足底電擊加強(qiáng)大鼠凝血功能的研究*

程玉文，孫珮雯，朱晨潔，董濤，張國(guó)興（蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院生理學(xué)系，江蘇蘇州215123）

足底電擊加強(qiáng)大鼠凝血功能的研究*

程玉文，孫珮雯，朱晨潔，董濤，張國(guó)興
（蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院生理學(xué)系，江蘇蘇州215123）

摘要：目的研究足底電擊對(duì)大鼠凝血系統(tǒng)的影響及機(jī)制。方法以SD雄性大鼠足底電擊建立模型，分為對(duì)照組、電擊組、假手術(shù)組、去神經(jīng)電擊組和注射抗氧化劑電擊組，每組6只大鼠。尾套法測(cè)量大鼠的收縮壓，凝血分析儀測(cè)定血漿凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）及血漿凝血酶（TT），血小板聚集儀測(cè)定二磷酸腺苷（ADP）介導(dǎo)血小板聚集和膠原介導(dǎo)血小板聚集，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定血漿中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物、谷胱甘肽、皮質(zhì)酮濃度，觀察各項(xiàng)指標(biāo)的變化。結(jié)果足底電擊大鼠7 d后，電擊組和假手術(shù)組收縮壓明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。足底電擊14d后，電擊組和假手術(shù)組血漿中谷胱甘肽活性較對(duì)照組降低（P<0.05），電擊組和假手術(shù)組血漿中脂質(zhì)過(guò)氧化物、皮質(zhì)酮濃度相對(duì)于對(duì)照組升高（P<0.05），與對(duì)照組比較，電擊組和假手術(shù)組PT縮短，TT延長(zhǎng)（P<0.05），電擊組和假手術(shù)組的ADP和膠原介導(dǎo)血小板聚集率高于對(duì)照組（P<0.05），電擊組和假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與電擊組比較，去神經(jīng)電擊組和注射抗氧化劑電擊組收縮壓、血漿中脂質(zhì)過(guò)氧化物、皮質(zhì)酮濃度、ADP和膠原介導(dǎo)血小板聚集率降低（P<0.05）。結(jié)論足底電擊通過(guò)激活腎交感神經(jīng)和增加氧化應(yīng)激使大鼠凝血功能增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：凝血功能；足底電擊；氧化應(yīng)激；腎交感神經(jīng)

人們長(zhǎng)期處于緊張焦慮狀態(tài)易導(dǎo)致心血管疾病，同時(shí)，抑郁焦慮會(huì)加速心血管疾病的形成。在過(guò)去的幾十年里，壓力和抑郁被公認(rèn)是影響健康的重要因素[1]。壓力可能與腦卒中、心肌梗死密切相關(guān)[2]。大量研究表明,長(zhǎng)期持續(xù)的應(yīng)激可以對(duì)組織和器官造成器質(zhì)性損傷[3]。腎交感神經(jīng)和氧化應(yīng)激在應(yīng)激性高血壓的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，高血壓可加重血管內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)血栓形成，與心腦血管疾病發(fā)病密切相關(guān)[4-5]。目前，關(guān)于精神應(yīng)激與凝血系統(tǒng)、心腦血管疾病間的直接聯(lián)系，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。凝血系統(tǒng)的激活與對(duì)生理性止血和病理性血栓形成有重要影響[6-7]。本研究計(jì)劃通過(guò)足底電擊大鼠建立應(yīng)激模型[8]，探索大鼠凝血功能的變化及具體機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物

成年雄性SD大鼠24只，體重200～250 g，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、電擊組、假手術(shù)組、去神經(jīng)電擊組和注射抗氧化劑電擊組，每組6只。選用一種超氧化物歧化酶模擬劑Tempol作為抗氧化劑，每天對(duì)去神經(jīng)電擊組和注射抗氧化劑電擊組的大鼠腹腔注射該藥物100 mg/kg，濃度為10%，注射時(shí)間為電擊實(shí)驗(yàn)前1 h。

1.2儀器和試劑

RBP21B型大鼠血壓心率儀購(gòu)自北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司，半自動(dòng)血凝分析儀購(gòu)自廣州華鑫科技有限公司，血小板聚集儀購(gòu)自上海曼普科技有限公司，ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1模型制備①應(yīng)激模型制備：電擊組大鼠刺激周期為15 d，每天上、下午各給予1次足底電刺激，2h/次，電流強(qiáng)度為2～4mA，電壓輸出為75～150 V；對(duì)照組大鼠每天于同樣時(shí)間置于相同的鼠箱，但不予應(yīng)激刺激。②去神經(jīng)組模型制備：將雄性SD大鼠麻醉（腹腔注射1 ml/100 g的水合氯醛溶液）后，經(jīng)腰部縱行切口，沿腹膜后路徑暴露左側(cè)腎臟、腎動(dòng)脈和腎神經(jīng)，于接近腹主動(dòng)脈處的腎動(dòng)脈和腎靜脈附近仔細(xì)游離出腎交感神經(jīng)，用手術(shù)剪切斷后縫合，右側(cè)同左側(cè)，術(shù)后靜養(yǎng)1周，去腎交感神經(jīng)大鼠模型制備成功。

1.3.2標(biāo)本采集下腔靜脈取血或者斷頭取血5 ml，用3.8%枸櫞酸鈉1∶9抗凝，混勻，置入-80℃保存全血標(biāo)本備用。

1.3.3大鼠收縮壓測(cè)定實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后每3天為1個(gè)周期，尾套法測(cè)定收縮壓。測(cè)量血壓前大鼠預(yù)置于38～40℃溫室10～20 min，尾部動(dòng)脈擴(kuò)張后，將尾部套于傳感器上，待動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境、行為穩(wěn)定后，開(kāi)主機(jī)電源。連續(xù)測(cè)3次，取其均值，每次測(cè)量在下午應(yīng)激后0.5 h進(jìn)行。

1.3.4大鼠凝血功能檢測(cè)靜脈采血1.8 ml，加入含有3.8%枸櫞酸鈉溶液0.2 ml的試管中，充分混勻，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，試管中加入預(yù)溫的SD大鼠凍干血漿和PT試劑各0.1 ml，混勻后放入儀器進(jìn)行測(cè)試。TT、APTT測(cè)量方法同理，但是APTT測(cè)試時(shí)另加入25 mmol/L氯化鈣溶液0.1 ml。

1.3.5血小板聚集率使用血小板聚集儀測(cè)量血小板聚集率，靜脈采血0.9 ml，加入含有3.8%枸櫞酸鈉溶液0.1 ml的試管中，充分混勻，1 500 r/min離心15 min，分離血漿，分別用6×10-6mol/L二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、20 mg/L膠原介導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)步驟參考血小板聚集儀操作手冊(cè)。

1.3.6血漿中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物、皮質(zhì)酮濃度、谷胱甘肽活性測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定皮質(zhì)酮；使用4-羥基壬烯酸-His加合物ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物；使用皮質(zhì)酮活性分析試劑盒測(cè)定皮質(zhì)酮活性；使用谷胱甘肽過(guò)氧化酶ELISA測(cè)定試劑盒測(cè)定谷胱甘肽活性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組均數(shù)作正態(tài)性檢驗(yàn)及重復(fù)測(cè)量方差齊性檢驗(yàn)，單因素方差分析進(jìn)行組間比較（F檢驗(yàn)），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組收縮壓隨電擊天數(shù)的變化

連續(xù)電擊7d后，電擊組和假手術(shù)組大鼠的血壓明顯高于對(duì)照組（P<0.05），這種狀態(tài)在后續(xù)1周的電擊中一直持續(xù)，提示足底電擊所造成的應(yīng)激狀態(tài)可導(dǎo)致高血壓的發(fā)生。去神經(jīng)電擊組和注射抗氧化劑電擊組與電擊組比較，收縮壓明顯降低。假手術(shù)組與電擊組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示腎交感神經(jīng)和氧負(fù)離子在電擊誘導(dǎo)的高血壓中起重要作用。見(jiàn)圖1。

2.2各組血漿中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物、谷胱甘肽活性、皮質(zhì)酮濃度比較

電擊組和假手術(shù)組血漿中谷胱甘肽活性較對(duì)照組均有降低（P=0.010和0.008），提示機(jī)體電擊后抗氧化能力降低，機(jī)體處于超氧化狀態(tài)。電擊組和注射抗氧化劑電擊組血漿中谷胱甘肽活性較去神經(jīng)電擊組無(wú)明顯改變，但可顯著降低血漿中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物濃度（P<0.05），提示去神經(jīng)和注射抗氧化劑無(wú)法提高機(jī)體自身的抗氧化能力，腎交感神經(jīng)激活可誘導(dǎo)機(jī)體氧化水平的失衡。皮質(zhì)酮是常見(jiàn)的應(yīng)激激素，能清晰地反應(yīng)出應(yīng)激水平，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物濃度分析可反映脂質(zhì)過(guò)氧化的水平。電擊組和假手術(shù)組血漿中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物和皮質(zhì)酮濃度相對(duì)對(duì)照組升高，說(shuō)明長(zhǎng)期電擊使機(jī)體產(chǎn)生大量氧自由基，腎上腺分泌大量皮質(zhì)酮。注射抗氧化劑電擊組血漿中皮質(zhì)酮濃度較電擊組有顯著降低（P<0.05），提示機(jī)體腎交感神經(jīng)激活引起的腎上腺分泌大量皮質(zhì)酮釋放可能有氧負(fù)離子的參與。見(jiàn)表1。

2.3各組凝血指標(biāo)比較

電擊組和假手術(shù)組血漿凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）較對(duì)照組延長(zhǎng)（P=0.002和0.011），提示體內(nèi)的抗凝物質(zhì)增多，而血漿凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）則縮短，提示凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶時(shí)間縮短，內(nèi)源性凝血系統(tǒng)激活所需時(shí)間變少，血栓更易形成。去神經(jīng)和抗氧化劑處理可以縮短TT（P=0.046和0.022），但對(duì)PT沒(méi)有影響。見(jiàn)表2。

2.4各組血小板聚集率比較

圖1　各組收縮壓隨電擊天數(shù)的變化

表1　各組血漿中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物、谷胱甘肽活性及皮質(zhì)酮濃度比較（n=6±s）

表1　各組血漿中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物、谷胱甘肽活性及皮質(zhì)酮濃度比較（n=6±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P<0.05；2）與電擊組比較，P<0.05

組別　脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物/（μmol/ml）　谷胱甘肽/ （u/L）　皮質(zhì)酮/ （ng/ml）對(duì)照組　108.20±1.65　141.56±3.24 182.99±5.51電擊組　136.47±3.571）128.52±2.981）227.56±6.671）P值　0.000　0.010　0.000假手術(shù)組　138.49±3.071）127.38±2.931）230.52±4.431）P值　0.000　0.008　0.000去神經(jīng)電擊組　119.55±3.322）120.41±4.071）161.90±2.922）P值　0.002　0.001　0.000注射抗氧化劑電擊組　111.11±3.922）120.44±1.991）162.51±6.742）P值　0.000　0.000　0.000

表2　各組凝血指標(biāo)比較（n=6，s±s）

表2　各組凝血指標(biāo)比較（n=6，s±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P<0.05；2）與電擊組比較，P<0.05

組別　TT　PT　APTT對(duì)照組　47.98±0.55　11.97±0.47 19.85±0.14電擊組　64.65±2.751）　10.4±0.151）19.05±0.87 P值　0.002　0.021　0.673假手術(shù)組　53.52±3.031）　11.22±0.921）20.22±0.98 P值　0.011　0.070　0.728去神經(jīng)電擊組　56.30±2.412）　11.03±0.52 19.72±1.26 P值　0.046　0.327　0.673注射抗氧化劑電擊組　53.25±3.162）　11.25±0.35 18.28±2.11 P值　0.022　0.077　0.752

電擊組和假手術(shù)組的ADP和膠原介導(dǎo)血小板聚集率均高于對(duì)照組（P<0.05），提示電擊能激活血小板的聚集。去神經(jīng)和注射抗氧化劑處理均可以抑制電擊引起的ADP和膠原介導(dǎo)的血小板聚集率升高，電擊組與假手術(shù)組的血小板聚集率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，排除開(kāi)腹手術(shù)的影響，提示電擊引起的凝血功能的改變是由腎交感神經(jīng)及氧負(fù)離子介導(dǎo)。見(jiàn)圖2。

圖2　各組血小板聚集率

3　討論

本實(shí)驗(yàn)前期基礎(chǔ)研究表明，長(zhǎng)期足底電擊導(dǎo)致大鼠血壓升高形成應(yīng)激性高血壓，腎交感神經(jīng)和氧化應(yīng)激在其發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起重要作用。高血壓可加重血管內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)血栓形成，與心腦血管疾病發(fā)病密切相關(guān)，交感神經(jīng)與氧化應(yīng)激在心腦血管疾病中發(fā)揮的作用不容小覷。

凝血是一系列血漿凝血因子相繼酶解激活的過(guò)程，最終結(jié)果是生成凝血酶，形成纖維蛋白凝塊[9]。凝血過(guò)程一般分為內(nèi)源性凝血和外源性凝血。APTT是內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的篩選實(shí)驗(yàn)；PT是外源凝血系統(tǒng)凝血因子缺陷的過(guò)篩實(shí)驗(yàn)；TT是凝血酶原轉(zhuǎn)變成凝血酶的時(shí)間。TT和APTT的延長(zhǎng)提示凝血功能下降[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)激狀態(tài)下TT和APTT都延長(zhǎng)，可能是由于應(yīng)激造成凝血相關(guān)環(huán)節(jié)損傷，且與凝血酶的生成時(shí)間延長(zhǎng)關(guān)系密切，從而造成凝血時(shí)間延長(zhǎng)，但本實(shí)驗(yàn)中該差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而PT的縮短則表明外源性凝血系統(tǒng)易于激活，啟動(dòng)凝血機(jī)制，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

血小板主要來(lái)源于巨核細(xì)胞，在初級(jí)止血中起重要作用，血小板發(fā)生聚集后，產(chǎn)生凝血功能[11]。血小板通過(guò)各種黏附、聚集、釋放反應(yīng)，產(chǎn)生止血功能[12]。血小板聚集增強(qiáng)說(shuō)明凝血功能增強(qiáng)。血小板聚集是動(dòng)脈硬化發(fā)生、發(fā)展和血栓形成的重要環(huán)節(jié)[13-14]。

1985年有學(xué)者提出激素學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為應(yīng)用激素引起血液高凝，導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成，造成微循環(huán)阻塞。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得血漿中皮質(zhì)酮濃度在電擊后增加，說(shuō)明電擊后在應(yīng)激激素皮質(zhì)酮作用下，血液處于高凝狀態(tài)，而切斷腎交感神經(jīng)后，減弱腎皮質(zhì)激素的釋放緩解這種高凝狀態(tài)。谷胱甘肽的減少、脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的增加均提示機(jī)體處于超氧化水平，血管內(nèi)皮損傷為血小板聚集創(chuàng)造有利條件，所以氧自由基增加，致使血液處于高凝狀態(tài)。

綜上所述，足底電擊導(dǎo)致大鼠血壓的升高，激活凝血系統(tǒng)，引起微循環(huán)障礙，導(dǎo)致心腦血管疾病。凝血系統(tǒng)的激活有兩條途徑：①應(yīng)激使機(jī)體產(chǎn)生大量脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，抑制抗氧化劑谷胱甘肽的產(chǎn)生，使機(jī)體處于超氧化狀態(tài)，血管內(nèi)皮受損，血小板活化聚集率增高，血栓易于形成；②應(yīng)激狀態(tài)下交感神經(jīng)釋放皮質(zhì)激素，血液處于高凝狀態(tài)。但是應(yīng)激對(duì)凝血時(shí)間的影響是否具有意義，以及其具體環(huán)節(jié)有待進(jìn)一步研究。應(yīng)激激活凝血系統(tǒng)后，可以通過(guò)增加血栓數(shù)量，誘發(fā)腦卒中和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟??；另外動(dòng)脈粥樣硬化也增加心肌梗死的發(fā)病率，因此可以在神經(jīng)激素水平和抗氧化劑水平上，對(duì)心腦血管方面的疾病進(jìn)行預(yù)防和治療。

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（申海菊編輯）

Foot shock potentiates blood coagulation system of rats*

Yu-wen CHENG, Pei-wen SUN, Chen-jie ZHU, Tao Dong, Guo-xing ZHANG (Department of Physiology and Neurobiology, Medical College of Soochow University, Suzhou, Jiangsu 215123, P.R. China)

Abstract:【Objective】To observe the influence of foot shock on blood coagulation system of rats. 【Methods】A foot shock model was established in male Sprague Dawley (SD) rats. They were divided into control group, foot shock group, sham group, renal sympathetic nerve denervation plus foot shock group and tempol plus foot shock group with 6 in each group. Tail-cuff method was applied to measure the systolic blood pressure in the rats. Semi-automatic blood coagulation analyzer was applied to measure TT, PT and APTT. Platelet aggregation instrument was used to measure ADP and collagen induced platelet aggregation. Concentrations of plasma thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), corticosterone and glutathione peroxidase activity (GSH-Px) were measured by ELISA kits.【Results】The systolic blood pressure of the shock group and the sham group was significantly higher than that of the control group 7 days after foot shock (P< 0.05). The plasma GSH-Px activity was decreased in the shock group and the sham group compared to that in the control group 14 days after foot shock (P< 0.05). The plasma concentrations of TBARS and corticosterone were increased in the foot shock group and the sham group compared with that in the control group (P< 0.05). PT of the foot shock group and the sham group was shortened compared with that in the control group, but TT was extended (P< 0.05). Platelet aggregation rates induced ADP and collagen in the foot shock group and the sham group were significantly higher than those in the control group (P< 0.05), however, there were no significant differences in the rates between the shock group and the sham group. Both renal sympatheticbook=19,ebook=25denervation and tempol treatments reduced systolic blood pressure, plasma TBARS and corticosterone level, and ADP and collagen induced rates of platelet aggregation compared with the shock group (P< 0.05).【Conclusion】Foot shock of rats enhances blood coagulation system through renal sympathetic nerve system activation and increase of oxidative stress.

Key words:coagulation function; foot shock; oxidative stress, renal sympathetic nerve system

[通信作者]張國(guó)興，E-mail：zhangguoxing@suda.edu.cn

*基金項(xiàng)目：國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（No：2013suda038）

收稿日期：2014-12-30

文章編號(hào)：1005-8982（2015）23-0018-05

中圖分類號(hào)：R363

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A