依那西普緩解腰椎間盤突出模型大鼠的痛覺過敏并減少趨化因子CCL2和受體的表達

朱 翔，戴 林，朱鳴鏑

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院1.麻醉科;2.骨科，江蘇南通 226001）

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）是臨床常見的一種慢性疾病，它能引起長期的腰痛和坐骨神經(jīng)痛，嚴重影響患者生活質(zhì)量。其發(fā)病機制目前仍不十分清楚。LDH所致的疼痛有機械因素和炎癥介質(zhì)參與的化學(xué)因素［1］。以往研究表明，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在炎性反應(yīng)中是一個重要的靶點，此反應(yīng)是神經(jīng)損傷后形成神經(jīng)病理性疼痛的重要因素［2-3］。TNF-α在一些神經(jīng)病理性疼痛模型和椎間盤細胞中可以誘發(fā)趨化因子 CCL2的產(chǎn)生［4-5］。CCL2，也稱為單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1），可以為暴露于炎癥，感染，外傷，毒素的部位趨化補充單核細胞。證據(jù)表明CCL2通過其受體CCR2在慢性疼痛中起重要作用［6-7］。本研究探討鞘內(nèi)注射依那西普在椎間盤突出引起的神經(jīng)病理性疼痛中的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

Trizol試劑（Invitrogen，美國），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、引物［寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計和合成］（表1），染料法實時熒光定量試劑盒（Takara公司），Mouse-anti-ED-1（Millipore公司），Rabbit-anti-ATF3（Santa Cruz公司）。

表1 實時定量PCR引物序列Table 1 Real time quantitative PCR primer sequence

實驗動物SPF級SD雄性大鼠［南通大學(xué)實驗動物中心，許可證號:SCXK（蘇）2008-0010］，體質(zhì)量200～250 g。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立:腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉，消毒后以L5棘突為中心后正中旁開0.5 cm切口，顯露L5、L6椎間關(guān)節(jié)，咬除L6上關(guān)節(jié)突及部分L5椎弓根及椎板，顯露L5背根神經(jīng)節(jié)及神經(jīng)根。截斷大鼠尾，取其間髓核（nucleus pulposus，NP），將其移植L5 DRG的部位。假手術(shù)組（Sham組）僅切開后暴露DRG，不移植髓核。

取髓核的方法0號線結(jié)扎大鼠尾根部，防止出血，切開椎間盤，取直徑2～3 mm髓核2～3個放置事先準(zhǔn)備的0.9%氯化鈉注射液中。

鞘內(nèi)注射藥物 NP手術(shù)之前1 h，分別鞘內(nèi)注射30 μL 0.9%氯化鈉注射液、依那西普10 μg或100 μg。經(jīng)異氟烷吸入麻醉，使用29 gauge（B-D公司）注射針在第3、4或第4、5腰椎棘突間注射藥物到大鼠蛛網(wǎng)膜下隙，以尾巴出現(xiàn)顫動或突然側(cè)向甩動作為穿刺成功標(biāo)志［8］。

1.2.2 行為學(xué)觀察:術(shù)前1 d和術(shù)后各時間點以及依那西普給藥前后測定大鼠的機械性縮爪閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT），用 von Frey纖維絲以 up-down 法測定［9］。

1.2.3 實時定量PCR檢測:分別處死各組各時間段大鼠各6只，取L5節(jié)段DRG和脊髓，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量PCR反應(yīng)按Takara說明書進行操作。應(yīng)用NCBI的Primer-BLAST進行引物特異性驗證。PCR擴增程序:95℃ 預(yù)變性30 s 95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，并收集熒光，共循環(huán)40次，最后進行融解曲線檢測。結(jié)果分析采用2－△△CT（Livak法）。

1.2.4 免疫熒光染色及圖像分析:正常組，10 d假手術(shù)組和3，10 d NP手術(shù)組SD大鼠每組各5只，腹腔注射戊巴比妥鈉，常規(guī)固定，脫水，切片，片厚14 μm，貼片于防脫載玻片上。免疫熒光染色具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。熒光顯微鏡下觀察，拍片。過程中保持各實驗組的實驗條件一致。每個實驗組有3張玻片，細胞統(tǒng)計總數(shù)＞200個。使用Image J軟件統(tǒng)計各組免疫熒光染色的平均灰度值進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NP誘導(dǎo)快速機械觸誘發(fā)痛

LDH術(shù)后，大鼠手術(shù)側(cè)后爪的機械痛縮爪閾值（PWT）從術(shù)后開始下降，5 d最顯著（P＜0.001），并維持至21 d（P＜0.001）。NP組的PWT在所有時間點上顯著低于假手術(shù)組（P＜0.001）（圖1）。

2.2 NP誘導(dǎo)產(chǎn)生DRG中巨噬細胞浸潤和神經(jīng)元損傷

在正常組和假手術(shù)組只有少量ED-1標(biāo)記的巨噬細胞存在（圖2A，D），但術(shù)后3 d（P＜0.001）和10 d（P ＜0.001）大量增加（圖2B，C，E）。與正常組相比（圖3A），術(shù)側(cè)DRG中ATF3標(biāo)記的受損傷神經(jīng)元在NP后3 d（P＜0.001）和10 d（P＜0.001）有顯著的增加（圖3B，C，E）。同時，10 d假手術(shù)組的ATF3標(biāo)記神經(jīng)元（P＜0.001）與正常組相比也有顯著增加（圖3D，E），并且10 d手術(shù)組與假手術(shù)組相比有顯著增加（P＜0.001）。

圖1 NP誘導(dǎo)的大鼠機械痛敏時程的變化Fig 1 Time course of NP-induced mechanical allodynia in rats

圖2 NP誘導(dǎo)產(chǎn)生DRG中巨噬細胞浸潤Fig 2 NP induced macrophage infiltration in rat DRG（×200）

圖3 NP誘導(dǎo)產(chǎn)生DRG中神經(jīng)元損傷Fig 3 NP induced and neuronal injury in rat DRG（×200）

圖4 NP術(shù)后DRG和脊髓中TNF-α mRNA的表達Fig 4 NP application induces TNF-α mRNA expression in DRG and spinal cord

2.3 NP術(shù)后脊髓和DRG中TNF-α mRNA的表達增加

在DRG中，與正常組相比，TNF-α mRNA的表達在1 d（P＜0.001）增高，維持3 d（P＜0.05）;在脊髓中TNF-α mRNA也在1 d（P＜0.001）和3 d（P ＜0.01）增加（圖4）。

2.4 鞘內(nèi)注射依那西普大鼠緩解機械性痛敏

鞘內(nèi)注射依那西普（100 μg）在 2 d（P＜0.001），3 d（P ＜0.001）和4 d（P＜0.001）緩解了NP誘導(dǎo)的機械痛覺過敏（圖5）。

2.5 鞘內(nèi)注射依那西普抑制DRG和脊髓中CCL2和CCR2的上調(diào)

NP術(shù)后3 d，注射依那西普后可以顯著降低DRG中由NP誘發(fā)的CCL2（P＜0.05）和CCR2 mRNA（P＜0.05）的上調(diào)。同時也降低脊髓中CCL2（P＜0.05）和CCR2 mRNA（P＜0.05）的表達（圖6）。

3 討論

腰椎間盤髓核突出可致病理性神經(jīng)痛，但其具體機制尚未完全明了。過去的主流理論是神經(jīng)機械壓迫學(xué)說。然而，大量臨床圖像和數(shù)據(jù)并不能支持腰椎間盤突出癥患者神經(jīng)壓迫的程度和癥狀、體征有直接關(guān)聯(lián)［10］。其作用機理通常是由局部炎性反應(yīng)誘發(fā)為主，而并不是髓核突出的機械壓迫所致。突出髓核的化學(xué)性致炎特性在椎間盤源性腰腿痛中起著重要作用［11］，而受到壓迫的神經(jīng)根或脊神經(jīng)節(jié)均會產(chǎn)生炎性反應(yīng)，炎性介質(zhì)包括:TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1等。本實驗結(jié)果證明，突出的髓核能誘發(fā)DRG中巨噬細胞的浸潤和神經(jīng)元活性的改變，并引起TNF-α等多種炎性因子的上調(diào)。TNF-α的表達大都集中在脊髓炎性反應(yīng)的早期，很快升至峰值水平，在72 h內(nèi)即降至基線［12］。本實驗結(jié)論也顯示NP能引起了DRG和脊髓中快速的TNF-α mRNA表達增加，說明TNF-α在病理性疼痛的早期產(chǎn)生階段發(fā)揮重要作用，但不參與對病理性疼痛的維持。慢性病理性疼痛的產(chǎn)生和維持是多種炎性因子反應(yīng)的結(jié)果，其中CCL2通過其受體CCR2在慢性疼痛中扮演重要的角色［6］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，CCL2在脊髓中表達并且在神經(jīng)性疼痛中表達會增加。周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，CCL2在背根神經(jīng)節(jié)初級感覺神經(jīng)元中表達并且在神經(jīng)損害后表達上調(diào)［7］。CCL2中和抗體能夠降低因脊神經(jīng)結(jié)扎而導(dǎo)致的機械觸誘發(fā)痛或慢性壓迫引起的坐骨神經(jīng)的損傷。但是，在椎間盤突出引起的慢性疼痛中，早期起作用的TNF-α和維持疼痛產(chǎn)生的CCL2/CCR2之間是否存在相關(guān)關(guān)聯(lián)?目前的還沒有確切的研究。行為學(xué)結(jié)果顯示，鞘內(nèi)注射TNF-α拮抗劑依那西普，抑制了NP誘導(dǎo)的機械觸痛覺過敏;同時PCR結(jié)果顯示，DRG和脊髓中CCL2/CCR2的表達上調(diào)也明顯被抑制。初步揭示了DRG和脊髓中快速的TNF-α上調(diào)可能引發(fā)了CCL2/CCR2的上調(diào)和神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展。

圖6 鞘內(nèi)注射依那西普抑制DRG和脊髓中CCL2和CCR2的上調(diào)Fig 6 Intrathecal injection of etanercept inhibited the mRNA of CCL2 and CCR2 upregulation in DRG and spine cord

圖5 鞘內(nèi)注射依那西普大鼠的左后爪MWT變化Fig 5 Changes of MWT after intrathecal injection of etanercept

綜上所述，本實驗建立了一個良好的LDH動物模型，探討了TNF-α在自體髓核移植所致的神經(jīng)病理性疼痛中的變化及所起的作用，并提出在LDH不同時期靶向作用于TNF-α和CCL2/CCR2信號也許會成為治療慢性根性神經(jīng)病理性疼痛的方法。

［1］Shamji MF，Setton LA，Jarvis W，et al.Proinflammatory cytokine expression profile in degenerated and herniated human intervertebral disc tissues［J］.Arthritis Rheum，2010，62:1974-1982.

［2］Olmarker K，Larsson K.Tumor necrosis factor alpha and nucleus-pulposus-induced nerve root injury［J］.Spine，1998，23:2538-2544.

［3］Xu JT，Xin WJ，Zang Y，et al.The role of tumor necrosis factor-alpha in the neuropathic pain induced by Lumbar 5 ventral root transection in rat［J］.Pain，2006，123:306-321.

［4］Gao YJ，Zhang L，Samad OA，et al.JNK-induced MCP-1 production in spinal cord astrocytes contributes to central sensitization and neuropathic pain［J］.J Neurosci，2009，29:4096-4108.

［5］Yoshida M，Nakamura T，Sei A，et al.Intervertebral disc cells produce tumor necrosis factor alpha，interleukin-1beta，and monocyte chemoattractant protein-1 immediately after herniation:an experimental study using a new hernia model［J］.Spine，2005，30:55-61.

［6］Jung H，Bhangoo S，Banisadr G，et al.Visualization of chemokine receptor activation in transgenic mice reveals peripheral activation of CCR2 receptors in states of neuropathic pain［J］.J Neurosci，2009，29:8051-8062.

［7］Jung H，Toth PT，White FA，et al.Monocyte chemoattractant protein-1 functions as a neuromodulator in dorsal root ganglia neurons［J］.J Neurochem，2008，104:254-263.

［8］Hylden JL，Wilcox GL:Intrathecal morphine in mice:a new technique［J］.Eur J Pharmacol，1980，67:313-316.

［9］ Dixon WJ.Staircase bioassay:the up-and-down method［J］.Neurosci Biobehav Rev，1991，15:47-50.

［10］Mulleman D，Mammou S，Griffoul I，et al.Pathophysiology of disk-related sciatica. I.--Evidence supporting a chemical component［J］.Joint Bone Spine，2006，73:151-158.

［11］Uesugi K，Sekiguchi M，Kikuchi S，et al.The effect of repeated restraint stress in pain-related behavior induced by nucleus pulposus applied on the nerve root in rats［J］.Eur Spine J，2011，20:1885-1891.

［12］Lee YL，Shih K，Bao P，et al.Cytokine chemokine expression in contused rat spinal cord［J］.Neoroehem Int，2000，36:417-425.