兩種檢測(cè)試劑盒對(duì)豬瘟抗體水平檢測(cè)結(jié)果的比較

李　麗，徐　璐，王　琴，李金海，鄧　飛，周莉媛，陳弟詩(shī)，張　毅，張　睿（.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川成都6004；.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京海淀0008）

兩種檢測(cè)試劑盒對(duì)豬瘟抗體水平檢測(cè)結(jié)果的比較

李麗1，徐璐2，王琴2，李金海1，鄧飛1，周莉媛1，陳弟詩(shī)1，張毅1，張睿1
（1.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川成都610041；2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京海淀100081）

摘要：選擇一種由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所研制的國(guó)產(chǎn)試劑盒與美國(guó)IDEXX公司的進(jìn)口試劑盒對(duì)300份豬血清同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，兩種試劑盒的符合率為83.67%；國(guó)產(chǎn)試劑盒檢出的陽(yáng)性率高于進(jìn)口試劑盒；對(duì)檢測(cè)結(jié)果不一致的49份血清用熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（FVNT）進(jìn)行了復(fù)核，國(guó)產(chǎn)試劑盒與FVNT的符合率為63.2%，進(jìn)口試劑盒與FVNT的符合率為31.6%。試驗(yàn)結(jié)果表明，國(guó)產(chǎn)試劑盒具有更高的敏感性，能滿足我國(guó)豬瘟抗體監(jiān)測(cè)的需要。

關(guān)鍵詞：豬瘟抗體；ELISA檢測(cè)試劑盒；FVNT；符合率

豬瘟是困擾我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的最主要的疫病之一，由于疫苗的廣泛使用，豬瘟流行形式由過(guò)去大面積的高發(fā)多發(fā)變?yōu)榫植康臏睾托偷纳l(fā)。豬瘟抗體檢測(cè)是疫苗免疫效果評(píng)價(jià)主要方法，而ELISA檢測(cè)方法又以其操作簡(jiǎn)便、方法敏感、檢測(cè)樣本量大等優(yōu)點(diǎn)成為豬瘟抗體檢測(cè)的主要手段。目前，市場(chǎng)上檢測(cè)豬瘟抗體的ELISA試劑盒繁多，主要以進(jìn)口試劑盒為主。由于進(jìn)口試劑盒價(jià)格昂貴，給基層抗體普查工作造成很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此我們選擇一種國(guó)產(chǎn)化豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒，與進(jìn)口試劑盒同時(shí)對(duì)同一批血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，并采用豬瘟抗體檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”-熒光抗體病毒中和試驗(yàn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有分歧的血清進(jìn)行定性復(fù)核檢測(cè)，通過(guò)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的分析，旨在為篩選更適合我國(guó)實(shí)際需要的豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒提供更多的數(shù)據(jù)支持。

1　材料與方法

1.1PK15傳代細(xì)胞系、豬瘟病毒T株、豬瘟病毒熒光抗體：系由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存并提供。

1.2ELISA試劑盒豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（簡(jiǎn)稱國(guó)產(chǎn)試劑盒）：由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。批號(hào)為20121110。

豬瘟抗體ELISA檢測(cè)試劑盒（簡(jiǎn)稱進(jìn)口試劑盒），購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司，批號(hào)為A651。

1.3臨床豬血清采自四川省境內(nèi)。其中，商品豬場(chǎng)采集豬瘟疫苗免疫豬血清100份；種豬場(chǎng)采集二免或三免種豬血清140份；四川偏遠(yuǎn)地區(qū)采集散養(yǎng)戶的非免疫仔豬血清60份。共計(jì)300份。

1.4ELISA試劑盒檢測(cè)用國(guó)產(chǎn)試劑盒和進(jìn)口試劑盒同時(shí)檢測(cè)待檢豬血清，操作方法均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每份血清重復(fù)2孔。

1.5熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（FVNT）將上述兩種ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果不符合的血清用FVNT進(jìn)行符合驗(yàn)證。具體操作方法按照《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》[1]進(jìn)行。

2　結(jié)果

2.1兩種試劑盒的檢測(cè)結(jié)果及符合率在300份血清中，國(guó)產(chǎn)試劑盒檢測(cè)出豬瘟抗體陽(yáng)性血清199份，陰性血清78份，可疑23份；進(jìn)口試劑盒檢測(cè)出豬瘟抗體陽(yáng)性血清184份，陰性血清106份，可疑10份。兩者的符合率為83.67%（符合率= （176+75）/300×100%=83.67%），見(jiàn)表1。

表1　國(guó)產(chǎn)試劑盒與進(jìn)口試劑盒符合率

2.2兩種試劑盒對(duì)不同來(lái)源豬血清的檢測(cè)結(jié)果在臨床采集的豬血清中，有采自商品豬場(chǎng)和種豬場(chǎng)的免疫血清共計(jì)240份，散養(yǎng)戶采集的非免疫豬血清60份。在240份免疫血清中，國(guó)產(chǎn)試劑盒與進(jìn)口試劑盒的符合率為80.8%（符合率= （170+24）/240×100%=80.8%），兩者對(duì)陽(yáng)性血清檢測(cè)的結(jié)果差異較大。國(guó)產(chǎn)試劑盒檢測(cè)出陽(yáng)性血清193份，占免疫血清總數(shù)的80.4%；進(jìn)口試劑盒檢測(cè)出陽(yáng)性血清156份，占免疫血清總數(shù)的65%。結(jié)果見(jiàn)表2。在60份非免疫血清中，兩種試劑盒的符合率為95%（符合率=（6+51）/60× 100%=95%），均檢測(cè)出6份陽(yáng)性，國(guó)產(chǎn)試劑盒檢測(cè)出51份陰性，3份可疑，陰性率為85%；進(jìn)口試劑盒檢測(cè)出54份陰性，陰性率為90%，見(jiàn)表3。

表2　兩種試劑盒對(duì)免疫血清檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表3　兩種試劑盒對(duì)非免疫血清檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3FVNT驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果差異的血清共計(jì)49份，采用熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（FVNT）對(duì)有異議的血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果是陽(yáng)性22份，陰性19份，可疑8份。國(guó)產(chǎn)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果是陽(yáng)性23份，陰性3份，可疑23份，與FVNT的符合率為63.3%（符合率=（21+2+8）/49×100%= 63.3%）；進(jìn)口試劑盒檢測(cè)出陽(yáng)性8份，陰性31份，可疑10份，與FVNT的符合率為32.7%（符合率（1+13+2）/49×100%=32.7%）。兩種試劑盒與FVNT符合率見(jiàn)表4、表5。

表4　國(guó)產(chǎn)試劑盒與FVNT符合率

表5　進(jìn)口試劑盒與FVNT符合率

3　討論

3.1豬瘟抗體檢測(cè)方法目前，國(guó)際上推薦的豬瘟抗體檢測(cè)方法有過(guò)氧化物酶中和試驗(yàn)（NPLA）、熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（FVNT）和ELISA檢測(cè)方法[1]。其中NPLA和FVNT采用的原理相近，需將血清與一定量的病毒孵育后接種敏感細(xì)胞，檢測(cè)的是中和抗體，二者被認(rèn)為是檢測(cè)豬瘟抗體的“金標(biāo)準(zhǔn)”。這兩種檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件及操作人員要求很高，并且耗時(shí)長(zhǎng)（至少3 d），因此，不適合進(jìn)行大量樣本的檢測(cè)。除了NPLA、FVNT這兩種以外，我國(guó)使用的體外檢測(cè)豬瘟抗體的方法還有正向間接血凝（IHA）、免疫金標(biāo)快速檢測(cè)技術(shù)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）、抗體芯片技術(shù)等[2]。其中IHA依據(jù)肉眼判斷結(jié)果，易受主觀因素影響；免疫金標(biāo)檢測(cè)只能做定性判斷并且在大量檢測(cè)樣本時(shí)不及ELISA方便；瓊擴(kuò)試驗(yàn)雖操作簡(jiǎn)單但敏感性差；抗體芯片技術(shù)的自動(dòng)化檢測(cè)結(jié)果可靠但儀器設(shè)備要求很高，不適合基層；而ELISA方法則以更為簡(jiǎn)便，易操作，檢測(cè)樣本量大，敏感性高，特異性好等優(yōu)勢(shì)更適合田間的大范圍推廣應(yīng)用。

3.2ELISA試劑盒的研發(fā)原理基于不同的研發(fā)原理，不同的試劑盒在特異性和敏感性上可能會(huì)有所差異。目前，較為常用的ELISA試劑盒為進(jìn)口的阻斷ELISA試劑盒。該試劑盒采用阻斷ELI?SA原理，以豬瘟病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行包被，將待檢血清加入后進(jìn)行孵育反應(yīng)，特異性抗體能夠?qū)⑻囟ǖ谋砦贿M(jìn)行結(jié)合封閉，當(dāng)再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體后，所呈現(xiàn)的顏色反應(yīng)與特異性抗體含量成反比。由于在該種方法中使用的是特異性的單克隆抗體，因此該方法檢測(cè)的陽(yáng)性抗體為針對(duì)單一表位的抗體，所以有更好的特異性。本試驗(yàn)中選用的國(guó)產(chǎn)試劑盒是采用間接ELISA原理，同樣以豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白作為包被抗原，將待檢血清加入后進(jìn)行孵育反應(yīng)，然后加入酶標(biāo)二抗進(jìn)行顯色，所呈現(xiàn)的顏色反應(yīng)亦與特異性抗體含量成正比[3]。間接ELISA方法檢測(cè)對(duì)象為針對(duì)包被蛋白所有的陽(yáng)性抗體，因此，該方法有更好的敏感性。

我們采用兩種試劑盒共同對(duì)300份血清樣本進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果兩者的符合率為83.67%。通過(guò)對(duì)血清的免疫背景進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，國(guó)產(chǎn)試劑盒檢測(cè)免疫血清的陽(yáng)性率高出進(jìn)口試劑盒15個(gè)百分點(diǎn)，說(shuō)明國(guó)產(chǎn)試劑盒較進(jìn)口試劑盒有更高的敏感性。在對(duì)非免疫血清的檢測(cè)結(jié)果中，進(jìn)口試劑盒較國(guó)產(chǎn)試劑盒陰性率高出5個(gè)百分點(diǎn)，因此說(shuō)明進(jìn)口試劑盒較國(guó)產(chǎn)試劑盒有更高的特異性。這一結(jié)果正是由于兩種試劑盒的研發(fā)原理不同而造成的。

3.3兩種試劑盒與“金標(biāo)準(zhǔn)”的符合率在檢測(cè)的300份血清中，兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果有差異的血清共計(jì)49份，將49份血清進(jìn)行FVNT定性檢測(cè)。結(jié)果國(guó)產(chǎn)試劑盒與FVNT的符合率高出進(jìn)口試劑盒30個(gè)百分點(diǎn)，因此說(shuō)明，國(guó)產(chǎn)試劑盒較進(jìn)口試劑盒更接近“金標(biāo)準(zhǔn)”的檢測(cè)結(jié)果，所得到的結(jié)果更為準(zhǔn)確。

3.4國(guó)產(chǎn)試劑盒更適合我國(guó)的抗體監(jiān)測(cè)工作在本研究中，國(guó)產(chǎn)試劑盒檢測(cè)免疫血清的陽(yáng)性率為80.4%，而進(jìn)口試劑盒僅為65%。在農(nóng)業(yè)部每年發(fā)布的《國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃》中，要求免疫豬群陽(yáng)性率≥70%才能能判為群體免疫合格。按照這一標(biāo)準(zhǔn)，采用國(guó)產(chǎn)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，則該群體為免疫合格群；若采用進(jìn)口試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，則該群體為不合格群。因此，在進(jìn)行豬瘟抗體監(jiān)測(cè)時(shí)，要慎重選擇檢測(cè)試劑盒，否則會(huì)對(duì)免疫效果的評(píng)價(jià)造成很大影響。本研究所采用的國(guó)產(chǎn)試劑盒的敏感性高，雖然在特異性上稍遜于進(jìn)口試劑盒[4]，但根據(jù)國(guó)產(chǎn)試劑盒的說(shuō)明，檢測(cè)結(jié)果可疑血清可被判定為陰性。如按照這一標(biāo)準(zhǔn)，兩種試劑盒的特異性相當(dāng)。因此我們認(rèn)為，國(guó)產(chǎn)試劑盒具有良好的敏感性與特異性，操作簡(jiǎn)便，質(zhì)量可靠，更適合在我國(guó)的抗體監(jiān)測(cè)工作。

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通訊作者：徐璐，E-mail：421203912@qq.com

作者簡(jiǎn)介：李麗（1985-），女，獸醫(yī)師，碩士，從事動(dòng)物疫病防控工作，E-mail：365087955@qq.com

收稿日期：2014-05-15

中圖分類號(hào)：S858.28

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2015）10- 0080- 03