鈣化性納米微粒致腎結石大鼠尿液中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白、骨橋蛋白及單核細胞趨化蛋白-1的變化及其意義*

王杰，粟宏偉，劉鑫，龐宇，朱智，王春娟（瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院泌尿外科，四川瀘州646000）

鈣化性納米微粒致腎結石大鼠尿液中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白、骨橋蛋白及單核細胞趨化蛋白-1的變化及其意義*

王杰，粟宏偉，劉鑫，龐宇，朱智，王春娟
（瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院泌尿外科，四川瀘州646000）

摘要：目的在建立鈣化性納米微粒（CNPs）致大鼠腎結石模型的過程中，檢測大鼠不同時間尿液中的中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）、骨橋蛋白（OPN）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的含量，初步分析CNPs致腎結石的形成機制。方法利用腎結石患者術中所得結石培養(yǎng)出CNPs，制成CNPs混懸液。20只SD雄性大鼠隨機分為CNPs誘石組（A組）和空白對照組（B組）。通過鼠尾靜脈注射CNPs感染大鼠，分別于注射后4 h、12 h、24 h、1周、2周及8周用代謝籠收集大鼠尿液，酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）檢測大鼠各時間尿液中NGAL、OPN、MCP-1的含量。于注射CNPs后1、2和8周分批次處死大鼠，腎臟組織HE染色后于光鏡下觀察其結晶的形成及病理改變，對照分析結晶的形成與大鼠尿液中NGAL、OPN、MCP-1含量變化的關系。結果在注射CNPs后4 h，與B組比較，A組的NGAL水平顯著增高（P<0.05），2周時A組的OPN、MCP-1水平開始大幅度升高（P<0.05），8周時A組的NGAL、OPN、MCP-1的含量均明顯升高（P<0.05）。1周時，A組腎臟組織可見少量腎小管上皮細胞顆粒樣變性，腎小管內未見鈣鹽晶體沉積；2周時，A組腎小管內可見少量鈣鹽晶體沉積，伴有少數(shù)腎小管上皮細胞空泡樣變性和顆粒樣變性；2周后腎小管內鈣鹽晶體的沉積量與NGAL、OPN、MCP-1的含量呈正相關；8周時，A組腎小管內可見大量鈣鹽晶體沉積，伴有廣泛腎小管上皮細胞空泡樣變性，腎小管上皮細胞的病理改變程度與NGAL的含量呈正相關；B組腎臟組織未見鈣鹽沉積和病理改變。結論大鼠感染CNPs 4 h后即腎小管上皮細胞開始受到損傷，并且損傷程度與NGAL水平呈正相關。2周后腎小管內開始出現(xiàn)鈣鹽晶體的黏附和聚集，單核-巨噬細胞和OPN參與其黏附和聚集過程，并且鈣鹽晶體的沉積量隨損傷程度加重也相應增加。

關鍵詞：腎結石；鈣化性納米微粒；中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白；骨橋蛋白；單核細胞趨化蛋白-1

近年來，中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）作為一種早期腎損傷的敏感標志物，在腎損傷相關疾病中有重要的研究價值。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoat tractant protein-1，MCP-1）的表達與腎小管上皮細胞和鈣鹽晶體有密切的關系，從而成為腎結石形成機制相關研究領域的熱點。本研究在建立鈣化性納米微粒（calcifying nanoparticles，CNPs）致大鼠腎結石模型的過程中，通過監(jiān)測腎結石形成過程中的NGAL、OPN、MCP-1水平變化，對CNPs致腎結石形成機制進行初步分析。

1　材料與方法

1.1CNPs致大鼠腎結石模型的建立

1.1.1CNPs混懸液的制備術中無菌收集經皮腎鏡取石術患者的結石標本，去礦物質、中和、洗滌、研磨、濾器過濾、離心取管底液，10%（體積分數(shù)）熱滅活γ-FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%二氧化碳CO2和95%氧O2條件下培養(yǎng)6～8周，換液30 d/次。倒置相差顯微鏡下形態(tài)學鑒定和Von Kossa染色鑒定，篩選出無污染的標本并制成CNPs混懸液。

1.1.2動物實驗分組20只3月齡雄性SD大鼠隨機分為兩組，每組10只：CNPs誘石組（A組）、空白對照組（B組）。兩組大鼠先適應性飼養(yǎng)1周。通過鼠尾靜脈注射CNPs感染大鼠。

1.2實驗標本的采集

分別于注射CNPs后4 h、12 h、24 h、1周、2周及8周代謝籠收集大鼠尿液，將收集的尿液3 000 r/min離心后及時密封置于-80℃的冰箱保存。于注射CNPs后1、2和8周分批次處死大鼠，切取腎臟，縱向剖開，10%（體積分數(shù)）中性甲醛溶液固定，空氣注射處死大鼠。

1.3觀察指標

對腎臟組織進行石蠟包埋、切片，HE染色后于普通光鏡下觀察結晶的形成及病理改變。利用酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）測定大鼠不同時間尿液中NGAL、OPN、MCP-1的含量，對照分析結晶的形成與大鼠尿液中NGAL、OPN、MCP-1含量變化的關系。

1.4酶聯(lián)免疫分析法

①用純化的大鼠NGAL抗體包被96T微孔板，制成固相抗體；②在酶標包被板上設置標準品孔10個（復孔），加入純化標準NGAL，按照50%的濃度梯度進行稀釋；③分別設空白孔（空白孔不加樣品及酶標試劑）、待測樣品孔，在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl，加樣時將樣品加于酶標板孔底部，盡量不要觸及孔壁，輕輕晃動均勻；④用封板膜封板后置于37℃溫育30 min；⑤小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干；⑥每孔加入HRP酶標試劑50μl，空白孔除外；⑦用封板膜封板后置于37℃溫育30 min，然后用洗滌液再次按上述方法重復洗滌5次；⑧每孔加入TMB顯色劑50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min；⑨每孔加終止液50μl終止反應，此時藍色立即轉變成黃色；⑩以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值），測定在加終止液后15 min內進行；以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應濃度，再乘以稀釋倍數(shù)換算出樣品實際濃度。以同樣的方法測定不同時間段大鼠尿液中OPN、MCP-1的含量。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，不同時間段的計量資料數(shù)據(jù)的組間分析用重復測量的方差分析，相同時間段的組間比較用One-way ANOVA方差分析，兩組比較用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1大鼠不同時間段尿液的NGAL水平

與注射CNPs 4 h后大鼠尿液中NGAL水平相比，A組中NGAL水平變化隨時間的增加呈上升趨勢（P<0.05）。在One-way ANOVA方差分析結果中，與B組比較，A組注射CNPs后4 h的NGAL水平即開始顯著增高（P<0.05），A組在其他時間段內的NGAL水平也有不同程度的提高（P<0.05）。見表1。

2.2大鼠不同時間段尿液的OPN水平

與注射CNPs后4 h大鼠尿液中OPN水平比較，2周前A組大鼠尿液中OPN水平呈緩慢升高狀態(tài)，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），2周后A組大鼠尿液中OPN水平開始大幅度升高，8周時OPN水平升至最高（P<0.05）。在One-way ANOVA方差分析結果中，與B組比較，A組在注射CNPs后2和8周內OPN水平顯著升高（P<0.05）。見表2。

表1　大鼠不同時間段尿液中NGAL水平比較（n=10，±s，ng/L）

表1　大鼠不同時間段尿液中NGAL水平比較（n=10，±s，ng/L）

注：與注射CNPs后4 h比較，P<0.05

組別　4 h　12 h　24 h　1周　2周　8周A 1 913.46±223.23　2 934.91±438.62　2 444.33±593.56　3 471.10±294.55　3 786.23±161.13　3 978.85±810.81　B 1 583.54±57.49　1 676.12±170.22　1 463.59±236.01　1 511.06±221.93　1 473.50±119.25　1 642.58±109.75 P值　0.135　0.038　0.043　0.031　0.029　0.020

表2　大鼠不同時間段尿液中OPN水平比較（n=10±s，μg/L）

表2　大鼠不同時間段尿液中OPN水平比較（n=10±s，μg/L）

注：與注射CNPs后4 h比較，P<0.05

組別　4 h　12 h　24 h　1周　2周　8周A 18.99±2.22　19.40±6.67　21.86±4.98　22.90±3.53　28.00±2.69　33.35±10.93　B 15.59±2.30　16.79±3.14　14.44±3.69　17.18±4.67　16.40±1.54　18.56±2.93 P值　0.253　0.294　0.131　0.065　0.030　0.027

表3　大鼠不同時間段尿液中MCP-1水平比較（n=10±s，μg/L）

表3　大鼠不同時間段尿液中MCP-1水平比較（n=10±s，μg/L）

注：與注射CNPs后4 h比較，P<0.05

組別　4 h　12 h　24 h　1周　2周　8周A 457.70±3.50　458.24±53.33　552.94±64.00　555.64±138.26　573.78±50.22　734.07±201.47　B 437.07±6.82　474.68±25.23　515.39±90.27　535.44±84.53　525.92±29.95　534.81±51.14 P值　0.199　0.298　0.125　0.193　0.022　0.007

2.3大鼠不同時間段尿液的MCP-1水平

與注射CNPs后4 h大鼠尿液中MCP-1水平比較，2周后A組的MCP-1水平開始大幅度升高，8周時MCP-1水平升至最高（P <0.05）。在One-wayANOVA方差分析結果中，與B組比較，在注射CNPs 后2和8周內A組的MCP-1水平顯著升高（P < 0.05）。見表3。

2.4不同時間段大鼠腎臟的鏡檢結果及其與NGAL、OPN、MCP-1含量的關系

1周時，A組腎臟組織HE染色后未見晶體沉積，可見少量腎小管上皮細胞顆粒樣變性（見圖1）。2周時，A組腎臟組織HE染色后可見腎小管內少量晶體沉積，伴有少數(shù)腎小管上皮細胞空泡樣變性和顆粒樣變性（見圖2）。8周時，A組腎臟組織HE染色后可見腎小管內大量晶體沉積，伴有廣泛腎小管上皮細胞空泡樣變性（見圖3）。B組腎臟組織未見鈣鹽沉積和病理改變。隨腎小管上皮細胞損傷的加重，A組大鼠尿液中NGAL水平也不斷升高，可見腎小管上皮細胞的損傷程度與NGAL水平呈正相關。腎小管內鈣鹽晶體的沉積量隨時間的延長而增多（見表4），2周后腎小管內鈣鹽晶體的沉積量與NGAL、OPN、MCP-1水平呈正相關。

圖1　注射CNPs 1周后A組大鼠腎臟組織切片（HE染色×200）

圖2　注射CNPs 2周后A組大鼠腎臟組織切片（HE染色×400）

圖3　注射CNPs 8周后A組大鼠腎臟組織切片（HE染色×200）

表4　A組大鼠不同時間段腎小管內鈣鹽結晶沉積量（n=10）

3　討論

CNPs是一類能夠自我復制的納米級蛋白復合體，具有自我礦化的特性，與許多病理鈣化性疾病都有密切聯(lián)系。有實驗研究已成功從腎結石患者的血液、尿液、結石中分離和培養(yǎng)出CNPs[1]。GARCIA 等[2]將培養(yǎng)出的CNPs直接經皮向腎內注射，成功建立CNPs致腎結石大鼠的動物模型。CNPs可能作為腎結石形成過程的礦化中心這一假說開始受到研究人員的廣泛關注，也為闡明腎結石的形成機制提供新的探索思路。

有文獻報道，受損的腎小管上皮細胞能分泌和產生多種先天性和獲得性免疫炎癥反應相關生物物質，其中包括NGAL[3-4]。NGAL是一種相對分子量為25 kD的蛋白，屬于Lipocalin的家族成員之一。其最開始是在活化的中性粒細胞中被發(fā)現(xiàn)，后來在包括腎小管上皮細胞在內的其他類型細胞中也發(fā)現(xiàn)有NGAL的表達[5]。NGAL作為腎損傷的早期敏感標志物之一，現(xiàn)已成為腎臟損傷相關疾病的研究焦點。通常在發(fā)生腎損傷幾天后，腎臟功能喪失近一半時，血肌酐水平才會明顯升高[6-7]。而相關文獻表明，在出現(xiàn)急性腎損傷早期，血肌酐升還未升高時，即可測得患者血清NGAL水平明顯升高[8]。有學者在人類和嚙齒類動物的體內實驗中發(fā)現(xiàn)，在出現(xiàn)腎小管損傷時體內NGAL表達量增加1 000倍，早期即可在血清和尿液中檢測到[9]。于澄釩等[10]研究發(fā)現(xiàn)，CNPs能損傷腎小管上皮細胞，CNPs作用HK-2細胞6 h后脂質過氧化產物丙二醛含量即開始增加，12 h后細胞出現(xiàn)空泡變性等病理性改變。本實驗注射CNPs后4 h，A組（CNPs誘石組）大鼠尿液中的NGAL水平相比B組（空白對照組）即開始升高，且隨作用時間延長而不斷升高。2周后A組大鼠腎臟病理檢查結果顯示，少數(shù)腎小管內可見鈣鹽晶體沉積，腎小管上皮細胞可見少量空泡樣變性和顆粒樣變性。在8周時NGAL水平達到最高，A組大鼠腎臟病理檢查結果顯示，腎小管上皮細胞可見廣泛空泡樣變性，腎小管內可見大量鈣鹽晶體沉積；B組未見鈣鹽晶體沉積和病理改變?？梢娔I小管上皮細胞的病理改變程度與NGAL水平呈正相關，2周后腎小管內鈣鹽晶體沉積量隨NGAL水平的升高而增加。這些大鼠體內實驗結果再次證實CNPs對腎小管上皮細胞的損傷作用，并且損傷過程伴有NGAL表達水平的升高。

OPN是一種分子量為32 kD的磷酸化糖蛋白，最早在骨組織中被發(fā)現(xiàn)，后來在動脈血管平滑肌細胞、膽囊、腎臟等其他組織和器官的鈣化部位也發(fā)現(xiàn)有OPN的表達。有研究發(fā)現(xiàn)，在腎結石大鼠的腎臟內OPN表達水平明顯升高[11]。LIESKE等[12]通過猴腎小管上皮細胞和草酸鈣晶體共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)OPN的基因表達明顯增強。OPN與腎結石形成機制存在的密切關系使其成為廣大學者的研究焦點。于澄釩等[10]發(fā)現(xiàn)當CNPs損傷腎小管上皮細胞后，細胞的晶體黏附能力明顯增強。當OPN作為一種溶解狀態(tài)的大分子物質存在于尿液中時，能夠抑制草酸鈣的成核，減弱其黏附力[13-14]。本實驗在注射CNPs后的2周內，A組大鼠尿液的OPN水平升高不明顯，腎小管內未見鈣鹽晶體的沉積。2周后，A組大鼠尿液的OPN水平開始出現(xiàn)大幅度升高，腎小管上皮細胞周圍也開始出現(xiàn)鈣鹽晶體的黏附和聚集，隨時間延長，腎小管內晶體沉積量也相應增加。由此提出猜想，鈣鹽晶體對腎小管上皮細胞的黏附作用刺激其表達OPN，生成的OPN通過與受損的腎小管上皮細胞競爭及與鈣鹽晶體的結合，從而削弱其對腎小管上皮細胞的黏附力，抑制鈣鹽晶體的成核。然而KONYA 等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)，表面固化的OPN能夠增強草酸鈣的黏附性，促進結石的形成。由此提出假設，OPN與鈣鹽晶體結合以后形成的復合晶體可能對腎小管形成新的堵塞，再加上腎小管上皮細胞的進行性損傷，新形成的復合晶體無法從腎小管內排出，于是在管內堆砌、聚集，促進結石的形成。同時，增多的鈣鹽晶體刺激腎小管上皮細胞表達更多的OPN?？梢姴煌鞍讟嬓偷腛PN對腎結石的形成過程可能起不同的作用。

MCP-1是屬于CC趨化因子亞科的成員之一，其主要作用是發(fā)生局部炎癥反應時趨化單核細胞和氧自由基進入炎癥組織[16]。在正常的腎小管上皮細胞、腎小球內皮細胞內都有微量的表達。當上述細胞受損時，MCP-1的表達水平升高[17-18]。增多的MCP-1可以趨化單核-巨噬細胞進入腎臟炎癥組織，通過釋放更多的炎癥因子來進一步損傷腎小管上皮細胞。在腎結石動物模型的研究中也有發(fā)現(xiàn)，鈣鹽晶體周圍有單核-巨噬細胞的包繞[19]。UMEKAWA[20]等在研究中發(fā)現(xiàn)，將草酸鈣和磷酸鈣晶體暴露于腎小管上皮細胞的培養(yǎng)環(huán)境中時，能夠刺激腎小管上皮細胞增加MCP-1的表達量，且自由基參與此增量調節(jié)過程。HABIBZADEGAH-TARI等[21]也通過實驗證實，草酸鈣晶體能夠促進腎小管上皮細胞合成和分泌MCP-1，其產生過程由活性氧自由基介導調節(jié)，并且使用抗氧化劑能抑制鈣鹽沉積。本實驗注射CNPs 2周內A組大鼠尿液的MCP-1水平并無明顯升高；2周后鈣鹽晶體開始聚集、黏附腎小管上皮細胞，A組大鼠尿液的MCP-1水平出現(xiàn)大幅度升高；8周后腎小管內出現(xiàn)大量鈣鹽晶體沉積，A組大鼠尿液的MCP-1水平升至最高。大鼠體內實驗證實鈣鹽晶體能夠刺激和促進腎小管上皮細胞表達產生MCP-1，且不斷增多的鈣鹽晶體能刺激腎小管上皮細胞表達更多的MCP-1。HABIBZADEGAH-TARI[21]在其研究結果中還提到使用抗氧化劑能夠有效抑制鈣鹽的沉積，這可能為尋找有效治療和預防腎結石的方法提供新的探索方向。

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（申海菊編輯）

Changes in urine neutrophil gelatinase-associated lipocalin, osteopontin and monocyte chemoattractant protein-1 in rats with renal calculi induced by calcified
nanoparticles and their significance*

Jie WANG, Hong-wei SU, Xing LIU, Yu PANG, Zhi ZHU, Chun-juan WANG
(Department of Urology, the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou, Sichuan 646000, P.R. China)

Abstract:【Objective】To detect the content of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), osteopontin (OPN) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in rat urine in different periods during the process of establishment of renal calculus rat model induced by calcified nanoparticles (CNPs) so as to analyzebook=2,ebook=8the mechanism of kidney stone formation induced by CNPs.【Methods】Calcified nanoparticles were extracted and cultivated from clinically diagnosed patients with nephrolithiasis. Twenty adult male SD rats were randomized into 2 groups (10 in each group): group A was given an intravenous injection of calcified nanoparticles while group B was used as normal control. Urine of rats was collected by using metabolic cages in different periods after injection of CNPs. The content of NGAL, OPN and MCP-1 in rat urine was detected using ELISA. Rats were sacrificed in different periods. The kidneys were examined for pathology.【Results】In the group A, NGAL began to increase 4 hours after injection of CNPs (P < 0.05); OPN and MCP-1 began to largely increase 2 weeks after injection of CNPs (P< 0.05); NGAL, OPN and MCP-1 rose more significantly 8 weeks after injection of CNPs (P< 0.05) compared to those in the group B. At the 1st week, histopathological studies of the renal tissue of the group A showed granular degeneration of a small amount of renal tubular epithelial cells without renal tubular crystallization. At the 2nd week, histopathological studies revealed small quantities of calcium crystals in the renal tubules accompanied with vacuolar degeneration and granular degeneration of a few renal tubular epithelial cells. After 2 weeks, the deposition of calcium crystals in the renal tubules was positively related to the levels of NGAL, OPN and MCP-1. At the 8th week, histopathological changes included a large number of calcium crystals in the renal tubules and extensive vacuolar degeneration of renal tubular epithelial cells which were positively correlated to the content of NGAL. No calcium crystal deposition or pathological changes could be seen in the renal tissue of group B.【Conclusions】Calcified nanoparticles begin to injure renal tubular epithelial cells 4 hours after injection of CNPs, and NGAL level is positively correlated with the degree of injury. The adhesion and aggregation of calcium crystals begin to appear in the renal tubules 2 weeks after injection of CNPs, and the crystals increase with the increased severity of renal tubular injury. Mononuclear macrophage and OPN are involved in the adhesion and aggregation process.

Key words:renal calculus; calcified nanoparticle; neutrophil gelatinase-associated lipocalin; osteopontin; monocyte chemoattractant protein-1

［通信作者］粟宏偉；E-mail：ximi47325@163.com

*基金項目：四川省科技廳資助項目（No：14JC0105）；四川省衛(wèi)生廳資助項目（No：100288）

收稿日期：2015-04-14

文章編號：1005-8982（2015）23-0001-06

中圖分類號：R692.4

文獻標識碼：A