HIF-1α和MB及eNOS基因多態(tài)性與藏族登山運(yùn)動(dòng)員表型特征的關(guān)聯(lián)分析＊

巴桑卓瑪，邵秀娟，尼瑪玉珍，龔嘎藍(lán)孜，多吉卓瑪，央 拉，柯 楊

（1.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心，西藏拉薩850000；2.中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所，北京100101；3.西藏自治區(qū)人民醫(yī)院B超室，西藏拉薩850000 4.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院遺傳室，北京100142）

近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，高原成為對(duì)人類最具挑戰(zhàn)性的環(huán)境之一。高原世居人群對(duì)高原低氧環(huán)境良好的適應(yīng)能力，是長(zhǎng)期自然選擇和進(jìn)化的結(jié)果，目前有研究初步證明藏族在高原人類群體中已獲得了最佳高原適應(yīng)性［1-2］。

登山運(yùn)動(dòng)本身是一種耐力運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)耗氧跟自然環(huán)境低氧對(duì)人體的壓力存在相似作用，在高原從事登山運(yùn)動(dòng)更加劇了低氧。而西藏登山隊(duì)不僅能在高原惡劣環(huán)境下生存，且能進(jìn)行高強(qiáng)度的登山運(yùn)動(dòng)，但很少有人對(duì)西藏登山運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)能力及遺傳素質(zhì)進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)的研究，因此本項(xiàng)目運(yùn)用分子遺傳流行病學(xué)手段，對(duì)多因素作用的復(fù)雜過(guò)程-運(yùn)動(dòng)能力的遺傳素質(zhì)和高原適應(yīng)進(jìn)行研究。

低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是機(jī)體對(duì)低氧反應(yīng)的一個(gè)極其重要的中介物質(zhì)，可能作為活性氧的受體去感受環(huán)境中的低氧程度，繼而對(duì)一系列的低氧反應(yīng)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，使紅細(xì)胞生成增多，攜氧能力增強(qiáng)，促進(jìn)血管再生和重建能力提高［3］。同時(shí)糖酵解能力增強(qiáng)、細(xì)胞內(nèi)的三磷酸腺苷（ATP）生成增多，滿足機(jī)體的能量需要，提示它在細(xì)胞代謝和氧供給方面發(fā)揮重要的作用，而且還被認(rèn)為是與杰出爆發(fā)力素質(zhì)相關(guān)基因之一［4］。目前對(duì)HIF-1α基因多態(tài)性的研究已有一些報(bào)道，但與低氧訓(xùn)練、低氧適應(yīng)效果個(gè)體差異性的研究較少，尚需進(jìn)一步地研究。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）是低氧調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)及活性的因子之一。研究證實(shí)NO 可以調(diào)節(jié)肺血管舒張狀態(tài)，改善肺局部通氣／血流比值，防止血小板（PLT）凝集，促使氣道平滑肌舒張。已有研究證實(shí)eNOS基因的多態(tài)與急性高原病易感性、高原肺水腫等相關(guān)［5-6］。肌紅蛋白（myoglobin，MB）作為攜氧珠蛋白中的一種，主要在骨骼肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞中表達(dá)，尤其是在Ⅰ型肌纖維細(xì)胞中高表達(dá)，其主要功能是通過(guò)可逆性地與氧結(jié)合和釋放，促進(jìn)氧從細(xì)胞質(zhì)彌散到線粒體，為肌肉組織儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)氧，在機(jī)體的氧利用中發(fā)揮了重要作用［7-8］。因此，本研究應(yīng)用了“候選基因”策略，選擇與高原適應(yīng)相關(guān)的HIF-1α、MB和eNOS基因進(jìn)行分析，并與表型特征做了關(guān)聯(lián)分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本課題共計(jì)獲得115例來(lái)自西藏登山隊(duì)、西藏登山學(xué)校和西藏圣山登山公司3家單位的專業(yè)登山運(yùn)動(dòng)員的臨床表型數(shù)據(jù)及血液樣本，最終有109例合格的血液樣本用于基因分型。樣品中男111 人，占運(yùn)動(dòng)員總?cè)藬?shù)的96.52%，女4人，占3.48%；籍貫為西藏日喀則的占84.35%、其他占15.65%；年齡16～56 歲，其中16～25 歲57 人（47.57%），26～35歲42人（36.52%），36～45歲3人（2.61%），46～55歲12人（10.43%），大于55歲的1人（0.87%）。從事登山年限1～5年的52人（45.22%），6～10年的30人（26.09%），11～15年的18人（15.65%），16～20年的1人（0.87%），20～30年9人（7.83%），30年的以上的5人（4.35%）。受試者均簽訂知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計(jì)問(wèn)卷調(diào)查表 內(nèi)容包括：一般情況（姓名、性別、年齡、民族、籍貫等）和吸煙史、飲酒史、一些遺傳性疾病家族史、治療史等；ABO 血型系統(tǒng)的分型；臺(tái)式血壓儀檢測(cè)血壓；Nellcor NPB-40（USA）檢測(cè)血氧飽和度；SYSMEXpocH-100i型全自動(dòng)三分類血液分析儀（Japan）檢測(cè)紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、血紅蛋白（Hb）和紅細(xì)胞壓積（HCT）；SPIDA5（Micro Medical Limited，Kent，ME1 2AZ，UK）檢測(cè)肺功能；ACUSON CA94043 型超聲診斷儀（USA）按照常規(guī)方法進(jìn)行M 型、二維及彩色多普勒超聲檢測(cè)，根據(jù)儀器提供的測(cè)量軟件獲得心功能各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.2 候選基因的選擇和分型情況 從每個(gè)受試者一次性抽取2～5mL靜脈血液，抽提DNA 用于基因檢測(cè)。經(jīng)過(guò)初步篩選后，有109人／份的數(shù)據(jù)符合標(biāo)準(zhǔn)且完整而用于最后的基因分型數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析。選擇了HIF-1α、MB和eNOS 3個(gè)候選基因利用HapMap databank（www.hapmap.org／cgi-perl／gbrowse／hapmap）共選擇了14個(gè)tSNPs位點(diǎn)，其中HIF-1α共選 擇 了 （rs966824、rs11549467、rs2301104、rs12434438、rs2301113）5 個(gè)tSNPs位點(diǎn)，MB 選擇了（rs1997882、rs7293、rs16995883、rs4140603）4 個(gè)tSNPs位 點(diǎn)；eNOS 基 因 選 擇 了（rs3918227、rs1800783、rs1799983、rs1808593、rs3918188）5個(gè)tSNPs位點(diǎn)，利用Taqman探針技術(shù)完成了全部有效樣本的基因分型工作。

1.2.3 質(zhì)量控制 為了使研究結(jié)果可信，采用了以下措施：（1）設(shè)計(jì)統(tǒng)一的調(diào)查表；（2）為了減小系統(tǒng)誤差，對(duì)調(diào)查人員進(jìn)行統(tǒng)一培訓(xùn)，統(tǒng)一調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)；（3）保證每項(xiàng)測(cè)量數(shù)據(jù)的采集均由同一人完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用±s表示，χ2值進(jìn)行哈迪溫伯格值檢驗(yàn)。單因素方差分析法應(yīng)用于群體間表型的比較。plink軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，采用線性回歸模型計(jì)算基因型對(duì)臨床表型的影響，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床表型結(jié)果 本次調(diào)查獲得115個(gè)登山運(yùn)動(dòng)員的臨床表型數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)登山運(yùn)動(dòng)員雖然在高海拔進(jìn)行高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，但其心功能指數(shù)不僅沒(méi)有下降，反而一些關(guān)鍵指標(biāo)普遍強(qiáng)于平原或高原的正常參數(shù)值，如射血分?jǐn)?shù)（EF）在藏族登山運(yùn)動(dòng)員人群中是（80.73±3.68）%，明顯高于正常范圍（67±8）%，見(jiàn)表1。

表1 藏族運(yùn)動(dòng)員表型數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)描述

2.2 候選基因分型 對(duì)3個(gè)基因MB、HIF1α及NOS3上14個(gè)SNPs位點(diǎn)利用Taqman探針技術(shù)完成了全部有效樣本的基因分型工作。候選SNPs信息及最小等位頻率見(jiàn)表2。所有表型數(shù)據(jù)的數(shù)量性狀與選擇的tSNPs位點(diǎn)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，位點(diǎn)與表型性狀具有顯著相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表2 候選SNPs信息及最小等位頻率

續(xù)表2 候選SNPs信息及最小等位頻率

表3 候選基因SNPs位點(diǎn)與表型數(shù)據(jù)的 數(shù)量性狀關(guān)聯(lián)分析

數(shù)量性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，eNOS 基因上一個(gè)SNP 與IVS相關(guān)；HIF-1α基因的2個(gè)SNP 與RVOT，AO 及MPV 相關(guān)；而MB上2個(gè)SNPs與Hb，RDW 及PLT 相關(guān)（P＜0.05）。

3 討 論

早在20世紀(jì)80年代，人們已經(jīng)了解到人的運(yùn)動(dòng)能力受到很多遺傳因素的影響，表現(xiàn)出很大的個(gè)體差異［9-10］。在長(zhǎng)期低氧環(huán)境選擇壓力下世居高海拔人群則產(chǎn)生了低氧適應(yīng)，表現(xiàn)為低氧耐受表型。而耐力表現(xiàn)與低氧耐受表型相似。有研究證明，在高原低氧條件下，心臟的最大儲(chǔ)備能力與機(jī)體的最大攝氧能力及最大運(yùn)動(dòng)能力間密切相關(guān)。因此，在評(píng)價(jià)高原訓(xùn)練的生理效應(yīng)時(shí)，心功能將是一項(xiàng)重要指標(biāo)。有文獻(xiàn)報(bào)道運(yùn)動(dòng)員在長(zhǎng)期高強(qiáng)度體育訓(xùn)練等因素作用下會(huì)造成心臟重構(gòu)，如心肌肥厚，心室擴(kuò)大，心房擴(kuò)張等現(xiàn)象，人們把這種運(yùn)動(dòng)員肥大心臟稱為“運(yùn)動(dòng)員心臟”，有人認(rèn)為這種心臟增大是運(yùn)動(dòng)員長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)的生理適應(yīng)的結(jié)果，有的認(rèn)為是病理性的疾病，對(duì)此到目前為止仍然說(shuō)法不一。此次調(diào)查發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)員的很多表型數(shù)據(jù)，如心功能指數(shù)普遍高于正常閾值，藏族登山運(yùn)動(dòng)員表現(xiàn)出的反映心功能各項(xiàng)指標(biāo)的增強(qiáng)，提示其可能為適應(yīng)性的生理表型而非病理型的改變。

作為低氧應(yīng)答時(shí)基因表達(dá)和恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的調(diào)節(jié)中心，HIF-1α對(duì)于胚胎的血管形成及存活、缺血心肌的新血管生成和低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程都是非常重要的。此次通過(guò)關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)HIF-1α基因的rs2301113位點(diǎn)與心功能的檢測(cè)指標(biāo)右室流出道和主動(dòng)脈內(nèi)徑相關(guān)。而另一個(gè)位點(diǎn)rs966824與平均血小板體積相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道HIF-1α基因的rs2301113位點(diǎn)與非小細(xì)胞肺癌顯著相關(guān)，并提示其可作為非小細(xì)胞肺癌患者手術(shù)后的預(yù)后指標(biāo)［11］。而且其位點(diǎn)變異可能調(diào)節(jié)結(jié)腸直腸癌患者術(shù)后輔助化療的療效［12］。眾所周知，人體很多疾病的病理過(guò)程都會(huì)有缺氧的問(wèn)題（如心腦血管、腫瘤和呼吸系統(tǒng)等疾?。?，其中腫瘤由于血管微環(huán)境異常造成血液供應(yīng)不足而導(dǎo)致缺氧［13］。因此，推測(cè)生理性的缺氧和病理性的缺氧在分子水平上有其共性的機(jī)制。

eNOS基因上的rs1800783 位點(diǎn)與室間隔膜厚度顯著相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道rs1800783與缺氧缺血性腦病和心血管疾病相關(guān)［14-15］。低氧是心血管疾病發(fā)病過(guò)程中一個(gè)重要的病理生理因素。在海拔8 848m 的地方，大氣壓還不到海平面的1／3，藏族登山運(yùn)動(dòng)員應(yīng)對(duì)高原低氧和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的雙重刺激，需要更高的攝氧能力和更大的心輸出量，由此推測(cè)登山運(yùn)動(dòng)員可能存在某種機(jī)制應(yīng)對(duì)這種刺激從而對(duì)心肌進(jìn)行保護(hù)。而HIF-1α和eNOS等一些基因可能對(duì)這種心臟的重構(gòu)有所貢獻(xiàn)，對(duì)這一復(fù)雜性狀可能發(fā)揮“微效”基因作用，但對(duì)此還未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道，還需要進(jìn)一步深入研究和驗(yàn)證。在缺氧或肌肉急劇運(yùn)動(dòng)時(shí)，肌肉中MB的表達(dá)量是顯著增高的。有文獻(xiàn)報(bào)道，MB 在同樣的氧分壓下結(jié)合氧的量是Hb結(jié)合氧量的6倍，線粒體可以由此方式獲取大量的氧。在對(duì)高原土生動(dòng)物低氧適應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，高原土生動(dòng)物心肌和骨骼肌可儲(chǔ)存大量氧氣來(lái)滿足其氧耗，進(jìn)一步增強(qiáng)其對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)能力［16］。研究發(fā)現(xiàn)高原動(dòng)物和人骨骼肌中的MB的含量比平原水平高［17］。在低氧分壓狀態(tài)下，組織既可以通過(guò)MB儲(chǔ)存氧，同時(shí)也促進(jìn)了氧向細(xì)胞內(nèi)彌散，從而向線粒體供氧，有益于改善組織氧的彌散率，是低氧生理性適應(yīng)機(jī)制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。通過(guò)此次與登山運(yùn)動(dòng)員的表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，筆者發(fā)現(xiàn)MB 上2 個(gè)SNPs（rs16995883和rs4140603）與Hb 水 平，RDW 及PLT 相 關(guān)。提示MB在低氧運(yùn)動(dòng)過(guò)程中在機(jī)體內(nèi)氧的結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)等方面可能發(fā)揮的重要作用來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境低氧和運(yùn)動(dòng)低氧的雙重壓力，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)的其他相關(guān)報(bào)道。

基因多態(tài)性可能是高原習(xí)服、高原適應(yīng)和各種高原病的發(fā)病機(jī)制之一。從遺傳學(xué)角度來(lái)看，高原低氧適應(yīng)和運(yùn)動(dòng)能力及人體的很多表型特征是多基因相互作用的結(jié)果，雖然此次從基因的角度對(duì)高原低氧運(yùn)動(dòng)的分子機(jī)制給了一點(diǎn)提示，但由于運(yùn)動(dòng)員總體樣本少，難以滿足遺傳學(xué)研究的需要，且單從單基因的角度觀察其與表型的關(guān)聯(lián)性難免有局限，再者西藏登山運(yùn)動(dòng)員年齡跨度較大，篩選出一批最佳對(duì)照人群十分困難，無(wú)法進(jìn)行一些重要表型數(shù)據(jù)的對(duì)比研究，因此，本課題篩選出來(lái)的候選信號(hào)不能一概而論，對(duì)于候選信號(hào)的假陽(yáng)性問(wèn)題及候選基因如何發(fā)揮作用，仍需要深入探究。

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