Cx37和Cx40在自發(fā)性高血壓大鼠不同動(dòng)脈間的表達(dá)差異＊

潘立君，李新芝，卓泓宇，李 麗，魏麗麗，于秀石，司軍強(qiáng)，馬克濤△

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院：1.生理學(xué)教研室；2.病理生理學(xué)教研室，新疆維吾爾自治區(qū)石河子832002）

高血壓作為全球人類最常見(jiàn)的慢性病，是心、腦血管疾病導(dǎo)致死亡的主要危險(xiǎn)因素。外周血管壓力增高是高血壓的直接發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，而心、腦血管疾病發(fā)病的關(guān)鍵部位是血管［1-2］。冠心病的根本原因在于冠狀動(dòng)脈的病變，心臟只是血管病變的“旁證者”和“受害者”，腦卒中本身是腦血管的病變，繼而引起神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。心腦血管疾病發(fā)病的關(guān)鍵是血管緊張度的增加，而血管緊張度與通過(guò)細(xì)胞間縫隙連接為途徑進(jìn)行的電、化學(xué)信息交流的異常改變密切相關(guān)［3］?？p隙連接通道存在于相鄰的兩個(gè)細(xì)胞間，連接蛋白（connexin，Cx）是構(gòu)成縫隙連接通道的基本單位。目前研究發(fā)現(xiàn)，高血壓的發(fā)生、發(fā)展與連接蛋白的異常改變密切相關(guān)。例如，特異性敲除小鼠內(nèi)皮細(xì)胞Cx40 基因后伴隨著高血壓和心肌肥厚［4］。Cx40 基因多態(tài)性是高血壓的危險(xiǎn)因素［5］。本研究在前期基礎(chǔ)上觀察了自發(fā)性高血壓和正常血壓大鼠腸系膜動(dòng)脈和主動(dòng)脈上Cx37和Cx40 表達(dá)的差異，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)選用20 周齡的雄性正常血壓Wistar大鼠10 只為對(duì)照組，20 周齡的雄性自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）10只為SHR組，大 鼠 體 質(zhì)量均200～300 g，分別購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和北京維通利華有限責(zé)任公司。

1.1.2 主要試劑和儀器Trizol 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司），BCA蛋白分析試劑盒（美國(guó)Pierce 公司），PrimeScript ? RT試劑盒（日本Takara 公司），ECL檢測(cè)試劑盒（美國(guó)GE Healthcare 公司），一抗和二抗（美國(guó)Santa Cruz公司），NanoDropTM1000分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific 公司），BP-6 無(wú)創(chuàng)血壓監(jiān)測(cè)儀（四川成都泰盟公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)定 對(duì)照組及SHR組于40 ℃預(yù)熱15 min，大鼠清醒安靜狀態(tài)下用BP-6 無(wú)創(chuàng)血壓監(jiān)測(cè)儀測(cè)量尾動(dòng)脈血壓。

1.2.2 定量RT-PCR 檢測(cè) 用Trizol 試劑提取動(dòng)脈總RNA，經(jīng)Nano drop 檢測(cè)RNA濃度和純度。取200ng 總RNA按照操作說(shuō)明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為c DNA后，同時(shí)擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參β-actin。在GenBank上獲取大鼠Cx 37和Cx40 mRNA序列。Cx37上 游 引 物：5′-GCA GTG CCT CAG ACC CTT AC-3′，下游引物：5′-GGA TGA GAG CCC ATT GTA GG-3′，引物序列長(zhǎng)度為20 bp；Cx40上游引物：5′-CCA CAA GCA CTC TAC GGT CA-3′，下 游 引 物：5′-GCA ACC AGG CTG AAT GGT AT-3′，引物序列長(zhǎng)度為20 bp。

1.2.3 Western blot 檢測(cè) 將動(dòng)脈放入預(yù)冷的RIPA緩沖液中，用電動(dòng)勻漿器冰上充分勻漿，離心取上清液后采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。梯度膠（4%～12%）恒壓電泳分離，至溴酚藍(lán)指示劑顯示蛋白充分分離后，將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，置于含5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉1 h，一抗（1∶1000）4℃過(guò)夜，二抗（1∶5000）中室溫孵育1 h，TBST清洗3 次后與ECL 反應(yīng)1 min，置于X線膠片暗盒中曝光、顯影。測(cè)定蛋白條帶的光密度并進(jìn)行定量分析［6］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照組和SHR組尾動(dòng)脈血壓 對(duì)照組的收縮壓為（121.5±6.9）mm Hg，SHR組的收縮壓為（207.3±10.5）mm Hg，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 SHR組和對(duì)照組腸系膜動(dòng)脈和主動(dòng)脈Cx37 m RNA的表達(dá)

圖2 SHR組和對(duì)照組腸系膜動(dòng)脈和主動(dòng)脈Cx40 mRNA的表達(dá)

2.2 對(duì)照組和SHR組腸系膜動(dòng)脈和主動(dòng)脈C x 37和Cx40 m RNA的表達(dá)定量R T-P C R法檢測(cè)對(duì)照組和S HR組腸系膜動(dòng)脈和主動(dòng)脈Cx37和Cx40 mRNA的表達(dá)。與對(duì)照組相比，SHR組腸系膜動(dòng)脈Cx 37mRNA的表達(dá)降低（P＜0.05），主動(dòng)脈降低更為顯著（P＜0.01），見(jiàn)圖1；腸系膜動(dòng)脈Cx40 mRNA的表達(dá)顯著降低（P＜0.01），而主動(dòng)脈則沒(méi)有變化（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 對(duì)照組和SHR組腸系膜動(dòng)脈和主動(dòng)脈連接蛋白蛋白水平的比較Western blot 法檢測(cè)對(duì)照組和SHR組腸系膜動(dòng)脈和主動(dòng)脈Cx37 和Cx40 的蛋白表達(dá)，光密度測(cè)定及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：與對(duì)照組相比，SHR組腸系膜動(dòng)脈Cx 37蛋白的表達(dá)降低（P＜0.05），主動(dòng)脈降低更為顯著（P＜0.01），見(jiàn)圖3；腸系膜動(dòng)脈Cx40 蛋白的表達(dá)降低（P＜0.05），而主動(dòng)脈則沒(méi)有變化（P＞0.05），見(jiàn)圖4。

圖3 SHR組和對(duì)照組腸系膜動(dòng)脈和主動(dòng)脈Cx37蛋白的表達(dá)

圖4 SHR組和對(duì)照組腸系膜動(dòng)脈和主動(dòng)脈Cx40 蛋白的表達(dá)

3 討 論

相鄰細(xì)胞間通過(guò)縫隙連接進(jìn)行著物質(zhì)、能量和信息的交換，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和新陳代謝等生理過(guò)程起著重要的調(diào)控作用，在血管調(diào)節(jié)中尤為突出［7-8］。例如，血管同步舒縮在正常血管功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞之間連接形成的縫隙連接通道是血管同步舒縮的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。血管發(fā)揮正常的功能需要血管壁細(xì)胞之間活動(dòng)的同步性，因此血管的正常功能活動(dòng)有賴于管壁細(xì)胞之間通訊系統(tǒng)的完整。此外，多種疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過(guò)程中縫隙連接都發(fā)揮著重要作用。癲癇形成的重要因素之一就是縫隙連接促使相鄰細(xì)胞形成同步化活動(dòng)造成異常放電［9］。由于縫隙連接的表達(dá)或功能的降低可能使某些細(xì)胞脫離了與正常細(xì)胞的胞間聯(lián)系及正常的調(diào)控，最終發(fā)展成為無(wú)序生長(zhǎng)的惡性腫瘤［10］。本研究發(fā)現(xiàn)SHR組腸 系 膜動(dòng)脈上Cx37 和Cx40 的表達(dá)降低，而主動(dòng)脈上只有Cx37 的表達(dá)降低，Cx40 的表達(dá)沒(méi)有明顯變化。

大量有關(guān)SHR或誘導(dǎo)大鼠高血壓病模型的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，連接蛋白的表達(dá)會(huì)在疾病狀態(tài)下發(fā)生改變。遺憾的是，研究的實(shí)驗(yàn)條件差異較大，導(dǎo)致結(jié)論不甚一致。例如，前期研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用NO合酶抑制劑所致的高血壓模型動(dòng)物的主動(dòng)脈上Cx40 的表達(dá)沒(méi)有變化，而Cx37的表達(dá)則相對(duì)于對(duì)照組減少［11］，與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相一致。但是在兩腎一夾所致的腎性高血壓模型動(dòng)物血管上Cx40 的表達(dá)卻是增加的。此外，在SHR上連接蛋白的變化相對(duì)于其他原因所致的高血壓更加復(fù)雜，有研究發(fā)現(xiàn)Cx40 和Cx37 在血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)都減少［12-13］，與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相一致。但也有報(bào)道稱在SHR腎入球動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈上Cx37 的表達(dá)既有增多亦有減少，但Cx40 的表達(dá)沒(méi)有變化［14-15］。上述連接蛋白在高血壓中的表達(dá)差異可能與動(dòng)物模型、檢測(cè)方法及部位的不同相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)選擇了不同部位的動(dòng)脈進(jìn)行比較研究，也發(fā)現(xiàn)Cx40 在腸系膜動(dòng)脈和主動(dòng)脈在高血壓時(shí)的表達(dá)改變是不同的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示高血壓通過(guò)降低血管細(xì)胞上Cx37 和（或）Cx40 的表達(dá)造成細(xì)胞間縫隙連接通訊異常，引起血管功能紊亂，加重了高血壓造成的損害。因此，血管細(xì)胞間的縫隙連接的異常改變可能在高血壓的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。

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