吉西他濱耐藥的胰腺癌SW1990細胞株的建立及相關(guān)特性檢測

賈一夫，丁 飛，余 躍，高 萌，楊顯珠，王 均

吉西他濱耐藥的胰腺癌SW1990細胞株的建立及相關(guān)特性檢測

賈一夫1，丁 飛1，余 躍1，高 萌1，楊顯珠2，王 均2

摘要目的 探討對吉西他濱（GEM）耐藥的胰腺癌SW1990細胞誘導(dǎo)方法，以期進一步認識胰腺癌耐藥的發(fā)生機制，并對誘導(dǎo)的GEM耐藥的胰腺癌細胞與其親本細胞的生物學(xué)特性進行比較。方法 采用逐步濃度遞增法誘導(dǎo)對GEM耐藥的細胞株SW1990-GZ。MTT法檢測SW1990和SW1990-GZ的半數(shù)致死量（IC50）、耐藥系數(shù)（R），并觀察其生長差異。采用高效液相色譜法（HPLC）檢測不同時間點SW1990和SW1990-GZ對GEM藥物的攝取情況。結(jié)果 SW1990和SW1990-GZ的IC50為（0.07±0.002 1）、（87.50± 3.240 0）μg／ml，R＝1 250；在不同濃度GEM作用下，誘導(dǎo)后耐藥的SW1990-GZ對GEM的敏感性明顯降低。細胞生長曲線顯示耐藥細胞SW1990-GZ相對于SW1990生長緩慢。不同時間點GEM孵育后，SW1990-GZ細胞對GEM藥物的攝取較SW1990細胞降低。結(jié)論 成功誘導(dǎo)了耐GEM藥物的SW1990-GZ細胞株，耐藥性能穩(wěn)定、明顯。SW1990-GZ細胞可能存在著一定的機制使得細胞攝取GEM降低。

關(guān)鍵詞人類胰腺癌細胞株；吉西他濱耐藥；建立

2015－01－27接收

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院消化內(nèi)科，合肥 230001

2中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國家實驗室，合肥 230027

胰腺癌是預(yù)后最差的人類實體瘤之一，其5年生存率不足5%［1］。大部分胰腺癌患者初診時已錯過手術(shù)切除機會，對放療敏感性低，對化療藥物易產(chǎn)生耐藥性。吉西他濱（gemcitabine，GEM）是胰腺癌臨床一線治療用藥，相對于傳統(tǒng)化療藥物，其不僅提高了有效率，而且大大改善了患者的生活質(zhì)量。但隨著臨床上GEM耐藥性的出現(xiàn)，使得其藥效的發(fā)揮大打折扣［2］。因此，構(gòu)建耐GEM的胰腺癌細胞并研究耐藥機制是當(dāng)前胰腺癌防治最迫切的研究課題。該實驗以人胰腺癌SW1990細胞為研究對象，構(gòu)建對GEM耐藥的胰腺癌細胞株，并對耐藥細胞與親本細胞的一些特性進行檢測與比較。

1 材料與方法

1．1 藥物、試劑及細胞系株 人胰腺癌細胞株SW1990（中科院上海細胞庫）；GEM（法國Lilly公司）；RPMI-1640、胎牛血清（美國Gibco公司）；四氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（美國Sigma公司）。

1．2 方法

1．2．1 耐藥細胞SW1990-GZ的建立 耐藥細胞株SW1990-GZ為SW1990細胞株由GEM經(jīng)濃度遞增法逐步誘導(dǎo)獲得，簡述如下。不同濃度的GEM培養(yǎng)SW1990細胞1周后，觀察細胞死亡情況，篩選出SW1990細胞的半數(shù)致死量（median lethal dose，IC50）為0．07 μg／ml，加入GEM至終濃度為0.1 μg／ml，在培養(yǎng)箱內(nèi)共同培養(yǎng)48 h后，棄含藥培養(yǎng)液。此時，大部分細胞死亡，存活細胞緩慢生長；更換普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待存活細胞長滿培養(yǎng)箱后，進入對數(shù)生長期后，傳代2次，在重復(fù)同一劑量的藥物培養(yǎng)；至較穩(wěn)定后在0．4 μg／ml的GEM中繼續(xù)培養(yǎng)，依此每次使藥物濃度4倍遞增，最終使藥物濃度達到400 μg／ml；如此反復(fù)遞增加藥，篩選存活細胞繼續(xù)培養(yǎng)后，直至其對高濃度的GEM產(chǎn)生穩(wěn)定耐藥性，并且在無藥培養(yǎng)液中以及反復(fù)凍存后耐藥性依然保持穩(wěn)定，歷時10個月獲得對GEM藥物穩(wěn)定耐受的細胞株SW1990-GZ。培養(yǎng)SW1990-GZ經(jīng)歷多代傳代后可定期向培養(yǎng)基中加入4 μg／ml GEM以維持細胞耐藥性。

1．2．2 MTT法檢測SW1990和SW1990-GZ對GEM的敏感性 取對數(shù)生長期SW1990及SW1990-GZ細胞經(jīng)PBS清洗胰酶消化后進行計數(shù)。取適當(dāng)?shù)募毎囵B(yǎng)液接種于96孔板，細胞密度為5 000／孔，每孔液體量100 μl／孔；置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)24 h后，去除每孔中舊培養(yǎng)液，并向

其中加入含不同濃度GEM的培養(yǎng)基繼續(xù)溫箱孵育72 h，棄去培養(yǎng)基；每孔加入以無血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋的0．5 mg／ml的MTT 100 μl，37℃孵育4 h，棄上清液；每孔加入DMSO 150 μl溶解，室溫振蕩15 min，于490 nm處應(yīng)用自動酶標儀檢測吸光度（optical delnsity，OD）值。每個藥物濃度設(shè)置4個復(fù)孔，以種細胞不加藥孔為對照組及以無細胞不加藥的孔為空白對照組。不同濃度GEM作用下計算細胞存活率。細胞存活率（%）＝（加藥細胞OD值－空白對照OD值）／（對照細胞OD值－空白對照OD值）×100%。計算耐藥細胞系SW1990-GZ的耐藥系數(shù)（R）。R＝SW1990-GZ細胞的IC50／SW1990細胞的IC50。繪制劑量－細胞存活率曲線，每項實驗至少重復(fù)3次。

1．2．3 細胞生長曲線的繪制 取對數(shù)生長期的SW1990及SW1990-GZ細胞經(jīng)PBS清洗，胰酶消化后制成單細胞懸液后，經(jīng)細胞計數(shù)器進行計數(shù)后分別接種于24孔板，細胞密度5 000／孔，液體量500 μl／孔。置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)，于種板后第1天開始用MTT比色法進行細胞生長檢測，即向每孔中加入MTT溶液500 μl孵育4 h后，向每孔加入DMSO，隨后進行酶標儀下490 nm 的OD值檢測。每天1計，共計數(shù)8 d，每種細胞每次計數(shù)設(shè)3個復(fù)孔。

1．2．4 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測細胞攝取情況 取對數(shù)生長期細胞進行清洗消化后吹打成單細胞懸液，計數(shù)后取相應(yīng)量進行24孔板接種，細胞密度1×105／孔，液體量0．5 ml／孔。恒溫培養(yǎng)箱孵育24 h后向每孔中加入含GEM的培養(yǎng)基0．5 ml，GEM濃度200 μg／ml。從加藥開始計時，分別設(shè)定2 h與4 h的細胞攝取時間，每個時間點2個復(fù)孔，以不加藥的細胞孔為空白對照。到時間后吸去含藥培養(yǎng)基，并用PBS清洗3次，向每孔中加入1%SDS＋2%Triton的細胞裂解液進行常溫下裂解以釋放藥物，該操作結(jié)束可進行凍融促進更進一步裂解細胞。充分裂解后用0．5 ml甲醇萃取，渦旋震蕩充分，混勻萃取除蛋白及碎片，10 000 r／min離心10 min。取上清液棄沉淀，樣品旋干除去有機萃取劑。旋干后樣品定容到100 μl后進行HPLC檢測。HPLC檢測參數(shù)：柱溫30℃，紫外檢測波長268 nm，流動相如下：醋酸銨（pH＝5.5，0.05 mol／L）：甲醇溶液＝85∶15。外標法建立標準曲線，計算SW1990-GZ及SW1990細胞的萃取效率。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)均以±s表示；組間變量比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2．1 SW1990-GZ細胞與親本細胞生物學(xué)特性的比較

2．1．1 檢測SW1990-GZ及SW1990對GEM藥物的敏感性 經(jīng)MTT試驗顯示，在各個濃度的GEM的作用下，SW1990-GZ細胞相較于誘導(dǎo)耐藥前的SW1990細胞顯現(xiàn)出顯著GEM耐受性，即SW1990-GZ細胞對GEM的敏感性急劇下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝6.562，P＜0.01）。SW1990與SW1990-GZ關(guān)于GEM的IC50值為（0.07±0.002 1）、（87.50 ±3.240 0）μg／ml，R＝1 250。SW1990-GZ和SW1990細胞的藥物濃度－細胞存活率曲線見圖1。

2．1．2 SW1990-GZ與SW1990生長趨勢的檢測最終繪制的生長天數(shù)－MTT OD值曲線見圖2，表明與SW1990細胞相比，SW1990-GZ細胞系生長增殖較緩慢（t＝3.611，P＜0.05）。

2．2 HPLC檢測SW1990-GZ與SW1990細胞對GEM藥物的攝取情況 實驗中，SW1990-GZ細胞的萃取效率為80.26%，SW1990系的萃取效率為83.12%。在攝取2 h后經(jīng)HPLC檢測，SW1990細胞與誘導(dǎo)耐藥后的SW1990-GZ細胞比較，胞內(nèi)藥物濃度顯著增高（t＝7.047，P＜0.05）；4h后，SW1990

細胞胞內(nèi)藥物濃度仍高于SW1990-GZ細胞（t＝14.81，P＜0.01）。見圖3。

3 討論

構(gòu)建腫瘤耐藥的癌細胞系方法有多種，如基因轉(zhuǎn)染法、藥物誘導(dǎo)篩選法等［3］。本實驗采取GEM藥物濃度間歇遞增的方法對原本不耐受GEM的親本SW1990細胞進行長期誘導(dǎo)，最終經(jīng)過10個月才成功構(gòu)建對GEM耐藥SW1990-GZ細胞株。在進行誘導(dǎo)細胞耐藥的過程中，有以下問題需要注意：①先需對親本細胞進行最基本的GEM藥物敏感性的檢測以獲得IC50，然后根據(jù)此濃度，篩選出一個適宜的初始濃度，再進行細胞耐藥性誘導(dǎo)；②在加大劑量進行下一步誘導(dǎo)前，需將細胞培養(yǎng)基換成不含GEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長穩(wěn)定，否則持續(xù)讓細胞處于不同藥物濃度更換下，其細胞狀態(tài)沒有恢復(fù)到最佳，容易導(dǎo)致誘導(dǎo)試驗的失敗；③強調(diào)GEM藥物濃度梯度合適，間歇遞增的梯度過大或過小均不利于穩(wěn)定耐藥性的獲得；④耐藥細胞的建立過程，關(guān)鍵是要有基本的細胞培養(yǎng)學(xué)知識與技術(shù)，在培養(yǎng)過程中要小心謹慎，防止細胞培養(yǎng)操作過程中的細胞污染而造成細胞死亡。本研究經(jīng)過MTT法檢測細胞對GEM的敏感性及HPLC檢測細胞對GEM的攝取，證實誘導(dǎo)耐藥的SW1990-GZ細胞株有良好的耐藥特性且耐藥性穩(wěn)定明顯，這使得該耐藥細胞株有望成為后期實驗探討GEM耐藥機理及如何攻克細胞耐藥的理想細胞模型。間歇濃度梯度遞增法在給藥時間上類似于臨床胰腺癌化療的時間周期，故通過此法得到的研究結(jié)果可能對臨床更有指導(dǎo)意義。

本研究通過觀察耐GEM的SW1990-GZ細胞與親本細胞SW1990生長情況，發(fā)現(xiàn)前者的生長速度明顯較后者緩慢。導(dǎo)致這種現(xiàn)象出現(xiàn)的機制，從GEM藥物殺傷腫瘤細胞的機制考慮，GEM是通過參與細胞DNA合成過程來達到殺死腫瘤細胞的目的。在誘導(dǎo)GEM耐藥的過程中，用GEM間歇地處理生長期細胞，使處于DNA合成活躍的增殖期細胞更早受到抑制影響；不斷地進行這樣一種篩選，生長增殖緩慢對GEM敏感性差的胰腺癌細胞就被遺留下來，組成了耐GEM的胰腺癌細胞株。研究［4］表明，腫瘤是由異構(gòu)的細胞群與腫瘤干細胞的一個小子集（兩者）維持腫瘤的形成和生長。研究［5］報道，化療藥物雖然能夠殺傷大部分的腫瘤細胞，但腫瘤干細胞存留下來，沒有被藥物殺傷，這可能是化療藥物導(dǎo)致腫瘤耐藥的重要機制之一。親本細胞經(jīng)GEM藥物誘導(dǎo)耐藥后，推測由于化療藥物的長期誘導(dǎo)殺傷致大部分腫瘤細胞死亡，而處于化療藥物不敏感的腫瘤干細胞能在此過程中生存下來成為耐藥細胞系的主生力量。研究［6］表明腫瘤干細胞長期處于休眠狀態(tài)或者生長增殖緩慢狀態(tài)。本研究中GEM耐藥細胞SW1990-GZ較親本細胞SW1990的生長速度慢，推測間歇遞增濃度的GEM可能起到一種篩選作用，同時對化療藥物不敏感的腫瘤干細胞可能參與了此過程。

本實驗顯示SW1990-GZ細胞較其親本細胞胞內(nèi)的GEM藥物濃度明顯減少。該種耐藥細胞有可

能存在某種缺陷使得其對GEM藥物的攝取障礙，或者攝取GEM后，該種耐藥細胞可能存在某種機制使得攝取進入細胞的GEM被快速的外排出胞；上述兩種現(xiàn)象最終都可能導(dǎo)致細胞內(nèi)的GEM濃度減少，從而影響了藥物的抗腫瘤效應(yīng)，產(chǎn)生了腫瘤細胞耐藥性。

GEM是一種前藥，需要核苷酸引入細胞內(nèi)，減少平衡核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白（human equilibrative nucleoside transporter，hENT1）的表達將阻斷細胞對GEM的攝取，從而賦予GEM對細胞的低毒性作用。有研究［6］表明，腫瘤細胞內(nèi)hENT1低表達的胰腺癌患者很少能從GEM的治療中獲益。Tanaka et al［6］分析了149例局部晚期胰腺癌的轉(zhuǎn)運蛋白基因多態(tài)性，結(jié)果hENT1低表達不僅與GEM化療的Ⅲ、Ⅳ度粒細胞減少相關(guān)（P＝0.17），而且與不佳預(yù)后有關(guān)（無進展生存期4.2個月vs 8.3個月）。本實驗中SW1990-GZ細胞胞內(nèi)的GEM攝取明顯減少，推測可能與hENT1低表達有關(guān)。從這方面研究細胞耐藥的機制，有可能糾正藥物攝取缺陷，促進對細胞的藥物耐受性攻克，為今后更有效的治療胰腺癌提供一條新途徑。

本實驗成功誘導(dǎo)了GEM耐受的胰腺癌細胞株，耐藥性能明顯穩(wěn)定，為進一步研究GEM耐藥機制提供了有效的細胞模型。

參考文獻

［1］ Siegel R，Naishadham D，Jemal A．Cancer statistics，2013［J］．CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11－30．

［2］ Long J，Zhang Y，Yu X，et al．Overcoming drug resistance in pancreatic cancer［J］．Expert Opin Ther Targets，2011，15（7）：817 －28．

［3］ Azmi A S，Bao B，Sarkar F H．Exosomes in cancer development，metastasis，and drug resistance：a comprehensive review［J］．Cancer Metastasis Rev，2013，32（3－4）：623－42．

［4］ Hong S P，Wen J，Bang S，et al．CD44-positive cells are responsible for gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells［J］．Int J Cancer，2009，125（10）：2323－31．

［5］ Dean M，F(xiàn)ojo T，Bates S．Tumour stem cells and drug resistance ［J］．Nat Rev Cancer，2005，5（4）：275－84．

［6］ Tanaka M，Javle M，Dong X，et al．Gemcitabine metabolic and transporter gene polymorphisms are associated with drug toxicity and efficacy in patients with locally advanced pancreatic cancer ［J］．Cancer，2010，116（22）：5325－35．

Establishment of the human resistant pancreatic cancer cell lines SW1990／gemcitabine and its characteristics test

Jia Yifu，Ding Fei，Yu Yue，et al
（Dept of Gastroenterology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

AbstractObjective To investigate how to induce the resistant cell line SW1990／gemcitabine（GEM）for further clarify the resistant mechanisms of pancreatic cancer，and compare the characteristics between SW1990 and SW1990-GZ．Methods SW1990-GZ was derived from the human pancreatic cancer cell lines SW1990 by exposing the cells to intermittently increasing concentrations of GEM．The IC50，resistance index（R），and growth difference was observed by MTT assay．Cellular intake of SW1990 and SW1990-GZ was detection by HPLC．Results The IC50of SW1990 and SW1990-GZ were respectively（0.07±0.002 1）μg／ml，（87.50±3.240 0）μg／ml，R＝1 250；sensibility to GEM in SW1990-GZ were more lower than that in SW1990 cell in different concentration s of GEM．Growth rate of SW1990-GZ was slower than that of SW1990 from the growth curve；GEM intake in SW1990-GZ was lower than that in SW1990 in different times．Conclusion Human resistant pancreatic cancer cell lines SW1990／GEM is successfully established，and its resistant characteristics are stable and clear．SW1990-GZ maybe decrease GEM intake by some unclear pathways．

Key wordshuman pancreatic cancer cell lines；gemcitabine resistance；establish

作者簡介：賈一夫，男，碩士研究生；余 躍，男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：yuyuemd＠163．com；王 均，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：jwang699＠ustc．edu．cn

基金項目：安徽省自然科學(xué)基金（編號：1208085MH174）

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0419－04

中圖分類號R 735．9