蛇葡萄素對(duì)腎癌786-O 細(xì)胞增殖和凋亡的作用＊

柯 軍，馮繼紅

（1.貴州省人民醫(yī)院藥劑科，貴陽550000；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院，貴州遵義563003）

蛇葡萄素（ampelopsin，AMP）其化學(xué)名稱為3，5，7，3′4′5′-六羥基-2，3雙氫黃酮醇，是藤茶的主要活性成分。藤茶味甘、性涼，又稱為甜茶、甘露茶等，主要分布于廣西、湖南、福建等地，具有清熱解毒、提高免疫力等作用，多用于上呼吸道感染發(fā)熱、消炎止痛、消腫利尿等的輔助治療［1-3］。已有研究表明，AMP有抑制人類腫瘤的作用，包括膀胱癌、乳腺癌和肝癌等［4-7］，但AMP對(duì)腎癌的作用卻少見報(bào)道。為研究AMP對(duì)腎癌786-O 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，2014年2月至2015年1月筆者設(shè)計(jì)并進(jìn)行了如下藥理實(shí)驗(yàn)。本研究采用MTT 法和流式細(xì)胞檢測方法，探究AMP對(duì)體外人腎癌786-O 細(xì)胞增殖與凋亡的作用，為AMP 對(duì)腎癌的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人腎癌786-O 細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑 含量為98%的AMP（西安瑞林生物科技有限公司）；胎牛血清及磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Hyclone公司；Annexin V／PI雙染試劑盒（美國BD 公司）；溴化噻唑藍(lán)（MTT）購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，0.25%胰酶二甲基亞楓（DMSO），青霉素、鏈霉素雙抗購自美國Gibco公司；其余均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）；電子分析天平（余姚紀(jì)銘公司）；酶標(biāo)儀（Bio-TEK 公司）；流式細(xì)胞儀（Becton Dinckingson）；臺(tái)式低速離心機(jī)（Thermo公司）；12 孔及96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶（美國Gibco公司）；高壓蒸汽滅菌器（韓國Lab Tech公司）；超低溫冰箱（海爾公司）；微量加樣器（Thermo公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰公司）。

1.2 方法

1.2.1 AMP、MTT、PI配制 （1）將AMP 粉末溶解于DMSO，制成濃度為64 mg／mL 的藥物原液，保存于4 ℃低溫冰箱，使用時(shí)用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成所需的藥物濃度。（2）用無血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液配制成濃度為5 mg／mL 的MTT 溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。（3）將PI溶液與RNaseA 按1∶1的比例溶解于適量PBS中，配制成PI染液。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將腎癌786-O 細(xì)胞置于RPMI-1640培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗），于5% CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶壁時(shí)（70%～80%）進(jìn)行消化傳代（0.25%的胰酶消化），取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于如下實(shí)驗(yàn)。將其分為正常組和AMP組。

1.2.3 MTT 法檢測細(xì)胞增殖抑制率 取腎癌786-O 細(xì)胞（對(duì)數(shù)期生長期），將其接種于96 孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104／孔。培養(yǎng)24h后，于每孔內(nèi)加入適量的AMP使其終濃度分別為0、5、10、15、20、25和30μg／mL，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄去各孔內(nèi)液體，于每孔內(nèi)加入濃度為5 mg／mL 的MTT 溶液（避光操作）。再次孵育4h后，吸去各孔上清液，每孔內(nèi)加入150μL DMSO 溶液并混勻，待其完全顯色后，于酶標(biāo)儀上用492nm 波長測定光密度（OD）值（OD492）。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按下述公式計(jì)算AMP對(duì)腎癌786-O 細(xì)胞的增殖抑制率：抑制率＝（1-OD實(shí)驗(yàn)／OD對(duì)照）×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 采用Annexin V／PI熒光雙染法檢測細(xì)胞凋亡率。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液（無血清）調(diào)整細(xì)胞濃度至3×105／mL，將其接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板上（每孔1.5mL），緩慢吹打混勻。過夜培養(yǎng)后，加入不同濃度的AMP 藥液100μL，使其終濃度為80、40、20、10及0μg／mL（加入100μL 同體積PBS），培養(yǎng)7h后收集各組細(xì)胞，PBS 清洗3 次，用PBS 調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106／mL。加入Annexin V 液和已配置好的PI液各5μL（避光操作），將其混勻，孵育20min（室溫避光），于流式細(xì)胞儀檢測并分析各組細(xì)胞凋亡率。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 觀察各組腎癌細(xì)胞的形態(tài) 于倒置相差顯微鏡下觀察，正常腎癌786-O 細(xì)胞呈貼壁生長，形態(tài)良好，排列緊密，可見透光性好。經(jīng)AMP處理后，部分細(xì)胞失去了貼壁性，呈現(xiàn)懸浮生長；大部分細(xì)胞表現(xiàn)為形態(tài)皺縮，失去原有形狀；細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞器形態(tài)異常，可見一部分細(xì)胞已死亡，見圖1。

圖1 正常組及AMP 20μg／mL處理組72h腎癌786-O 細(xì)胞形態(tài)（×100）

2.2 不同濃度AMP抑制增殖的作用 經(jīng)不同濃度AMP 處理后，腎癌786-O 細(xì)胞的增殖抑制率，見表1。當(dāng)AMP濃度在5～30μg／mL 時(shí)，隨著AMP 濃度升高，腎癌786-O 細(xì)胞抑制作用逐漸增強(qiáng)，即兩者呈量效關(guān)系，其半數(shù)抑制濃度（IC50）為17.23μg／mL。

2.3 不同濃度AMP 對(duì)腎癌細(xì)胞凋亡的作用 經(jīng)不同濃度AMP處理72h后，凋亡的腎癌786-O 細(xì)胞明顯比AMP 0μg／mL組增多，見表2。不同濃度的AMP 對(duì)腎癌786-O 細(xì)胞凋亡率的作用不同。通過各組間進(jìn)行兩兩比較，AMP 10μg／mL組和AMP 20μg／mL 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），AMP 40μg／mL組和AMP 80μg／mL 之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但80μg／mL和40μg／mL的AMP組分別與20μg／mL和10μg／mL 的AMP 組兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。由圖3條形統(tǒng)計(jì)圖可以看出，AMP 80μg／mL和AMP 40μg／mL組腎癌786-O 細(xì)胞的凋亡率明顯高于AMP 20μg／mL、AMP 10μg／mL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即80 μg／mL和40μg／mL 的AMP 較20μg／mL 和10μg／mL 的AMP更能有效地促進(jìn)腎癌786-O 細(xì)胞凋亡。

表1 不同濃度AMP對(duì)人腎癌786-O 細(xì)胞的增殖 抑制作用（±s）

表1 不同濃度AMP對(duì)人腎癌786-O 細(xì)胞的增殖 抑制作用（±s）

-：表示此項(xiàng)無數(shù)據(jù)。

組別 n 抑制率／%AMP 0μg／mL組3-AMP 5μg／mL組 3 6.45±1.01 AMP 10μg／mL組 3 11.27±3.42 AMP 15μg／mL組 3 30.13±7.37 AMP 20μg／mL組 3 62.76±9.02 AMP 25μg／mL組 3 85.23±5.22 AMP 30μg／mL組3 95.23±4.28

表2 不同濃度AMP對(duì)人腎癌786-O 細(xì)胞的凋亡作用

圖2 不同濃度AMP對(duì)人腎癌786-O 細(xì)胞凋亡率的比較

3 討 論

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）即腎癌，是最常見的腎實(shí)質(zhì)惡性腫瘤，在成年人惡性腫瘤中約占2%～3%，近年來發(fā)病率逐漸升高［8］。迄今為止，腎癌的主要臨床治療手段仍是外科手術(shù)治療，內(nèi)科化療及放療治療均不能有效根治腎癌。然而，隨著生物—心理—社會(huì)醫(yī)學(xué)模式的建立，改善中晚期癌癥患者的生活質(zhì)量日益受到重視。生物治療已經(jīng)成為中晚期腎癌治療的研究熱點(diǎn)及臨床治療的新方向。

目前，抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)主要集中在尋求治療效果顯著、毒性小、不良反應(yīng)少、安全的抗腫瘤藥物，而這些藥物的有效成分多是從天然植物中提取出的。黃酮類藥物多與糖結(jié)合成苷類而普遍存在于植物中，小部分以游離態(tài)的形式存在，是植物的次生代謝化合物［9］。該類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、數(shù)量和種類繁多，具有抗腫瘤、消炎止痛及抗氧化等多種藥理功效［10］。黃酮的主要的藥理成分是AMP，其普遍存在于藤茶等植物中且含量十分豐富［11］。已有研究表明，AMP不僅可顯著抑制消化道腫瘤細(xì)胞增殖，還可顯著抑制其他系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞，但具體的分子機(jī)制仍未闡明［4-7，12-15］。

本研究通過觀察細(xì)胞形態(tài)、MTT 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AMP（20μg／mL）作用72h后，能明顯抑制腎癌786-O 細(xì)胞；AMP 濃度為30μg／mL時(shí)，細(xì)胞抑制率可達(dá)到90%以上，大部分細(xì)胞失去活性或死亡；表明AMP能顯著抑制腎癌786-O 細(xì)胞增殖。流式Annexin V／PI雙染法是測定細(xì)胞凋亡的敏感的方法之一，通過雙重?zé)晒鈽?biāo)記（Annexin V-FITC 和PI）可以清楚辨別并統(tǒng)計(jì)出早期凋亡細(xì)胞的比例。本研究采用流式細(xì)胞學(xué)方法，探究AMP對(duì)體外人腎癌786-O 細(xì)胞凋亡的作用。經(jīng)AMP處理72h后，即可發(fā)現(xiàn)腎癌細(xì)胞的凋亡率顯著上升，在一定的濃度范圍內(nèi)達(dá)到最大凋亡率，如10～20μg／mL、40～80μg／mL 之間，腎癌細(xì)胞凋亡率不會(huì)隨著AMP 的濃度增加而增加，而濃度為40、80μg／mL能有效促進(jìn)人腎癌786-O 細(xì)胞凋亡，這可能跟AMP的量效濃度有關(guān)［3，10］。

綜上所述，AMP可顯著抑制腎癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡，從而起到抗腫瘤的作用，為AMP 的生物治療作用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤腎癌的治療提供了新的線索。然而AMP 作用于腎癌的具體分子機(jī)制目前仍不明確，需進(jìn)一步深入研究。

［1］ 付明，黎曉英，王登守，等.顯齒蛇葡萄葉中黃酮類化合物的研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2015，50（7）：574-575.

［2］ 姚欣，周春權(quán)，林靜瑜，等.復(fù)方藤茶的藥理實(shí)驗(yàn)［J］.福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，17（6）：31-33.

［3］ 陳曉明，倪峰.藤茶藥理作用研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2010，22（1）：16-17.

［4］ 周春權(quán)，姚欣，陳曉明，等.藤茶提取物的抗腫瘤作用研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011，22（6）：640-642.

［5］ 倪峰，姚欣，郭丹，等.蛇葡萄素對(duì)人前列腺癌PC3 細(xì)胞增殖與凋亡的影響［J］.中藥藥理與臨床，2012，28（3）：39-41.

［6］ 姚欣，倪峰，郭丹，等.蛇葡萄素對(duì)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞增殖與凋亡的影響［J］.福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，24（1）：22-24.

［7］ 龍?jiān)疲瑮顫删?，耿燚，等.蛇葡萄素對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞株凋亡的作用研究［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2012，33（22）：4709-4711.

［8］ Guo YL，Zhou LQ.Campbell-walsh urologk［M］.9th Ed.Beijing：Beijing Medical University Press，2009：1668.

［9］ 曹良啟，王曉黎，劉德育.黃酮類化合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展［J］.中藥材，2004，27（10）：785-788.

［10］ 李云霞，賀文智，索全伶，等.黃酮類化合物活性及構(gòu)效關(guān)系研究概況［J］.內(nèi)蒙古石油化工，2004，30（2）：10-12.

［11］ 何桂霞，裴剛，周天達(dá)，等.顯齒蛇葡萄中總黃酮和二氫楊梅素的含 量 測 定［J］.中 國 中 藥 雜 志，2000，25（7）：423-425.

［12］ 鄭作文，郭成賢，唐云麗，等.藤茶蛇葡萄素抗人胃癌細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2007，4（1）：29.

［13］ 劉德育，羅曼，謝冰芬，等.蛇葡萄素的抗腫瘤作用研究［J］.癌癥，2001，20（12）：1372-1375.

［14］ 張瓊，劉德育.蛇葡萄素改變Bc1-2／Bax 表達(dá)和激活Caspase-3誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞Be1-7402凋亡［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25（11）：1502-1506.

［15］ 呂建軍，任潤珍，劉凱，等.蛇葡萄素（AMP）對(duì)SPC-A-1細(xì)胞增殖的抑制作用［J］.中國老年學(xué)雜志，2010，30（6）：798-800.