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    菌毒清口服液治療人工感染雞傳染性鼻炎試驗

    2015-03-04 03:08:30牛建榮張繼瑜周緒正李劍勇魏小娟楊亞軍劉希望中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室甘肅省新獸藥工程重點實驗室甘肅蘭州730050
    中國獸醫(yī)雜志 2015年10期
    關(guān)鍵詞:口服液療效

    牛建榮,張繼瑜,周緒正,李劍勇,李 冰,魏小娟,楊亞軍,劉希望(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室甘肅省新獸藥工程重點實驗室,甘肅蘭州730050)

    菌毒清口服液治療人工感染雞傳染性鼻炎試驗

    牛建榮,張繼瑜,周緒正,李劍勇,李冰,魏小娟,楊亞軍,劉希望
    (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室甘肅省新獸藥工程重點實驗室,甘肅蘭州730050)

    摘要:為了觀察“菌毒清”口服液對人工感染雞傳染性鼻炎的治療效果與現(xiàn)有的治療雞呼吸道疾病的中藥“瘟毒清”口服液療效進(jìn)行比較。試驗分為7組,包括2.0%、1.5%、1.0%和0.5%“菌毒清”飲水治療組,1.0%“瘟毒清”飲水治療組,陽性空白對照組和陰性空白對照組,雞只自由飲用,連用7 d為1療程。經(jīng)1個療程的治療,“菌毒清”治療組的治愈率分別為69.23%、77.78%、81.48%和62.96%,“瘟毒清”組的治愈率為78.57%;“菌毒清”治療組的有效率分別為88.46%、88.80%、94.81%和81.48%,“瘟毒清”治療組的有效率為89.29%;不同劑量“菌毒清”治療組的有效率與“瘟毒清”治療組差異不顯著,但不同藥物治療組與陽性空白對照組差異顯著(P<0.05)。表明“菌毒清”是治療雞傳染性鼻炎的有效藥物之一。

    關(guān)鍵詞:“菌毒清”口服液;雞傳染性鼻炎;療效

    雞傳染性鼻炎(Infectious coryza,IC)是由副雞嗜血桿菌(Haemophilus gallinarum,HPg)所引起雞的急性呼吸系統(tǒng)疾病。本病發(fā)生于各種年齡的雞,老齡雞感染較為嚴(yán)重。主要癥狀為鼻腔與鼻竇發(fā)炎,流鼻涕,臉部腫脹和打噴嚏。

    育成雞感染傳染性鼻炎,生長遲緩,死亡率上升;產(chǎn)蛋雞感染后,常引起產(chǎn)蛋率下降,而在產(chǎn)蛋高峰期或高峰期以后的雞群感染傳染性鼻炎,產(chǎn)蛋量可下降70%。

    課題組根據(jù)養(yǎng)雞業(yè)生產(chǎn)需要,篩選出治療雞呼吸道傳染性疾病的復(fù)方中藥制劑“菌毒清”口服液。該制劑根據(jù)傳統(tǒng)中獸醫(yī)學(xué)理論,以板藍(lán)根、黃連、黃芩等組方,運用現(xiàn)代制藥技術(shù),精制而成。本試驗的目的在于觀察“菌毒清”對人工感染雞傳染性鼻炎的治愈率、有效率。并與陽性對照藥物“瘟毒清”口服液進(jìn)行比較,統(tǒng)計分析各組間的差異性,評價“菌毒清”治療雞傳染性鼻炎的藥效。

    1 材料

    副雞嗜血桿菌(HPg):北京標(biāo)準(zhǔn)株A型,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。用于人工感染細(xì)菌?!熬厩濉笨诜海河糜谥委熑斯じ腥倦u傳染性鼻炎患雞。由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制。規(guī)格為每1 mL含生藥1 g。批號:20130311?!拔炼厩濉笨诜簩φ账幬?,用于治療人工感染雞傳染性鼻炎患雞。由天津市挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司提供[獸藥字(2006)020115030]。濃度為每1 mL含生藥1 g。雞胚100枚,用于測定副雞嗜血桿菌雞胚半數(shù)致死量(ELD50)和雞胚傳代培養(yǎng)。自己孵化的7日齡非免疫雞胚。試驗雞為三黃雞,350只,70日齡未免疫,經(jīng)臨床觀察均為健康。購自蘭州市榆中養(yǎng)雞場。用于測定雞半數(shù)感染量(ID50);人工感染雞傳染性鼻炎患雞模型。

    2 方法

    2.1副雞嗜血桿菌(HPg)的培養(yǎng)

    2.1.1種子液的培育將副雞嗜血桿菌北京標(biāo)準(zhǔn)株A型培養(yǎng)液進(jìn)行5倍稀釋,作為原液,劃線培養(yǎng)于雞肉湯瓊脂平板上,置37℃含5%~10% CO2(體積分?jǐn)?shù),下同)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h~18 h,在斜射光線的顯微鏡下觀察,選擇熒光強(qiáng)的典型菌落接種于雞肉湯中,同樣條件下培養(yǎng)18 h~20 h。用雞肉湯瓊脂平板進(jìn)行雜菌檢驗,無雜菌而生長出典型HPg菌落者即為種子液。

    2.1.2雞胚接種與收獲取繁殖好的HPg種子液,接種7日齡雞胚卵黃囊,0.2 mL/胚。置37℃條件下繼續(xù)孵化,觀察124 h,死亡的雞胚分別收取卵黃、尿囊液及絨毛膜,研磨離心,取上清液。用雞肉湯瓊脂平板進(jìn)行雜菌檢驗,生長出典型HPg菌落且無雜菌的留用[1]。

    2.1.3細(xì)菌計數(shù)細(xì)菌計數(shù)按農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的《獸醫(yī)微生物制品規(guī)程》進(jìn)行,以10-1,10-2,10-3……10-6稀釋,然后取0.1 mL稀釋液均勻地涂抹在雞肉湯瓊脂平板上,每個稀釋度做2板,置于37℃含5%~10% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h~20 h,2板的平均數(shù)即為該稀釋度的細(xì)菌數(shù)。

    2.2雞胚半數(shù)致死量(ELD50)測定取死亡雞胚的卵黃、尿囊液及絨毛膜的離心上清液,按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的梯度稀釋后接種雞胚。采用FT-K數(shù)字智能化孵化機(jī)。所用SPF雞胚為自行孵化,取7日齡雞胚50枚。每個雞胚分別接毒100、10-1、10-2、10-3、10-4梯度的稀釋液0.2 mL,每個稀釋梯度用10枚雞胚37℃,56%相對濕度下孵化,3 h翻蛋1次。棄去48 h內(nèi)死亡雞胚,觀察124 h,詳細(xì)記錄死亡與存活數(shù)。無菌收集72 h~148 h死亡雞胚,3 500 r/min離心,取上清液,-20℃保存待用。按Reed-Menuch氏法計算HPg雞胚半數(shù)致死量(ELD50)。

    2.3HPg的雞半數(shù)感染量ID50試驗雞為70日齡的未免疫的肉用三黃雞50只,初試體重1.69~2.27 kg,每個試驗組15只(分為3組)。將雞保定好,找到氣管,在氣管內(nèi)注射HPg上清液稀釋液1.0 mL。測定其對雞的半數(shù)感染量(ID50)。另5只為健康對照組,不做任何處理。連續(xù)觀察14 d。按Reed-Menuch氏法計算HPg雞半數(shù)感染量(ID50)。

    2.4“菌毒清”治療試驗依據(jù)農(nóng)業(yè)部1992年《實驗臨床試驗技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行“菌毒清”治療試驗。

    2.4.1分組70日齡未免疫的三黃雞300只,經(jīng)臨床檢查均為健康。分為“菌毒清”4組(2.0%、1.5%、1.0%和0.5%)、“瘟毒清”治療組、陽性對照組及陰性(空白)對照組。見表1。

    表1 試驗動物分組與用藥

    2.4.2攻毒除健康對照組外,按照雞半數(shù)感染量(ID50),用制備的HPg感染用稀釋液(10- 1稀釋),每只雞氣管內(nèi)滴注射1.0 mL。

    2.4.3治療在雞出現(xiàn)較典型的臨床癥狀后(48 h)開始用藥,各組按試驗設(shè)計準(zhǔn)確用藥,將“菌毒清”按2.0%、1.5%、1.0%和0.5%的濃度分別加入飲水中,供相應(yīng)組病雞不限量自由飲用;以相同方法將“瘟毒清”按1.0%濃度分別加入飲水中,供藥物對照組病雞自由飲用,亦不限量。連續(xù)用藥7 d 為1療程。陽性對照組致病,但不用任何藥物治療??瞻讓φ战M既不致病,也不用任何藥物。

    2.4.4觀察每天觀察各組雞只臨床癥狀、雞只死亡情況并進(jìn)行詳細(xì)記錄。進(jìn)行病理剖檢。進(jìn)行實驗室病菌確診驗證:進(jìn)行細(xì)菌分離,染色鏡檢菌體,血清學(xué)鑒定。試驗結(jié)束后,統(tǒng)計治療結(jié)果,分析各組間差異,推薦臨床治療劑量,對“菌毒清”藥效進(jìn)行評價。

    3 結(jié)果

    3.1雞胚接種出現(xiàn)典型癥狀雞胚接種出現(xiàn)絨毛膜變渾濁、變厚及形成痘斑。在雞肉湯瓊脂上生長出圓形、灰白色、半透明、凸起的小菌落。見中插彩版圖1、圖2。

    3.2HPg的ELD50測定結(jié)果見表2。

    表2 HPg的ELD50測定結(jié)果

    LgEID50=-1+0.32×(-1)=-1.32 EID50=10-1.32/0.2 mL

    該病菌的毒價為EID50=10-1.32/0.2 mL,可以引起雞胚124 h內(nèi)半數(shù)發(fā)生死亡,據(jù)此確定該病毒對雞胚的感染劑量為每只100、10-1、10-2/0.2 mL。剖檢雞胚可見絨毛尿囊膜(CAM)水腫、增厚,有數(shù)量不等、大小不一、不透明的灰白色痘斑,胚體表面出血等HPg的特征性病變。

    3.3HPg的雞半數(shù)感染量ID50測定結(jié)果結(jié)果見表3。

    表3 各組的潛伏期、發(fā)病率、死亡率

    距離比值=(80.00%-50%)/(80.00%-26.32%)= 30/53.68=0.56

    Lg ID50=-1+0.0.56×(-1)=-1.56 ID50=10-1.56/1.0 mL

    該菌株的毒價為ID50=10-1.56/1.0 mL,可以引起雞半數(shù)感染,據(jù)此確定HPg對雞的感染劑量為每只10-1、10-2/1.0 mL。

    3.4“菌毒清”治療試驗結(jié)果

    3.4.1臨床癥狀48 h開始出現(xiàn)癥狀,鼻孔先流出清液以后轉(zhuǎn)為漿液黏性分泌物,有時打噴嚏,流鼻液,呼吸困難,并有啰音,病雞搖頭,欲將呼吸道內(nèi)的黏液排出,臉腫脹或顯示水腫,結(jié)膜發(fā)炎,眼瞼腫脹。病雞精神沉郁,食欲及飲水減少,部分雞拉稀,面部浮腫,縮頭,呆立,公雞肉髯腫大,個別雞咽喉積有分泌物的凝塊,最后常窒息而死。

    3.4.2病理剖檢主要病變?yōu)楸乔缓捅歉]黏膜呈急性卡他性炎,充血、腫脹,表面覆有大量黏液,竇內(nèi)有滲出物凝塊,后成為干酪樣壞死物。常見卡他性結(jié)膜炎,結(jié)膜充血、腫脹。臉部及肉髯皮下水腫。嚴(yán)重時可見氣管黏膜炎癥,偶有肺炎及氣囊炎。

    3.4.3實驗室病菌確診驗證參照農(nóng)業(yè)部頒布的《雞傳染性鼻炎診斷技術(shù)》(NY/T 538-2002)進(jìn)行確診驗證。

    3.4.3.1細(xì)菌分離取急性發(fā)病雞、癥狀明顯的雞,將滅菌的棉拭插入竇腔內(nèi)部,無菌操作劃直線接種在雞血清雞肉湯瓊脂平板,然后再用葡萄球菌在平板上劃橫線,37℃,10% CO2培養(yǎng)24 h,觀察細(xì)菌生長情況。

    3.4.3.2染色鏡檢菌體取分離菌株涂片,革蘭染色鏡檢菌體形態(tài)??梢姼锾m陰性,兩極濃染,單個、成對或形成鏈狀排列的小桿菌。

    3.4.3.3血清學(xué)鑒定用已知的傳染性鼻炎抗血清檢驗分離的被檢菌。在載玻片上放1滴抗血清和1滴生理鹽水,然后向其中分別加入用被檢菌制備的抗原各1滴,充分混合后,轉(zhuǎn)動玻片3~5 min,如果血清滴處出現(xiàn)凝集而生理鹽水滴處不凝集,即可判定被檢菌為副雞嗜血桿菌[2]。

    3.4.4治療統(tǒng)計分析結(jié)果見表4。

    表4 療效統(tǒng)計分析(治療期7 d)

    從表4可以得出,除G組(健康對照組)外,在290只致病雞中,發(fā)病262只,副雞嗜血桿菌人工感染后發(fā)病率為86.67%~95.00%,平均90.34%(262/290)。經(jīng)1個療程的治療,4個“菌毒清”組的治愈率為62.96%~81.48%,瘟毒清組的治愈率為78.57%;4個“菌毒清”組的有效率為81.48%~94.81%,瘟毒清組的有效率為89.29%。其中以“菌毒清”3組(1.0%菌毒清)的有效率和治愈率最高,比瘟毒清組高5.52個百分點,效果顯著。經(jīng)統(tǒng)計分析,“菌毒清”4個試驗組和“瘟毒清”組與陽性對照組差異顯著(P<0.05);“菌毒清”4個試驗組和“瘟毒清”組相互之間差異不顯著。

    4 結(jié)論

    試驗結(jié)果表明,“菌毒清”口服液治療效果“瘟毒清”治療效果稍好?!熬厩濉笨诜喊凑?.0%比例飲水給藥,效率高,治療費用低,推薦“菌毒清”口服液用量按照1.0%濃度飲水給藥。

    參考文獻(xiàn):

    [1]朱士盛,王新.雞傳染性鼻炎實驗室診斷技術(shù)[J].中國動物檢疫,1995,12(4):12-14.

    [2]趙金紅,杜春梅,孫麗波,等.雞傳染性鼻炎的診斷與防治[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2010,32(S):43-44.

    Effects of Junduqingoral liquid for artificial avian infectious coryza

    NIU Jian-rong,ZHANG Ji-yu,ZHOU Xu-zheng,LI Jian-yong,
    LI Bing,WEI Xiao-juan,YANG Ya-jun,LIU Xi-wang (Key Lab of New Animal Drug Project,Gansu Province,Key Lab of Veterinary Drug Development,
    Ministry of Agriculture,Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciencesof CAAS,Lanzhou 730050,China)

    Abstract:To estimate the efficacy of traditional Chinese medicine preparation Junduqing oral liquid for chicken respiratory disease,the chickens were artificially infected by Haemophilusgallinarum . In our study traditional Chinese medicine Wenduqing was set as the control drug.The chickens were randomly divided into 7 groups,which contained four therapeutical groups of 2.0%,1.5%,1.0% and 0.5% Junduqing in water,and three control groups of 1.0%Wenduqing in water,positive control group and nega?tive control group.The water with drug was drunk freely in every group for seven days as a course of treatment.The results showed that the cure rates of the four therapeutical groups were 69.23%,77.78%,81.48% and 62.96% respectively,and Wenduqing con?trol group was 78.57%.The effective rates of these 4 groups with Junduqing were 88.46%,88.80%,94.81% and 81.48% respective?ly, andWenduqing was 89.29%.There was no significant differences in cure rate and effective rate between 4 Junduqing therapeuti?cal groups and Wenduqing control group.However,there had significant differences between these five groups and the positive con?trol group(P<0.05).The experiment demonstrated that Junduqing was an effective traditional Chinese medicine preparation for avi?an infectious coryza and was better than Wenduqing in same dosage.

    Key words:Junduqing oral liquid preparation;avian infectious coryza;efficacy

    作者簡介:牛建榮(1968-),男,副研究員,碩士,從事獸醫(yī)臨床和新獸藥開發(fā)研究,E-mail:lznjr1968@126.com

    基金項目:農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)專項:防治畜禽衛(wèi)氣分證中獸藥生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用(201303040-09)

    收稿日期:2014-4-24

    中圖分類號:S858.31

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號:0529- 6005(2015)10- 0087- 03

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