失重對大鼠腎上腺髓質(zhì)激素分泌及m iRNA-375表達的影響

溫麗君，吳繼華，宋淑軍，王艷茹，劉俊麗，司少艷，崔彥，張建中，周金蓮

機體在失重或模擬失重環(huán)境下可出現(xiàn)心血管脫適應(yīng)癥[1]，主要表現(xiàn)為心動過速、血壓下降甚至暈厥。研究表明，失重或模擬失重條件下的心血管脫適應(yīng)與機體血液循環(huán)中腎上腺髓質(zhì)激素的變化有關(guān)，但具體機制尚不明確[2]。腎上腺髓質(zhì)激素主要包括多巴胺(dopam ine，DA)、去甲腎上腺素(norep inephrine，NE)和腎上腺素(epinephrine，E)，機體處于安靜狀態(tài)時，髓質(zhì)激素分泌量很少，而處于緊急情況時交感神經(jīng)興奮，髓質(zhì)激素分泌可驟然增多，使神經(jīng)興奮，反應(yīng)靈敏，供氧、供血增加，血糖升高，糖和脂肪分解加速，以供給更多的能量，提高機體的應(yīng)激能力。酪氨酸羥化酶(tyrosine hyd roxy lase，TH)是腎上腺髓質(zhì)激素合成過程中的限速酶，其活性對NE和E的合成起關(guān)鍵作用。文獻報道航天員在航天飛行過程中血漿腎上腺髓質(zhì)激素水平波動明顯且不一致，其在模擬失重條件下的變化亦存在爭議[3-5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，m iRNA-375在腎上腺髓質(zhì)中表達，而在皮質(zhì)中不表達。因此，本研究探討模擬失重條件下大鼠血漿腎上腺髓質(zhì)激素、TH及m iRNA-375表達變化特點，探討其m iRNA-375表達對腎上腺髓質(zhì)激素合成與分泌的影響及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 SPF級W istar成年雄性大鼠56只，體重280～350g，購自中國北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養(yǎng)條件為人工控制22±2℃，12h晝夜光照，自由進食飲水。適應(yīng)飼養(yǎng)1周后將大鼠隨機分為0h(正常對照組)、6h、12h、1d、3d、5d、7d組(n=8)。采用Morey-Holton尾懸吊法[6]建立模擬失重動物模型，所有操作經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會批準后進行。實驗步驟參照相關(guān)文獻報道[7]。實驗前后測量體重。除6、12h組外，其余各組選擇在9:00am取材。利用眼球摘除法取血標本，摘取腎上腺，剝除脂肪，測重，左側(cè)腎上腺置于1.5m l EP管中–80℃冰箱保存，右側(cè)腎上腺置于pH 7.4多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 大鼠血漿腎上腺髓質(zhì)激素測定 大鼠懸吊結(jié)束后，采用10%水合氯醛行腹腔麻醉，利用眼球摘除法取血，置于含20μl 10% EDTA的滅菌EP管中，室溫靜置30m in，3500r/m in離心10m in，收集上層血漿，–20℃冰箱保存，利用放射免疫分析法測定血漿腎上腺髓質(zhì)激素含量，所有操作按說明書進行。

1.3 免疫組化檢測腎上腺髓質(zhì)TH蛋白表達 腎上腺石蠟包埋切片后，采用SABC法行免疫組化檢測。具體步驟如下：切片脫蠟，高溫抗原修復(fù)，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，羊血清封閉非特異性抗原，加TH一抗(以PBS為對照)，4℃孵育過夜，加二抗GAR-B(生物素標記的山羊抗兔IgG)室溫孵育3h，加SP-HR室溫孵育2h，DAB試劑盒顯色，脫水封固，顯微鏡下觀察并照相。TH陽性為胞質(zhì)著色，DAB染色為棕黃色或棕褐色。

1.4 Western blotting檢測腎上腺髓質(zhì)TH蛋白表達水平 取凍存腎上腺，加入200μl蛋白裂解液，冰上研磨至糊狀，反復(fù)凍融6次，每次2m in，4℃條件下12 000r/m in離心60m in，取上清，按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測其濃度并分裝，–80℃保存。SDS-PAGE凝膠電泳，采用半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用脫脂奶粉封閉液封閉2h，稀釋抗體，室溫下與膜孵育2h，TBST快速洗膜6次，稀釋二抗并與膜孵育2h，再次用TBST快速洗滌膜6次，AP試劑盒顯色并照相。

1.5 RT-PCR檢測腎上腺髓質(zhì)TH m RNA和m iRNA-375表達 根據(jù)Gen Bank設(shè)計引物序列如下。TH上游引物5'-CCTCCTTGTCTCGGGCTGTA-3'，下游引物5'-GGCGAGCACAGTAATCACCTTC-3'；GAPDH上游引物5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'，下游引物5'-GGGTGGTCCAGGGTTTCTTA-3'；m iRNA-375上游引物5'-AGTGTCGTCAGAAAGAACGAACGGC-3'，下游引物5'-CTCAACTGGTGCGTGGAGTC-3'；U6上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。m iRNA反轉(zhuǎn)錄引物序列：m iRNA-375-RT：CTCAACTGGTGTCGTG GAGTCGGCAATTCAATTCAGTTGAGAGCGCACT；U6-RT：AACGCTTCACGAATTTGCGT。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。提取組織RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR反應(yīng)體系為15μl，上、下游引物分別為0.3μl。PCR反應(yīng)條件為95℃ 30s，95℃5s，60℃ 34s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后記錄Ct值，根據(jù)熔解曲線判斷所提取產(chǎn)物的純度并計算TH和m iRNA-375的相對表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)采用±s表示，正態(tài)分布及方差齊性檢驗后，多個樣本比較采用單因素方差分析，多個均數(shù)之間兩兩比較采用LSD-t檢驗或SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血漿腎上腺髓質(zhì)激素水平測定 尾懸吊模擬失重條件下，大鼠血漿腎上腺髓質(zhì)激素含量波動明顯，6～12h出現(xiàn)一過性下降，隨后急劇升高，3d形成峰值，之后呈下降趨勢，7d時接近正常對照組水平。E和NE變化趨勢基本一致，但前者反應(yīng)超前。尾懸吊1～5d大鼠E含量及尾懸吊3～5d大鼠的NE含量顯著升高，與正常對照(尾懸吊0h)之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。DA的波動幅度相對較小，僅3d組的含量與正常對照組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

圖1 模擬失重情況下各組大鼠血漿腎上腺髓質(zhì)激素含量變化Fig.1 Effect of sim u la ted nu ll g ravity on p lasm a m edu lliad renal ho rm one of rats

2.2 免疫組化染色觀察TH蛋白表達 TH蛋白陽性表達胞質(zhì)呈棕褐色。正常對照組大鼠腎上腺髓質(zhì)胞質(zhì)染色為陽性(圖2A、2B)，6h～1d各組大鼠腎上腺髓質(zhì)胞質(zhì)染色加深(圖2C、2D)，3d組染色最強(圖2E、2F)，7d組染色逐漸恢復(fù)。陰性對照組腎上腺髓質(zhì)和皮質(zhì)的胞核及胞質(zhì)均未見著色(圖2G、2H)。

2.3 大鼠腎上腺髓質(zhì)TH m RNA和蛋白表達RT-PCR檢測結(jié)果顯示，各組大鼠腎上腺組織TH m RNA表達波動明顯，6h時呈現(xiàn)一過性下降，隨后即上升，1d到達峰值，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，之后呈下降趨勢，5d時形成谷值，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，7d時又有所升高。Western b lotting檢測結(jié)果顯示，3d時TH蛋白表達水平與對照組比較顯著升高(P＜0.05)，其余各組蛋白表達水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。TH m RNA和蛋白表達趨勢一致，但TH蛋白表達強度相對滯后(圖3)。

圖2 免疫組化染色觀察模擬失重大鼠腎上腺髓質(zhì)內(nèi)TH蛋白表達(DAB)Fig.2 Exp ression of TH p rotein in ad renal m edulla of rats under simulated null gravity (Immunohistochem istry staining,DAB)

2.4 大鼠腎上腺髓質(zhì)m iRNA-375表達 各組大鼠腎上腺髓質(zhì)m iRNA-375表達水平波動明顯，表現(xiàn)為尾懸吊早期(6h)呈一過性顯著升高，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；隨后快速下降，12h、1d和3d時表達受到明顯抑制，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；5d時表達量增加，7d時顯著升高(P＜0.05，圖4)。

3 討 論

航天員飛行及模擬失重環(huán)境中腎上腺髓質(zhì)功能的變化情況，已受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注。相關(guān)研究證實，航天員在航天飛行過程中血漿及尿腎上腺髓質(zhì)激素的檢測結(jié)果波動明顯且不一致，不僅不同飛行任務(wù)中航天員體內(nèi)腎上腺髓質(zhì)激素的量升降不一，同一飛行乘組中航天員之間的變化也不盡相同[5,8]。在人體模擬失重實驗中，研究結(jié)果則較為一致，表現(xiàn)為血漿或尿中腎上腺髓質(zhì)激素量下降[9-10]。

圖3 各組大鼠腎上腺髓質(zhì)TH m RNA(A)和蛋白(B)表達變化Fig. 3 Effect of sim u lated nu ll g ravity on m RNA (A) and p ro tein (B) exp ression of TH in ad renal m edu lla in rats(1)P＜0.05 com pared with 0h (control group); (2)P＜0.05 com pared with 6h group; (3)P＜0.05 com pared with 12h group; (4)P＜0.05 com pared with 1d g roup; (5)P＜0.05 com pared with 3d g roup

圖4 大鼠腎上腺髓質(zhì)m iRNA-375水平變化Fig.4 Changes of m iRNA-375 exp ression in adrenal medulla of rats(1)P＜0.05 com pared with 0h (con tro l group); (2)P＜0.05 com pared with 6h group; (3)P＜0.05 com pared with 12h group; (4)P＜0.05 com pared with 1d group; (5)P＜0.05 com pared with 3d group;(5)P＜0.05 com pared with 5d g roup

模擬失重條件下大鼠體內(nèi)腎上腺髓質(zhì)激素變化的研究結(jié)果存在爭議。范全春等[11]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠尾懸吊21d后血清中NE含量明顯增加，Macho等[12]也有同樣結(jié)論，這與陳杰等[13]報道長期尾懸吊大鼠血漿中NE含量明顯下降矛盾，可能與實驗設(shè)計、環(huán)境、時相、檢測方法等的不同有關(guān)。我們的研究結(jié)果顯示，大鼠血漿中NE、E水平在尾懸吊早期呈現(xiàn)一過性下降，隨后急劇升高，3d時達高峰，之后下降，至7d時接近正常對照組水平。這種明顯的波動，首先可能與大鼠姿勢改變、體液重新分配、頭部及上肢血液瞬間增加、刺激心肺壓力感受器進而導(dǎo)致交感神經(jīng)活性暫時受到抑制有關(guān)；伴隨持續(xù)的失重應(yīng)激狀態(tài)，機體交感神經(jīng)活性的一過性抑制解除后，腎上腺髓質(zhì)細胞活性和腎上腺髓質(zhì)激素的合成及分泌迅速增加；一旦機體從整體到各系統(tǒng)尤其心血管系統(tǒng)對失重環(huán)境逐漸適應(yīng)后，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)包括腎上腺髓質(zhì)激素的合成和分泌變化則趨向穩(wěn)定，這種變化符合機體的正常應(yīng)激反應(yīng)過程。

Le lkes等[14]研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠搭載太空飛船STS-54飛行6h后，其髓質(zhì)中腎上腺髓質(zhì)激素下降的同時伴隨TH表達水平的降低，但多巴胺β-羥化酶(dopam ine β hyd roxylase，DBH)及苯乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(phenylethanolam ine N-m ethyltransferase，PNM T)水平無明顯改變。本實驗結(jié)果表明，大鼠血漿TH m RNA及蛋白在實驗過程中波動明顯，二者之間及與NE和E的變化趨勢基本一致，進一步說明模擬失重早期血漿腎上腺髓質(zhì)激素的一過性下降和隨后的明顯升高以及后期的變化趨緩均受到TH的嚴密調(diào)控。

m iRNA-375最初發(fā)現(xiàn)于胰腺β細胞[15]，隨后研究表明其在神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等組織中均有表達，并通過不同的靶基因抑制下游網(wǎng)狀細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮作用，尤其與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[16]。在機體多系統(tǒng)組織的增殖和分化過程中也有重要作用，包括影響脂肪細胞分化、神經(jīng)突分化、軟骨祖細胞遷移、肺泡上皮細胞轉(zhuǎn)化等[17-20]。早先有研究發(fā)現(xiàn)，m iRNA-375的下游靶基因包括14-4-3、SP1、ERK1/2等，而行使信號網(wǎng)絡(luò)樞紐的14-3-3信號蛋白可與TH蛋白相互作用并增強其活性，促進腎上腺髓質(zhì)激素的合成[21-22]，但m iRNA-375在腎上腺的表達及作用目前尚未見文獻報道。

失重應(yīng)激狀態(tài)及適應(yīng)過程中腎上腺髓質(zhì)激素的合成、分泌和TH調(diào)節(jié)有待深入探討。隨著對m iRNA廣泛作用的認識，結(jié)合我們前期實驗研究中偶然發(fā)現(xiàn)m iRNA-375在腎上腺髓質(zhì)中存在的特殊表達情況，本實驗檢測模擬失重條件下大鼠腎上腺髓質(zhì)中m iRNA-375的表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗大鼠腎上腺髓質(zhì)m iRNA-375表達水平波動明顯，表現(xiàn)為尾懸吊早期(6h)呈一過性顯著升高，隨后受到迅速而明顯抑制，在較低水平波動，至實驗第5d時表達量增加，7d時顯著升高，其變化趨勢與TH表達水平呈現(xiàn)明顯負相關(guān)。結(jié)合文獻和本實驗結(jié)果，我們推測腎上腺髓質(zhì)中m iRNA-375在基因水平上通過14-3-3信號蛋白調(diào)節(jié)(抑制)TH蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達，進而影響腎上腺髓質(zhì)中腎上腺髓質(zhì)激素的合成和分泌，其作用機制有待進一步深入研究。

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