SPR技術(shù)檢測(cè)血小板抗體及其臨床應(yīng)用的研究＊

伍昌林，周雪敏，何建安，顧大勇，朱 奕，邵超鵬

（1.廣東省深圳市第二人民醫(yī)院輸血科 518035；2.廣東省深圳市福田區(qū)慢病防治院 518048；3.廣東省深圳市檢驗(yàn)檢疫局保健中心 518045）

輸注血小板可預(yù)防和治療血小板減少或血小板功能缺陷引起的出血，但患者多次輸血后，易產(chǎn)生血小板相關(guān)抗體，導(dǎo)致血小板輸注無效（PTR）［1］。目前，檢測(cè)血小板抗體與交叉配合試驗(yàn)主要是固相法、MAIPA 法和FCM 法等，這些方法或者試劑昂貴，成本較高，增加了患者的負(fù)擔(dān)；或者檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，步驟較多，對(duì)結(jié)果可靠性產(chǎn)生一定影響［2］，同時(shí)該方法指示紅細(xì)胞的保存期短，易造成試劑浪費(fèi)等。表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)是應(yīng)用非標(biāo)記光學(xué)生物傳感器技術(shù)，不需要對(duì)被測(cè)物進(jìn)行標(biāo)記使其可以測(cè)量生物活性分子的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，適用于高通量生物活性分子特別是小分子的篩選，微量未知物的分析，以及在線樣品檢測(cè)，具有高靈敏度、高通量、非標(biāo)記、樣品和試劑耗量小等優(yōu)點(diǎn)［3-6］。因此，作者研究基于SPR 的非標(biāo)記技術(shù)在血小板抗體篩選與配型中的初步應(yīng)用，并以經(jīng)典的參考法單克隆抗體特異性血小板抗原固定術(shù)（MAIPA）進(jìn)行對(duì)比分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年5月至2013年4月在深圳市第二人民醫(yī)院多次輸注血小板的患者106例［至少2次輸注血小板，其中，特發(fā)性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）患者34例，白血病患者46例，骨髓增生異常綜合征（MDS）8例，其他病例18例］，其中，男55例，女51例，年齡8～63歲，中位年齡34.5歲?；颊哐“逵?jì)數(shù)均小于20×109／L或大于20×109／L 且小于100×109／L，但有明顯出血傾向。

1.2 標(biāo)本采集處理與血小板計(jì)數(shù) 分別在血小板輸注前和輸注后1、24h采集患者外周靜脈血2 mL，進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，并計(jì)算血小板增加值（corrected count index，CCI）。CCI＝輸注后血小板增加值×體表面積（m2）／輸入血小板總數(shù)，體表面積＝0.006 1×身高（cm）＋0.012 8×體質(zhì)量（kg）-0.015 29。以1hCCI＞7.5或24hCCI＞4.5為有效，否則為輸注無效。供者的單采血小板由血液中心提供，每袋容量約200 mL 左右，含血小板大于或等于2.5×1011／袋。

1.3 主要儀器與試劑 SPR 分析儀（美國(guó)GWC 公司，SPRimager?Ⅱ型），MAIPA 試劑盒（美國(guó)，Immucor公司），BYL 型離心機(jī)（長(zhǎng)春博研公司），SPR 檢測(cè)芯片（批號(hào)20130124，廣州高通生物技術(shù)有限公司）。通用型O 型血小板凍干粉（批號(hào)20120923）、血小板抗體陽性血清（批號(hào)20120916，陽性對(duì)照）購(gòu)自長(zhǎng)春博德公司。芯片活化液EDC／NHS：1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺（EDC，0.4mol／L）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，0.1mol／L）、pH＝7.4的緩沖液PBS（流動(dòng)相）及再生液甘氨酸（10 mmol／L，pH ＝2.0），封閉液乙醇胺（1mmol／L，pH＝8.5），健康人AB型血清（陰性對(duì)照）、非特異性蛋白NS1對(duì)照血清由本室提供。

1.4 SPR 技術(shù)檢測(cè)血小板抗體條件摸索與方法建立

1.4.1 血小板在SPR 芯片表面固定的影響因素 影響SPR芯片表面血小板固定的因素：主要是離子強(qiáng)度，溶液的pH 值及蛋白抗原的濃度等。本研究是在一定的離子強(qiáng)度下，將血小板抗原進(jìn)行倍比稀釋后，分別點(diǎn)樣芯片，根據(jù)不浪費(fèi)樣品，又能保證達(dá)到一定的固定量的原則，確定血小板抗原的稀釋度。本研究選用不同pH 值（分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）的10 mmol／L醋酸鹽緩沖溶液作為血小板的固定液，探索pH 值對(duì)血小板抗原固定的影響，確定最佳pH 值。

1.4.2 血小板在SPR 芯片表面固定的方法 血小板抗原的固定：根據(jù)前期條件探索，采用氨基耦聯(lián)法在SPR 傳感芯片表面固定相應(yīng)的通用型血小板抗原，檢測(cè)相應(yīng)的血小板抗體。具體的方法：（1）SPR 芯片活化：先室溫下分別溶解0.393 9g EDC（0.4mmol／L）和0.430g NHS（0.1mmol／L），配制成10 mL EDC／NHS 活化液，將SPR 芯片置于活化液中活化30 min，流水沖洗；（2）血小板抗原點(diǎn)樣：用pH 值為6.0 的10 mmol／L乙酸鹽與甘油配制10%的甘油點(diǎn)樣液，將通用型血小板抗原用點(diǎn)樣液作5倍稀釋處理后，取0.5μL 混合液點(diǎn)樣于芯片表面相應(yīng)的位置，室溫下固定1h；（3）芯片表面封閉：將點(diǎn)樣好的SPR 芯片，固定后，安裝在SPR 分析儀上，用PBS液調(diào)選最佳共振角（由最小角至最大角調(diào)試，再確定最佳的共振角約為70～100 之間），基線平穩(wěn)后，用封閉液乙醇胺處理10 min，封閉芯片未反應(yīng)的活化表面。完成后用再生液處理，去除物理吸附的物質(zhì)和封閉液，然后可上樣檢測(cè)。

1.4.3 芯片表面的再生試劑與再生效果 進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)試驗(yàn)時(shí)，先將待檢血清用PBS溶液稀釋后，注入芯片上，每測(cè)一個(gè)樣本后，用再生液再生芯片，然后進(jìn)行下一次測(cè)定，結(jié)果用BIAevaluation軟件分析。芯片的表面再生原理是利用一定濃度的酸、堿或者是高離子強(qiáng)度的溶液脈沖來洗脫抗原與抗體間的結(jié)合，從而達(dá)到傳感芯片的再生。關(guān)于采用再生試劑中本研究嘗試采用了10 mmol／L NaOH，1∶300稀釋的磷酸、pH＝2.0的甘氨酸作為再生試劑，確定最佳的再生試劑類型。

1.4.4 血小板抗原與抗體之間的結(jié)合及性能分析 （1）SPR技術(shù)性能分析：運(yùn)用上述探索的條件及固定的SPR 芯片，將陽性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、患者樣本等作相應(yīng)的檢測(cè)，分析SPR 技術(shù)的穩(wěn)定性、敏感度、特異性，SPR 分析儀檢測(cè)的數(shù)據(jù)運(yùn)用BIAevaluation軟件分析；（2）對(duì)比研究：運(yùn)用SPR 技術(shù)與MAIPA 法（具體操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行）同時(shí)對(duì)106 例多次輸注血小板的患者進(jìn)行血小板抗體篩選，比較2種方法的差異性，并分析它們的性能。

1.5 SPR 芯片技術(shù)在抗體篩選與配型中的初步應(yīng)用 對(duì)患者采用SPR 技術(shù)作配合性試驗(yàn)，選擇配合型血小板輸注，并跟蹤分析臨床療效。具體檢測(cè)方法：將已知的O 型通用血小板（抗原）固定在芯片上，檢測(cè)患者血清中是否有相關(guān)抗體；同樣將血液中心供應(yīng)的機(jī)采血小板洗滌后稀釋，取微量（0.5μL）點(diǎn)樣于芯片上，檢測(cè)血小板抗體陽性患者的血清是否存在SPR信號(hào)的改變，若無信號(hào)改變，說明它們是配型相合，否則為配型不相合。運(yùn)用該技術(shù)對(duì)10例血小板抗體陽性患者選擇配合的血小板進(jìn)行輸注，并進(jìn)行臨床跟蹤分析，研究患者臨床血小板輸注的有效性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血小板固定濃度的條件摸索結(jié)果 采用乙酸緩沖溶液稀釋血小板，分別稀釋5、10、20、50、100倍。結(jié)果表明隨著點(diǎn)樣的濃度增加檢測(cè)分析物（含血小板抗體血清）信號(hào)值增加，稀釋到10 倍后，點(diǎn)樣物的濃度對(duì)檢測(cè)信號(hào)影響不明顯（圖1），因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，確定點(diǎn)樣的血小板濃度均采用10 倍稀釋度。

圖1 血小板固定濃度的條件優(yōu)化結(jié)果

圖2 點(diǎn)樣液pH 值的條件優(yōu)化結(jié)果

2.2 點(diǎn)樣液pH 值的條件摸索結(jié)果 分別采用系列pH 值（分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）的乙酸緩沖溶液作為點(diǎn)樣液稀釋血小板。通入分析物（含血小板抗體血清）結(jié)果表明在pH＝4.5的乙酸緩沖溶液時(shí)具有較強(qiáng)的檢測(cè)信號(hào)（圖2）。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中均采用pH＝4.5的乙酸緩沖溶液作為點(diǎn)樣液固定血小板。

2.3 SPR 芯片檢測(cè)血小板抗體的再生試劑與再生效果 在NaOH 的緩沖溶液中，高分子鏈部分水解，導(dǎo)致基線往下漂移，而采用1∶300稀釋的磷酸基線沒有回到原始基線水平即再生徹底。在采用pH＝2.0的甘氨酸再生后基線基本回到初始值水平，而且再生后探針仍然保持較高的生物活性。故本文采用了pH＝2.0的甘氨酸作為再生試劑。在SPR 芯片上將試劑血小板抗原（包括較多的血小板抗原位點(diǎn)）點(diǎn)樣于不同的位置，進(jìn)行陽性對(duì)照血清的檢測(cè)分析后，再用pH＝2.0的甘氨酸作為再生試劑，重復(fù)3次檢測(cè)，每次檢測(cè)信號(hào)均可回到基線，結(jié)果良好（圖3）。

圖3 SPR 芯片檢測(cè)陽性血清后的再生效果（n＝3）

2.4 SPR 芯片分析血小板抗體陽性血清的檢測(cè)限 在同一張芯片上點(diǎn)樣試劑血小板抗原，并選擇相應(yīng)的7個(gè)區(qū)域，其中，1個(gè)為空白對(duì)照點(diǎn)，另外6個(gè)為樣本檢測(cè)點(diǎn)，分別取標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照陽性血清5、10、20、30、40、60μL，對(duì)應(yīng)的濃度分別為50、100、200、300、400、600ng／mL；以2μL／s的流速進(jìn)樣檢測(cè)，由BIAevaluation分析軟件處理，去除空白對(duì)照值后作圖如下，對(duì)應(yīng)的RU 值如a、b、c、d、e、f曲線所示，具有較好的靈敏度，最低檢測(cè)限為50ng／mL左右（圖4）。

圖4 SPR 芯片檢測(cè)不同濃度的血小板抗體陽性血清的結(jié)果

2.5 SPR 芯片的特異性響應(yīng)結(jié)果 在同一張芯片上點(diǎn)樣試劑血小板抗原與非特異性NS1抗原，其中，1個(gè)點(diǎn)樣為空白對(duì)照點(diǎn)，其余各點(diǎn)為樣本檢測(cè)點(diǎn)，將此點(diǎn)樣好的芯片在SPR 儀上分別檢測(cè)血小板抗體陽性對(duì)照血清與NS1 抗體陽性對(duì)照血清，檢測(cè)血小板抗體陽性對(duì)照血清與NS1抗體陽性對(duì)照血清時(shí)，該芯片特異性較好（圖5）。本研究表明SPR 芯片能特異檢測(cè)血小板抗體（圖5）。

2.6 SPR 芯片技術(shù)與MAIPA 法篩選血小板抗體對(duì)比分析 對(duì)106例臨床多次輸注血小板的患者血清，分別用SPR 芯片技術(shù)和MAIPA 法檢測(cè)，結(jié)果見表1；經(jīng)χ2檢驗(yàn)，χ2＝0.333，P＝0.564，2種方法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SPR 法的靈敏度為91%，特異性為97.9%，總一致性為97.2%（表1）。

圖5 SPR 芯片檢測(cè)2種不同陽性對(duì)照血清的信號(hào)結(jié)果

表1 2種血小板抗體檢測(cè)方法的結(jié)果比較（n＝106，n）

2.7 SPR 芯片技術(shù)檢測(cè)血小板抗體的初步應(yīng)用 將A、B、O同型的供者血小板樣本，經(jīng)洗滌后稀釋，按照上述血小板點(diǎn)樣的條件與方法，點(diǎn)樣于SPR 芯片上，然后根據(jù)前面的檢測(cè)方法，分析患者的血清樣本與供者機(jī)采血小板的相容性。本研究對(duì)SPR 技術(shù)檢測(cè)的其中10例血小板抗體陽性患者，進(jìn)行交叉配合試驗(yàn)，從多位血小板供者中選擇配合型血小板輸注，經(jīng)過臨床隨訪分析，其中，8例患者1h血小板增加值CCI＞7.5，24hCCI＞4.5，為輸注有效，并且患者狀態(tài)良好，另外2例因有其他基礎(chǔ)疾病。說明SPR 技術(shù)可初步應(yīng)用于臨床血小板的抗體篩選與配型（圖6）。

圖6 供者血小板與患者血清交叉配合試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

如何有效輸注血小板，提高臨床療效是研究的熱點(diǎn)課題。由于建立已知HLA 和HPA 基因位點(diǎn)的供者庫(kù)，規(guī)模大，費(fèi)用昂貴，耗時(shí)長(zhǎng)，暫時(shí)無法全面實(shí)施，因此，選擇供受者相同的HLA、HPA 的血小板進(jìn)行輸注目前難以實(shí)施。如果直接通過配合試驗(yàn)選擇與受者相合的血小板，需要一種簡(jiǎn)便適用的檢測(cè)方法［7-8］。目前，國(guó)內(nèi)外臨床上檢測(cè)血小板抗體與配型的方法主要是固相凝集法、酶標(biāo)法、熒光法等，雖然這些方法可檢測(cè)血小板抗體，并可進(jìn)行血小板配型。但是，該方法也存在較多的問題，需要改進(jìn)或開發(fā)新的檢測(cè)方法［9-11］。目前，臨床上常用MAIPA 法、固相凝集法等，但有一定的缺陷，該方法指示紅細(xì)胞的保存期短，易造成試劑浪費(fèi)；檢測(cè)的步驟多，影響因素較多，如ELISA 法，易出現(xiàn)假陰性或假陽性；該方法進(jìn)行臨床檢測(cè)時(shí)需要較多混合的O 型血小板，但血小板表面抗原的復(fù)雜性，抗原譜不明確，易造成抗體的漏檢。因此，需要進(jìn)一步改進(jìn)研究或采用新的檢測(cè)方法。

SPR 技術(shù)不需要對(duì)被測(cè)物進(jìn)行標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)使其可以測(cè)量生物分子在無修飾條件下的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)［12］。因此，SPR 技術(shù)適用于高通量生物分子的直接篩選與在線樣品檢測(cè)。作者將SPR 技術(shù)引入血小板抗體的檢測(cè)與配型的研究上，取得了較好的預(yù)期成果，充分體現(xiàn)了SPR 技術(shù)快速、非標(biāo)記、高通量、高靈敏度的特點(diǎn)［9］。經(jīng)初步研究發(fā)現(xiàn)，SPR 技術(shù)檢測(cè)血小板抗體的穩(wěn)定性、靈敏度與特異性均較好，同時(shí)與MAIPA 法檢測(cè)血小板抗體的結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比研究，它們陽性與陰性結(jié)果的一致性均在95%以上，總有效率也是95%以上。本研究運(yùn)用SPR技術(shù)配型的血小板輸注給10例抗體陽性的患者，經(jīng)臨床隨訪分析效果良好，其中，8例患者1h血小板增加值CCI＞7.5，24hCCI＞4.5，另外2例患者因有其他疾病，影響了血小板輸注的有效率。

SPR技術(shù)不需指示細(xì)胞，克服了MAIPA 法等指示細(xì)胞保存期短的問題，另外MAIPA 法操作步驟多、時(shí)間長(zhǎng)、易出現(xiàn)假陽性等；SPR 技術(shù)可批量點(diǎn)樣，大量檢測(cè)，速度更快；直接檢測(cè)時(shí)，無需標(biāo)記與指示，影響因素少，結(jié)果更穩(wěn)定。此外，SPR 技術(shù)成熟后，運(yùn)用機(jī)器點(diǎn)樣，一張芯片將檢測(cè)更多樣本，同時(shí)能再生處理，多次重復(fù)使用，檢測(cè)的經(jīng)濟(jì)成本將更低。

但是，SPR 技術(shù)使用的血小板譜抗原作為點(diǎn)樣抗原，抗原譜的復(fù)雜性，可能存在抗原譜不全面，可能會(huì)出現(xiàn)血小板稀有抗體漏檢的問題。隨著基因組學(xué)與蛋白組學(xué)的發(fā)展，血小板抗原的全面檢測(cè)，該問題將會(huì)解決；此外SPR 技術(shù)的自動(dòng)化點(diǎn)樣、檢測(cè)與分析的研發(fā)也有待加強(qiáng)。作者相信SPR 技術(shù)成熟后，臨床應(yīng)用將更加簡(jiǎn)便，直接篩查血小板抗體、通過配合試驗(yàn)選擇與受血者相合的血小板顯得更加容易［13-15］，該技術(shù)將應(yīng)用于臨床日常檢測(cè)工作中。

［1］ Hatakeyama N，Hori T，Yamamoto M，et al.Platelet transfusion refractoriness attributable to HLA antibodies produced by donor-derived cells after allogeneic bone marrow transplantation from one HLA-antigen-mismatched mother［J］.Pediatr Transplant，2011，15（8）：E177-182.

［2］ Giannoli C，Nguyen TK，Dubois V.HLA and transfusion：new approaches with LuminexTMtechnology［J］.Transfus Clin Biol，2011，18（2）：218-223.

［3］ 劉儒平，王程，徐萬幫，等.基于生物素-親和素放大的SPR 傳感器檢測(cè)大腸桿菌研究［J］.傳感技術(shù)學(xué)報(bào)，2013，26（6）：522-524.

［4］ Dudak FC，Boyaci IH.Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance（SPR）biosensors［J］.Biotechnol J，2009，4（7）：1003-1011.

［5］ 李瑩，顧大勇，鐘金鋼，等.基于表面等離子體共振的基因芯片制備與檢測(cè)［J］.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2009，26（3）：653-656.

［6］ He JN，Zhao F，Wu CL，et al.Development of a smart dynamic surface chemistry for surface plasmon resonancebased sensors for the detection of DNA molecules［J］.J Mater Chem B，2013，1（40）：5398-5402.

［7］ Leroux D，Canépa S，Viskov C，et al.Binding of heparindependent antibodies to PF4 modified by enoxaparin oligosaccharides：evaluation by surface plasmon resonance and serotonin release assay［J］.J Thromb Haemost，2012，10（3）：430-436.

［8］ Imoto S，Kawamura K，Tokumine Y，et al.Acute non-hemolytic transfusion reactions and HLA class I antibody：advantages of solid phase assay compared with conventional complement-dependent assay［J］.Transfus Med，2010，20（2）：95-103.

［9］ 徐長(zhǎng)根.微柱凝膠法檢測(cè)血小板抗體［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2002，20（5）：272.

［10］ Bub CB，Martinelli BM，Avelino TM，et al.Platelet antibody detection by flow cytometry：an effective method to evaluate and give transfusional support in platelet refractoriness［J］.Rev Bras Hematol Hemoter，2013，35（4）：252-255.

［11］ Nguyen XD，Goebel M，Schober M，et al.The detection of platelet antibodies by simultaneous analysis of specific platelet antibodies and the monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigens：an interlaboratory comparison［J］.Transfusion，2010，50（7）：1429-1434.

［12］ Bakchoul T，Kubiak S，Krautwurst A，et al.Low-avidity anti-HPA-1aalloantibodies are capable of antigen-positive platelet destruction in the NOD／SCID mouse model of alloimmune thrombocytopenia［J］.Transfusion，2011，51（11）：2455-2461.

［13］ Socher I，Andrei-Selmer C，Bein G，et al.Low-avidity HPA-1aalloantibodies in severe neonatal alloimmune thrombocytopenia are detectable with surface plasmon resonance technology［J］.Transfusion，2009，49（5）：943-952.

［14］ Rodius S，Chaloin O，Moes M，et al.The talin rod IBS2alpha-helix interacts with theβ3integrin cytoplasmic tail membrane-proximal helix by establishing charge complementary salt bridges［J］.J Biol Chem，2008，283（35）：24212-24223.

［15］ Hayashi T，Amakishi E，Matsuyama N，et al.Detection of anti-human platelet antibodies against integrinα2β1using cell lines［J］.Blood Transfus，2014，12（Suppl 1）：S273-280.