高糖狀態(tài)下甲狀旁腺素受體1對乳腺癌的作用機制研究＊

梁華晟，鐘宇華

（廣西醫(yī)科大學(xué)第九附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝研究所，廣西北海536000）

近年來，流行病學(xué)研究提示，在糖尿病患者中，乳腺癌的發(fā)生率顯著高于非糖尿病患者群［1］。但具體的機制仍然未闡明。G 蛋白耦聯(lián)受體甲狀旁腺激素受體1（type 1receptor parathyroid hormone，PTH1R）發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)80年代，是甲狀旁腺素相關(guān)蛋白（parathyroid hormone-related protein，PTHrP）的作用受體，PTHrP是一種與細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控相關(guān)的生長因子，既往本課題組研究發(fā)現(xiàn)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中，糖尿病患者PTH1R 陽性表達(dá)率高于非糖尿病患者［2］。為此，本實驗擬進(jìn)行在高糖狀態(tài)下探討PTH1R 對乳腺癌細(xì)胞株中的作用，為尋求糖尿病與乳腺癌之間的內(nèi)在聯(lián)系、糖尿病患者合并乳腺癌的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株選擇及培養(yǎng) 選用大鼠乳腺腺癌細(xì)胞系SHZ-88（中科院）進(jìn)行研究，采用RPMI1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Gibco 公司），置于37 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。每周換液2～3次。

1.2 實時（real time）PCR 檢測PTH1R mRNA表達(dá)分別以0、5、15、25mmol／L葡萄糖為研究濃度，作用48h后應(yīng)用real time PCR 檢測不同濃度下PTH1R mRNA 表達(dá)情況。采用SybrgreenⅠ染料法，總RNA 的抽提與互補DNA（cDNA）的合成按照試劑盒說明書進(jìn)行。本實驗設(shè)定β-actin 為內(nèi)參基因。采用Primer 5.0 軟件設(shè)計相應(yīng)PTH1R 和β-actin 引物。PTH1R 引物序列，正向：5′-AGT ACC GGA AGC TGC TCA GGT C-3′，反向：5′-GCA TCT GGA TCT GCC ACA AT-3′，擴增片段120bp；β-actin引物序列，正向：5′-CCT AGG CAC CAG GGT GTG AT-3′，反向：5′-TTG GTG ACA ATG CCG TGT TC-3′，擴增片段為122bp。各組PTH1RmRNA 分別在熒光定量PCR 儀上進(jìn)行real time PCR 反應(yīng)，△△Ct方法進(jìn)行計算和統(tǒng)計。

1.3 PTH1R 基因沉默SHZ-88細(xì)胞的構(gòu)建及鑒定 參考本研究課題組所構(gòu)建PTH1R 基因沉默的細(xì)胞模型進(jìn)行試驗［7］，共篩選出3個陽性克隆及一個陰性克隆。應(yīng)用pSUPERretro-GFP／Neo載體（美國OligoEngine公司）合成干擾片段后，經(jīng)過菌落PCR 及測序鑒定，應(yīng)用Lipofectamine2000（美國Invitrogen公 司）轉(zhuǎn) 染SHZ-88 細(xì) 胞，48 h 后 Western blot 檢 測PTH1R 蛋白表達(dá)篩選出最佳的PTH1R 干擾片段的SHZ-88細(xì)胞模型。

1.4 MTT 檢測SHZ-88細(xì)胞活力 取濃度 為25mmol／L 葡萄糖為研究濃度。無糖培養(yǎng)基組（對照組）；高糖狀態(tài)（25 mmol／L D-葡萄糖，后同）培養(yǎng)基組（高糖組）；高糖狀態(tài)下的陰性基因序列組（高糖siPTH1R-NC 組）；高糖狀態(tài)下的陽性基因序列組（高糖siPTH1R 組）。在處理后48h進(jìn)行以下實驗。取對數(shù)生長期SHZ-88，按每孔約3×104個接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，吸去原有RPMI 1640培養(yǎng)液，換為含10%小牛血清（FCS）培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h 使所有細(xì)胞的生長同步化。在37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)2d，每孔細(xì)胞均為每24小時換液1次。分別在8、16、24及48h MTT（南京凱基生物技術(shù)公司）法檢測細(xì)胞增殖情況。以于酶標(biāo)儀上檢測490nm 波長吸光度（A）值。

1.5 SHZ-88 細(xì)胞凋亡情況 將細(xì)胞種于干凈蓋玻片上。PBS洗細(xì)胞3次，5min／次。4%甲醛固定20min。70%乙醇-20 ℃30min。PBS洗3次，5min／次。0.1%Triton X-100／0.1%檸檬酸三鈉溶液破膜，室溫10min。PBS洗3次，5min／次。3%H2O2室溫孵育10min封閉內(nèi)源性過氧化物酶。PBS洗3 次，5 min／次。TdT 酶反應(yīng)液（buffer：TdT 酶：FITCdUTP為45∶4∶1）37 ℃濕盒避光孵育90min。PBS洗2次，2min／次，避光。Hoechst33258 復(fù)染核，室溫20 min，避光。0.5%Tween 20-PBS洗3次，2min／次，避光。緩沖甘油封片，拍照。實驗結(jié)果以O(shè)lympusBX51 熒光顯微鏡拍照（×250）。結(jié)果判定：TUNEL-FITC 染色陽性，同時Hoechst33258 染色為強藍(lán)色為凋亡細(xì)胞。TUNEL-FITC 染色陰性，同時Hoechst33258染色淺藍(lán)色為正常細(xì)胞。

1.6 Western blot檢測PTH1R、凋亡因子Bax及抑凋亡因子bcl-2表達(dá) 進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞裂解獲取蛋白后，與預(yù)染蛋白marker一起上樣，經(jīng)分離膠和濃縮膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，完畢后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，將膜放入含100g／L 脫脂奶粉的TBST中封閉，4 ℃過夜，然后與一抗［鼠 抗PTH1R（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）及Bcl-2（1∶750）均為美國Santa Cruz公司］室溫孵育90min或4 ℃過夜，用TBST 液洗膜3次，每次5min，PVDF膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗（武漢Boster公司，1∶1 000）室溫孵育45 min 后，TBST 液洗膜3次，每次5min。ECL顯色試劑盒顯示目的條帶。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同葡萄糖濃度對SHZ-88細(xì)胞株P(guān)TH1R mRNA 水平及細(xì)胞活性的影響 應(yīng)用real time PCR 檢測不同濃度葡萄糖對SHZ-88細(xì)胞中PTH1R mRNA 水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)25mmol／L葡萄糖作用SHZ-88細(xì)胞PTH1R mRNA 水平高于其他3組葡萄糖濃度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。且PTH1R mR-NA 水平隨著葡萄糖濃度升高而升高，提示SHZ-88 細(xì)胞中PTH1R mRNA 水平具有葡萄糖濃度依賴性。為進(jìn)一步檢測不同濃度葡萄糖對SHZ-88 細(xì)胞活性的影響，研究將應(yīng)用MTT 檢測各組細(xì)胞活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SHZ-88細(xì)胞活性具有葡萄糖濃度依賴性，25mmol／L葡萄糖濃度刺激下SHZ-88細(xì)胞活性高于0、5、15mmol／L葡萄糖的作用。見表1。

表1 不同濃度葡萄糖對PTH1R mRNA 及細(xì)胞 活性的影響（±s）

表1 不同濃度葡萄糖對PTH1R mRNA 及細(xì)胞 活性的影響（±s）

a：P＜0.05，與0 mmol／L 葡萄糖比較；b：P＜0.01，與0 mmol／L葡萄糖比較；c：P＜0.01，與5mmol／L 葡萄糖比較；d：P＜0.01，與15 mmol／L 葡萄糖比較。

葡萄糖濃度（mmol／L） PTH1R mRNA 細(xì)胞活性（%）0 1.00±0.00 0.55±0.04 5 1.13±0.11 0.57±0.02 15 1.18±0.05a 0.61±0.03a 25 1.57±0.11bcd 0.68±0.01 bcd

2.2 通過PTH1R 基因沉默SHZ-88細(xì)胞模型確定 PTH1R mRNA水平及細(xì)胞Western blot結(jié)果提示轉(zhuǎn)染48h后siPTH1R-2中PTH1R 蛋白表達(dá)抑制率達(dá)到60%以上，高于siPTH1R-1及siPTH1R-3，故此，siPTH1R-2基因序列為最佳PTH1R 抑制基因序列，用于后續(xù)研究。

2.3 PTH1R 對高糖狀態(tài)下SHZ-88細(xì)胞增殖及凋亡的影響 應(yīng)用MTT 檢測24～96h的SHZ-88細(xì)胞活力，以闡明細(xì)胞增殖能力，結(jié)果在48h時，高糖組細(xì)胞活力高于對照組、高糖siPTH1R-NC組及高糖siPTH1R 組（均P＜0.01），同時與對照組及高糖siPTH1R-NC組比較，高糖siPTH1R 組細(xì)胞活力受顯著抑制（均P＜0.01），見圖1。為進(jìn)一步觀察PTH1R 對SHZ-88細(xì)胞凋亡的影響，應(yīng)用TUNEL-FITC／Hoechst33258檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果如圖2所示高糖siPTH1R 組細(xì)胞凋亡水平（9.13±1.61）%，顯著高于對照組（0.88±0.21）%、高糖組（0.71±0.23）%及高糖siPTH1R-NC 組（0.96±0.12%）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。該系列結(jié)果說明高糖狀態(tài)下PTH1R表達(dá)水平可能影響了SHZ-88細(xì)胞的增殖及凋亡。在高糖siPTH1R-NC組較高糖組細(xì)胞增殖水平降低、凋亡增高，考慮可能與轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞毒性有關(guān)。

圖1 PTH1R 對高糖狀態(tài)下SHZ-88細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 PTH1R 對高糖狀態(tài)下SHZ-88細(xì)胞中Bax及Bcl-2表達(dá)的影響 與對照組、高糖組及高糖siPTH1R-NC 組比較，PTH1R 干擾處理后，促凋亡因子Bax表達(dá)上調(diào)，同時促增殖因子Bcl-2表達(dá)下調(diào)（均P＜0.01），高糖組中Bax表達(dá)低于對照組，Bcl-2表達(dá)高于對照組（均P＜0.01），進(jìn)一步提示高糖狀態(tài)下PTH1R 可能通過影響B(tài)ax及Bcl-2 的表達(dá)水平調(diào)控了SHZ-88細(xì)胞的存活能力。見圖3。

圖2 細(xì)胞凋亡水平檢測

圖3 PTH1R 對高糖狀態(tài)下SHZ-88細(xì)胞Bax及Bcl-2表達(dá)影響

3 討 論

近年來，由于糖尿病患者乳腺癌發(fā)病人數(shù)的迅猛增長，糖尿病和乳腺癌的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注。大量流行病學(xué)證據(jù)表明糖尿病患者乳腺癌的發(fā)病率和病死率較非糖尿病患者顯著增加［1］。糖尿病患者高發(fā)乳腺癌的原因及其機制目前仍不十分清楚，一般認(rèn)為和高糖、胰島素抵抗和（或）高胰島素血癥等因素有關(guān)。流行病學(xué)研究表明PTHrP及其受體PTH1R與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，特別在乳腺癌的轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。目前，有關(guān)PTH1R 與乳腺癌相關(guān)方面的研究較少，既往本課題組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)糖尿病合并乳腺癌患者的PTH1R 表達(dá)水平顯著高于非糖尿病乳腺癌患者［2］，但其作用機制尚未完全清楚。

為進(jìn)一步闡明高糖誘導(dǎo)PTH1R 表達(dá)后對SHZ-88細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，本研究將引入PTH1R 基因沉默的細(xì)胞模型進(jìn)行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高糖狀態(tài)下PTH1R 基因沉默的SHZ-88細(xì)胞活力分別比較高糖組及高糖siPTH1R-NC 組下降，而且PTH1R 低表達(dá)能顯著促進(jìn)SHZ-88細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)促凋亡因子Bax表達(dá)上調(diào)，抑制促增殖因子Bcl-2表達(dá)，相應(yīng)在高糖狀態(tài)下SHZ-88細(xì)胞增殖活性顯著高于對照組。由于葡萄糖是刺激或維系腫瘤細(xì)胞生長主要營養(yǎng)物質(zhì)，Okumura等［3］研究發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖（25mmol／L 葡萄糖）能刺激人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞增殖，既往的研究還發(fā)現(xiàn)各種與葡萄糖調(diào)節(jié)有關(guān)的細(xì)胞因子或激素，包括胰島素、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78等均是調(diào)控乳腺癌增殖的重要轉(zhuǎn)錄因子，該系列因子由葡萄糖誘導(dǎo)表達(dá)后，能顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，抑制凋亡［4-7］。Dittmer等［8］在應(yīng)用基因干擾技術(shù)沉默PTHrP后也發(fā)現(xiàn)能抑制乳腺癌細(xì)胞株的增殖。

既往本課題研究也已經(jīng)提示，由于PTHrP 及其受體PTH1R 在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，PTH1R的激活與腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān)，PTH1R 陽性的腫瘤比陰性的腫瘤有更大的惡性傾向，高糖狀態(tài)下乳腺癌細(xì)胞PTH1R表達(dá)升高，并與其預(yù)后相關(guān)［2］。結(jié)合本研究的結(jié)果提示高糖可以直接刺激PTH1R 的表達(dá)，從而影響乳腺癌細(xì)胞的增殖，PTH1R 可能是高糖狀態(tài)下腫瘤細(xì)胞生存保護性因素之一。也逆向提示了抑制PTH1R 的表達(dá)可能是治療糖尿病合并乳腺癌的有效靶點之一。

［1］ Michels KB，Solomon CG，Hu FB，et al.Type 2diabetes and subsequent incidence of breast cancer in the Nurses′Health Study［J］.Diabetes Care，2003，26（6）：1752-1758.

［2］ 黃宇，梁華晟，鐘宇華，等.甲狀旁腺激素受體1在糖尿病合并乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者的表達(dá)及意義［J］.山東醫(yī)藥，2012，52（36）：40-41.

［3］ Okumura M，Yamamoto M，Sakuma H，et al.Leptin and high glucose stimulate cell proliferation in MCF-7human breast cancer cells：reciprocal involvement of PKC-alpha and PPAR expression［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2002，1592（2）：107-116.

［4］ Schmidt M，Voelker HU，Kapp MA，et al.Glycolytic phenotype in breast cancer：activation of Akt，up-regulation of GLUT1，TKTL1 and down-regulation of M2Pk［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2010，136（2）：219-225.

［5］ Gunter MJ，Hoover DR，Yu HA，et al.Insulin，Insulin-Like growth Factor-I，and risk of breast cancer in postmenopausal women［J］.J Natl Cancer Inst，2009，101（1）：48-60.

［6］ Yeung B，Kwan B，He QY，et al.Glucose-regulated protein 78 as a novel effector of BRCA1for inhibiting stress-induced apoptosis［J］.Oncogene，2008，27（53）：6782-6789.

［7］ Kuo SJ，Wu YC，Chen CP，et al.Expression of glucose transporter-1in Taiwanese patients with breast carcinoma--apreliminary report［J］.Kaohsiung J Med Sci，2006，22（7）：339-345.

［8］ Dittmer A，Vetter M，Schunke D，et al.Parathyroid hormonerelated protein regulates tumor-relevant genes in breast cancer cells［J］.J Biol Chem，2006，281（21）：14563-14572.