 9．6 10．1 98．6±10．8 --2．647 8．3 5．0 107．5±3．0 72．0±6．0 100．4±3．1 21．17 4．5 4．1 96．7±3．1 70．4±3．9 95．8±1．2 169．4 3．5 7．1 91．8±2．4 69．3±2．7 97．2±4．6

3.5 穩(wěn)定性考察

配制炔雌醇濃度分別為2．647、169．4 pg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿若干份，其中3份按“2．3”項(xiàng)下方法處理后，立即測(cè)定；另取3份室溫放置8 h、3份反復(fù)凍融3次及-20℃冰凍放置78d，考察血漿樣品穩(wěn)定性；同時(shí)考察血漿樣品提取后的殘?jiān)谑覝胤胖? h及-20℃冰凍放置75 h，血漿樣品提取并衍生化后的炔雌醇丹酰氯衍生物于進(jìn)樣器15℃放置18 h及室溫放置8 h的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，炔雌醇各考察項(xiàng)穩(wěn)定性良好，炔雌醇丹酰氯衍生物室溫放置8h穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)考察了不同pH衍生化條件下，炔雌醇丹酰氯衍生物的室溫放置穩(wěn)定性，結(jié)果表明不同pH衍生化條件下，炔雌醇丹酰氯衍生物在室溫中均有不同程度的降解，pH為10．5時(shí)炔雌醇丹酰氯衍生物最穩(wěn)定，為最適衍生化pH值。

3.6 藥動(dòng)學(xué)研究

12名中國(guó)健康女性受試者單次和連續(xù)21 d口服左炔諾孕酮炔雌醇片 （每片含0．02 mg炔雌醇和0．1 mg左炔諾孕酮）后炔雌醇的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3。本文首次報(bào)道了中國(guó)健康女性受試者在單次和連續(xù)21 d口服左炔諾孕酮炔雌醇片后炔雌醇的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，cmax、tmax和AUC的結(jié)果見(jiàn)表3；t1/2分別為 （12．36±4．42）h和 （15．44±3．81）h，MRT0-72分別為（12．2±3．2）h和（17．3±3．2）h，Cl/F分別為（37．67±16．17）L·h-1和（23．15±14．37）L·h-1，Vd/ F分別為（609．6±174．8）L和（408．7±94．2）L。將第19天、第20天和第21天的三組谷濃度點(diǎn)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明在給藥第21天時(shí)炔雌醇已達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度。將本研究獲得的炔雌醇的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與國(guó)外已上市同品種、同劑量的左炔諾孕酮炔雌醇片Alesse誖和Levlite誖的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較（見(jiàn)表3），結(jié)果表明中國(guó)女性受試者口服左炔諾孕酮炔雌醇片后，體內(nèi)炔雌醇的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與國(guó)外女性受試者基本一致。

4 討 論

血漿樣品中炔雌醇經(jīng)過(guò)提取后的殘?jiān)趬A性條件下進(jìn)行衍生化后形成磺酰酯結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)衍生化時(shí)間和溫度的考察，結(jié)果表明，炔雌醇與丹酰氯丙酮溶液在60℃反應(yīng)6min時(shí)產(chǎn)率最高。但是磺酰酯結(jié)構(gòu)在堿性條件下會(huì)發(fā)生水解，因此本實(shí)驗(yàn)考察了文獻(xiàn)報(bào)道的不同pH衍生化條件下炔雌醇丹酰氯衍生物室溫放置的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，炔雌醇丹酰氯衍生物在室溫中均有不同程度的降解，且pH為10．5時(shí)炔雌醇丹酰氯衍生物最穩(wěn)定，為最適宜衍生化pH值。

圖3 12名中國(guó)健康女性受試者單次和連續(xù)21 d口服左炔諾孕酮炔雌醇片后炔雌醇的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

表3 本研究與Alesse誖、Levlite誖的炔雌醇主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較

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A Sensitive Derivatization Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry Method for the Determination of the Trace Amount of Ethinyl Estradiol in Human Plasma:Method Development and Its Application in a Pharmacokinetic Study

XIN Xiao-fei,WU Yan,HE Yan-na,DING Li*
Department of Pharmaceutical Analysis,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009

Objective:An pre-column derivatization liquid chromatography-tandem mass spectrometry method (LC-MS/MS)for the determination of trace amount of ethinyl estradiol (EE)in human plasma was developed．The method was validated and applied to a pharmacokinetics study in healthy Chinese female volunteers after oral administration of the combination tablets containing 0．02 mg EE and 0．1 mg lev-onorgestrel (LNG)．Methods:The plasma sample was extracted with a mixture of cyclohexane and diethyl ether(7∶1,v/v)．The extract was dried and derived with dansyl chloride at 60℃for 6 min in a buffer solution of pH 10．5,and then analyzed by the developed LC-MS/MS method．Chromatographic separation was per-formed on an Hedera ODS-2 (150 mm×2．1 mm,5 μm)column with a gradient elution system of water con-taining 0．1%acetic acid-methanol(13∶87)．An electrospray ionization source was applied and performed in positive ion mode．The ion transitions recorded in multiple reaction monitoring mode were m/z 530．2→171．1 for derived EE and m/z 430．1→372．2 for internal standard,respectively．Results and Conclusion:The calibration curves were linear over the concentration range of 1．059～211．7 pg·mL-1．After single and multiple doses,cmaxof EE were(58．1±25．1)and(76．5±19．7)pg·mL-1,tmaxof EE were(1．8±0．6)and(1．9±0．9)h,AUC of EE were(611±223)and(762±189)pg·h·mL-1,t1/2of EE were(12．36±4．42)and(15．44±3．81)h,respec-tively．The pharmacokinetic characteristics of EE in Chinese female were reported for the first time．

Pre-column derivatization;Ethinyl estradiol;Dansyl chloride;LC-MS/MS;Pharmacokinetics

R969.1

A

1673-7806（2015）03-259-04

辛?xí)造常?，碩士生 E-mail:xxf492070131@126.com

*通訊作者丁黎，男，博士生導(dǎo)師，教授 E-mail:dinglidl@sina.com

2015-01-12

2015-01-30