高壓氧預防大鼠早期激素性股骨頭壞死實驗研究*

趙振廣，潘樹義，李 航

（1.中國人民解放軍醫(yī)學院，北京 100853；2.中國人民解放軍海軍總醫(yī)院高壓氧醫(yī)學中心，北京 100048）

高壓氧預防大鼠早期激素性股骨頭壞死實驗研究*

趙振廣1，2，潘樹義1，2，李 航2

（1.中國人民解放軍醫(yī)學院，北京 100853；2.中國人民解放軍海軍總醫(yī)院高壓氧醫(yī)學中心，北京 100048）

目的觀察高壓氧對動物激素性股骨頭壞死的預防作用。方法 將35只雄性Wistar大鼠隨機分為空白組5只，造模組15只，預防組15只。造模組給予地塞米松磷酸鈉注射液腹腔注射10 mL/kg，2次/周，制備激素性股骨頭壞死模型；對照組在造模處理基礎上同時給予高壓氧，壓力為1.8 ATA（絕對大氣壓），每日1次，每次1 h；空白組予以等量生理鹽水注射。實驗第8周，對所有大鼠行雙髖正位X線攝片檢查，隨后處死動物并取大鼠雙側(cè)股骨頭，分別行大體和光鏡觀察。結(jié)果 3組大鼠股骨頭雙髖正位X線攝片及股骨頭標本大體外觀均未發(fā)現(xiàn)異常，在病理切片上可發(fā)現(xiàn)顯著差異。切片HE染色后光鏡觀察顯示空白組無骨壞死灶，造模組出現(xiàn)明顯的骨壞死灶；與造模組比較，預防組骨細胞受損程度較輕。結(jié)論 高壓氧對激素性股骨頭壞死的早期骨細胞壞死有一定的防護作用。

高壓氧；大鼠；股骨頭壞死；激素

隨著糖皮質(zhì)激素在臨床的廣泛應用，激素性股骨頭缺血性壞死（steroid induced avasular necrosis of femoral head，SANFH）的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。SANFH患者以中青年男性為主，若未得到及時正規(guī)治療，絕大多數(shù)患者將于確診后3年內(nèi)出現(xiàn)嚴重功能障礙甚至股骨頭塌陷，全髖關節(jié)置換手術是晚期SANFH的唯一出路。因此，早期即對SANFH患者采取綜合治療措施，從而有效阻止和限制股骨頭壞死的進一步發(fā)展，具有重大的臨床意義[1]。已有研究表明，高壓氧可增加血管成纖維細胞、成骨細胞、軟骨母細胞活性，促進骨新陳代謝，加速骨組織修復。因此從理論上講，高壓氧療法（hyperbaric oxygen therapy，HBOT）是激素性股骨頭壞死一種有效的治療方法。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，66.7%的SANFH患者在應用HBOT后，有效阻止了病情的發(fā)展[2]，國外學者報道其有效率甚至達81%[3-4]。筆者在上述系列研究的基礎上，重點探索了早期高壓氧介入對SANFH的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器

健康雄性4月齡Wistar大鼠35只，體重為（0.21±0.01）kg，由軍事醫(yī)學科學院提供，動物合格證編號為SCXK-(軍)2012-004；所有大鼠分為7籠，飼養(yǎng)于海軍總醫(yī)院實驗動物中心，自由飲水進食，飼養(yǎng)條件一致，顆粒飼料由海軍總醫(yī)院實驗動物中心提供。地塞米松磷酸鈉注射液（成都天臺山制藥有限公司，國藥準字H20052125，規(guī)格為每支2 mg）；水合氯醛溶液（青島宇龍海藻有限公司，國藥準字H37022673）；多聚甲醛及10%EDTA脫鈣液（自配）。AXIOMAristos MX型西門子X線攝影成像系統(tǒng)（西門子公司）；RM2235型徠卡石蠟切片機、德國LEICA DM500型三目生物顯微鏡及圖像信號采集與分析系統(tǒng)（德國Leica公司）。

1.2 方法

動物模型制作及分組：動物適應性喂養(yǎng)1周后，精確稱重并編號，依據(jù)隨機數(shù)字表法完全隨機分為3組，即空白組5只，造模組15只，預防組15只。經(jīng) t檢驗，3組動物在體重方面差異無統(tǒng)計學意義。動物模型的制作采用地塞米松造模法[5]：造模組給予地塞米松磷酸鈉注射液10 mL/kg腹腔注射，2次/周，持續(xù)8周，制備激素性股骨頭壞死模型。預防組則在上述造模處理基礎上同時給予高壓氧，高壓氧開始時間為第1次地塞米松磷酸鈉注射液腹腔注射的次日，治療壓力為1.8絕對大氣壓(ATA)，每日1次，每次1 h，持續(xù)8周；空白組予以等量生理鹽水注射。

X線攝片檢查：于距首次注射8周末，全部動物水合氯醛麻醉，拍雙髖正位X線片。

大體觀察：主要觀察動物體重變化、步態(tài)、毛色以及動物股骨頭大體形態(tài)。

病理組織學檢查：采用放血處死法，取雙側(cè)股骨頭，將所取標本置多聚甲醛溶液中固定3 d，然后置10%EDTA緩沖液中脫鈣，每周更換脫鈣液1次，持續(xù)2個月。脫鈣完全后取材，脫水，制作蠟塊，切片行HE染色。光學顯微鏡下觀察骨小梁、骨髓組織、成骨細胞及骨細胞的變化。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 X線攝片檢查

3組動物行髖關節(jié)正位X線檢查均無異常發(fā)現(xiàn)。根據(jù)國際骨循環(huán)研究會(ARCO)分期，提示為正?；蛘?期、Ⅰ期改變。

圖1 髖關節(jié)X線檢查結(jié)果

2.2 大體觀察

3組動物均無明顯步態(tài)變化，造模組及預防組可見明顯消瘦，毛發(fā)雜亂，缺少光澤；股骨頭外觀均晶瑩光滑，肉眼觀察無差異。體重差異見表1。

表1 3組大鼠喂養(yǎng)8周后體重比較

2.3 病理組織學觀察

選取股骨頭軟骨下區(qū)域觀察，可見空白組骨小梁完整，排列規(guī)則，致密飽滿，骨髓組織含量豐富，骨細胞清晰可見，核較大，大多位于中央，空骨陷窩罕見；造模組標本均出現(xiàn)骨小梁稀疏、變細、甚至斷裂或被疏松結(jié)締組織包繞分解成云片狀，結(jié)構(gòu)紊亂，骨髓組織含量稀少，成骨細胞稀少，骨細胞核固縮、邊聚或消失形成空骨陷窩；預防組標本亦出現(xiàn)股骨頭壞死征象，骨小梁亦有稀疏，變細，與造模組比較，骨髓組織含量更豐富，成骨細胞及正常形態(tài)骨細胞數(shù)目明顯增多，空骨陷窩少見。見圖2。進一步在高倍鏡下任意取50個視野，計數(shù)骨細胞數(shù)量和空骨陷窩，并計算空骨陷窩率以反映股骨頭壞死程度，見表2。

表2 3組大鼠股骨頭切片正常形態(tài)骨細胞數(shù)量、空骨陷窩率比較

3 討論

在實驗及臨床研究中，預防性應用抗凝、調(diào)脂、抗骨質(zhì)疏松藥、活血化瘀類中藥已被證實可有效預防SANFH的發(fā)生。李衛(wèi)哲等[6]的研究證實，大劑量應用激素同時應用蚓激酶對預防激素所致股骨頭壞死有一定作用；Norman等[7]使用依諾肝素對大鼠骨壞死模型進行治療，證實低分子肝素可阻止骨壞死發(fā)生；Pritchett[8]報道了284例患者接受大量激素治療的同時，堅持預防性服用洛伐他汀直到激素治療結(jié)束，最終僅3例患者(占1%)發(fā)生股骨頭壞死，遠小于3% ～20%的激素所致股骨頭壞死的發(fā)生率；Lai等[9]通過應用阿侖膦酸鹽進行預防，與對照組進行臨床比較，表明阿侖膦酸鹽能有效阻止 SteinbergⅡ或Ⅲ期的非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的早期塌陷；史風雷等[10]的研究表明，復方丹參注射液對SANFH有一定預防作用。

2005年，我院率先將高壓氧用于嚴重急性呼吸綜合征(SARS)患者SANFH的臨床研究[11]，通過分析51例臨床資料發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高壓氧治療100次后進行核磁共振(MRI)復查，26例呈現(xiàn)不同程度的改善，且對早期SANFH改善尤為明顯。另一現(xiàn)臨床研究則提示，對20例中晚期SANFH患者進行高壓氧治療后，患者MRI影像未見進行性骨質(zhì)缺失，病情未繼續(xù)加重[12-13]，認為高壓氧治療對SANFH患者明確有效，且治療中干預起始時間可能與療效相關。為此，本研究擬將HBOT提前，將HBOT作為一種預防措施同時與激素使用，選定8周作為時間節(jié)點來判定預防效果。由病理切片可明顯看到，8周后造模組大鼠股骨頭組織顯示骨壞死改變，而預防組正常形態(tài)骨細胞數(shù)量更多，空骨陷窩率更低，其骨細胞壞死程度明顯輕于造模組。HBOT對全身各組織的缺血性病變有其獨特的療效，吸入高分壓氧可使體內(nèi)動脈血氧分壓得到明顯提高，血氧彌散半徑明顯增大，從而使氧分子更易滲透到低氧或缺氧的病變組織細胞，促進新陳代謝[14]，活躍破骨細胞及成骨細胞，使早期骨壞死或處于臨界狀態(tài)的骨質(zhì)逐漸被吸收，新骨形成加快[15]，最終修復股骨頭。

綜上所述，高壓氧對于SANFH的早期骨細胞壞死有一定的防護作用，推測高壓氧加快股骨頭的修復可能是其發(fā)揮預防作用的機制之一。本研究中高壓氧選用的方案較保守，具體為壓力1.8 ATA，每日1次，每次1 h?；蛟S存在一種更優(yōu)的高壓氧方案，或?qū)⒏邏貉跖c調(diào)脂、抗凝、中藥聯(lián)用從而完全避免股骨頭壞死發(fā)生，有待進一步研究。

[1]黃 俊.股骨頭缺血壞死的治療[J].實用全科醫(yī)學，2007，5(7)：642-643.

[2]楊妍想，張月敏，崔曉霞.高壓氧治療股骨頭無菌壞死的療效觀察[J].中國實用醫(yī)藥，2010，5(15)：104-105.

[3]Reis ND，Schwartz O，Militianu D，et al.Hyperbaric oxygen therapy as a treatment for stage-I avascular necrosis of the femoral head[J].J Bone Joint Surg Br，2003，85(3)：371-375.

[4]Peskin B，Shupak A，Levin D，et al.Effects of non-weight bearing and hyperbaric oxygen therapy in vascular deprivation-induced osteonecrosis of the rat femoral head[J].Undersea Hyperb Med，2001，28(4)：187-194.

[5]Yang L，Boyd K，Kaste SC，et al.A mouse model for glucocorticoidinduced osteonecrosis：effect of a steroid holiday[J].J Orthop Res，2009，27(2)：169-175.

[6]李衛(wèi)哲，李景南，張 新.抗凝藥物預防激素所致股骨頭壞死[J].吉林大學學報：醫(yī)學版，2003，29(4)：475-476.

[7]Norman D，Miller Y，Sabo E，et al.The effects of enoxaparin on the reparative processes in experimental osteonecrosis of the femoral head of the rat[J].APMIS，2002，110(3)：221-228.

[8]Pritchett JW.Statin therapy decreases the risk of osteonecrosis in patients receiving steroids[J].Clin Orthop Relat Res，2001(386)：173-178.

[9]Lai KA，Shen WJ，Yang CY，et al.The use of alendronate to prevent early collapse of the femoral head in patients with nontraumatic osteonecrosis.A randomized clinical study[J].J Bone Joint Surg Am，2005，87(10)：2 155-2 159.

[10]史風雷，任麗霞，孫升云，等.復方丹參注射液預防激素性股骨頭壞死的初步研究[J].中醫(yī)正骨，2002，14(4)：195-197.

[11]潘曉雯，張 禹，潘樹義，等.高壓氧治療SARS后股骨頭壞死六例[J].中華航海醫(yī)學與高氣壓醫(yī)學雜志，2004，11(2)：105-106.

[12]潘樹義，潘曉雯，張 禹，等.高壓氧治療SARS后股骨頭壞死51例[J].中華航海醫(yī)學與高氣壓醫(yī)學雜志，2005，12(3)：159-161.

[13]郭 勇，潘樹義，林 偉，等.SARS患者康復期早期骨缺血壞死的MRI征象[J].中國醫(yī)學影像技術，2004，20(12)：1 911-1 914.

[14]易 偉，薛德麟.高壓氧在神經(jīng)外科疾病治療中的機理和應用[J].中國康復，2003，18(6)：379-380.

[15]印衛(wèi)鋒，郭風勁，陳安民.高壓氧治療胸腰椎骨折合并脊髓損傷[J].中國康復，2004，19(5)：292-293.

Hyperbaric Oxygenation(HBO)on Preventing the Steroid-Induced Avascular Necrosis of the Rats

Zhao Zhenguang1,2,Pan Shuyi1,2,Li Hang2
(1.301 Hospital of PLA,Beijing,China 100853; 2.Navy General Hospital of PLA,Beijing,China 100048)

Objective To investigate the effects of hyperbaric oxygenation (HBO)on preventing the steroid-induced avascular necrosis of the femoral head (SANFH)of mammals.Methods Distributing the 35 male Wistar rats into 3 groups：5 rats for blank group, 15 rats for model group,and 15 rats for control group.The rats in the model group and the control group were injected the dexamethasone sodium phosphate injection(10 mL/kg,2 times/week)in the abdominal cavity to built the model of SANFH.While establishing the rats model,the rats in the control group were given the HBO (pressure：1.8ATA,1 time/day,1 hour/time)at the same time.And the blank group were injected normal saline.After 8 weeks,anteroposterior bilateral hip X-Ray examinations were performed in all of the rats.Then,executed them,took the femoral head out and the general observation and histological study were performed.Results There was no obvious abnormality in the results of the general observation and the X-Ray examinations.But there were visible differences between model group and control group in the pathological sections.After stained with HE,the sections were observed under the light microscope：there were no focal osteonecrosis in the sections of the blank group and obvious focal osteonecrosis in the model group.And comparing with the model group,the osteocytes in the control group had a lighter damage.Conclusion HBO can prevent the damage of osteocytes during earlier period of SANFH.

hyperbaric oxygenation;rat;femoral head necrosis;glucocorticoid

R459.9；R332

A

1006-4931(2015)19-0025-03

趙振廣，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事臨床高壓氧科治療工作，（電子郵箱）xiaoyu-free＠126.com；潘樹義，博士研究生，主任醫(yī)師，研究方向為高壓氧對疾病的防治，本文通訊作者，（電子郵箱）psy9992011＠163.com。

2015-02-05)

*北京市自然基金資助項目，項目編號：7154241；全軍醫(yī)學科技青年培育項目，項目編號：13qnp075。