CD25siRNA納米粒抑制大鼠高危角膜移植免疫排斥的實(shí)驗研究

石韻潔，秦琴，趙敏

CD25siRNA納米粒抑制大鼠高危角膜移植免疫排斥的實(shí)驗研究

石韻潔，秦琴，趙敏

目的 探討EntransterTM-CD25siRNA納米粒對大鼠高危角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的抑制及延長角膜植片存活時間的作用。方法 以SD大鼠為受體(n=96)，Wistar大鼠為供體(n=48)。受體右眼堿燒傷后14d行穿透性角膜移植手術(shù)。術(shù)后將大鼠隨機(jī)分為陰性對照組(A組)、對照siRNA治療組(B組)、治療1組(C組，術(shù)后2h給予EntransterTMCD25siRNA復(fù)合物點(diǎn)眼)、治療2組(D組，術(shù)后2h和術(shù)后第7天給予EntransterTM-CD25siRNA復(fù)合物點(diǎn)眼)，每組24只。裂隙燈下觀察大鼠角膜情況并對其排斥反應(yīng)進(jìn)行評分，HE染色檢測角膜組織病理學(xué)變化，透射電鏡觀察植片超微結(jié)構(gòu)改變，免疫組化和熒光定量PCR法檢測角膜CD25的表達(dá)。結(jié)果 與A、B組比較，C、D兩組角膜植片存活時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HE染色顯示A、B組角膜植片增厚、水腫，膠原纖維排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤；C、D組植片排斥程度較A、B組明顯減輕。免疫組化染色顯示各組角膜上皮層、基質(zhì)層、內(nèi)皮層均有CD25表達(dá)，且在A、B組中的表達(dá)明顯多于C、D組。透射電鏡觀察顯示C、D組角膜植片基質(zhì)層成纖維細(xì)胞凋亡及壞死較A、B組減輕，超微結(jié)構(gòu)改變具有明顯差異。熒光定量PCR檢測顯示A、B兩組角膜植片中CD25 mRNA的表達(dá)明顯高于C、D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 CD25siRNA納米?？蓽p輕角膜移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)并有效延長角膜植片存活時間。

角膜移植；移植物排斥；納米結(jié)構(gòu)；白細(xì)胞介素2受體α亞單位

角膜移植是成功率最高的器官移植術(shù)[1]，也是目前角膜盲患者復(fù)明的唯一手段，但高危角膜移植術(shù)后仍可發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，是角膜移植術(shù)失敗的主要原因[2]。角膜移植免疫排斥反應(yīng)是一個多因素參與的調(diào)節(jié)過程，T淋巴細(xì)胞激活是其中心環(huán)節(jié)，而作為T淋巴細(xì)胞的主要膜蛋白，白細(xì)胞介素2受體α (CD25)的表達(dá)則是T 細(xì)胞活化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。為了解CD25可否減輕高危角膜移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)，本研究制備了CD25siRNA，并與新型納米載體EntransterTM相連接，對實(shí)驗大鼠高危角膜移植術(shù)后的植片進(jìn)行觀察，旨在為高危角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物及分組 以健康SPF級SD大鼠96只作為受體，Wistar大鼠48只作為供體。供、受體均為雌性，8～10周齡，體重160～180g，裂隙燈檢查未見異常，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗中心提供。實(shí)驗方法符合動物倫理學(xué)要求。

堿燒傷模型的制備[4]：受體大鼠用1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉，將直徑3mm的圓形濾紙在1mol/L NaOH中充分浸透20s，取出濾紙，吸除濾液，貼于大鼠右眼角膜中央燒灼25s。移去濾紙后，立即用大量生理鹽水沖洗結(jié)膜囊，0.25%氯霉素滴眼液點(diǎn)眼。2周后隨機(jī)選擇3個以上象限有新生血管且新生血管達(dá)到角膜中央的大鼠行穿透性角膜移植術(shù)。

高危角膜移植模型的建立：參照Williams等[5]的方法，受體選擇右眼手術(shù)，供體提供雙眼角膜。術(shù)前15min用復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉。于顯微鏡下進(jìn)行手術(shù)，環(huán)鉆鉆取角膜，植片直徑3.5mm，植床直徑3.0mm，以10-0尼龍線間斷縫合8針，線結(jié)暴露不包埋。術(shù)中嚴(yán)格無菌操作。術(shù)后注入粘彈劑形成前房，結(jié)膜下注射慶大霉素0.2萬單位，涂紅霉素眼膏。

納米試劑的制備：按照英格恩EntransterTM轉(zhuǎn)染試劑(北京英格恩生物科技有限公司)說明書，配制EntransterTM-CD25siRNA復(fù)合物(納米試劑Ⅰ，60μl體系)。按相同比例配制EntransterTM-control CD25siRNA復(fù)合物(納米試劑Ⅱ)和生理鹽水。CD25siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，基因序列為：正義5'-GAGGUUUCCGAAGACUGAATT-3'，反義5'-UUCAGUCUUCG GAAACCUCTT-3'。

實(shí)驗分組：通過完全隨機(jī)分組設(shè)計方案把受體大鼠分為4組，每組24只。A組為陰性對照組，術(shù)后2h給予生理鹽水點(diǎn)眼。B組為對照siRNA治療組，術(shù)后2h給予納米試劑Ⅱ點(diǎn)眼。C組為治療1組，術(shù)后2h給予納米試劑Ⅰ點(diǎn)眼。D組為治療2組，除了術(shù)后2h給予納米試劑Ⅰ點(diǎn)眼外，術(shù)后第7天再次用納米試劑Ⅰ點(diǎn)眼。術(shù)后每日用0.25%氯霉素滴眼液抗感染，每日3次，直至受試結(jié)束。

1.2 裂隙燈顯微鏡觀察大鼠角膜情況 自術(shù)后第1天起受體大鼠每日在裂隙燈下進(jìn)行臨床觀測，以混濁、水腫和新生血管3項指標(biāo)進(jìn)行評分，參照Holland等[6]的評分標(biāo)準(zhǔn)，以3項評分之和作為當(dāng)日的排斥反應(yīng)指數(shù)(rejection index，RI)，RI≥6時視為發(fā)生排斥反應(yīng)。術(shù)后5d內(nèi)有嚴(yán)重前房出血、廣泛虹膜前粘連、晶狀體混濁、植片感染者剔除，并補(bǔ)充例數(shù)。

1.3 植片的組織病理學(xué)觀察 術(shù)后第3、10、14、21天各組隨機(jī)處死1只大鼠，術(shù)眼取材，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm切片，HE染色后光鏡下觀察。

1.4 植片超微結(jié)構(gòu)檢查 術(shù)后第3、10、14、21天各組隨機(jī)處死1只大鼠，取完整眼球，置于2.5%戊二醛固定過夜，取角膜中央切削區(qū)1mm×1mm大小的組織環(huán)氧樹脂包埋后制作超薄切片，透射電子顯微鏡下觀察。

1.5 免疫組化染色檢測CD25表達(dá) 術(shù)后第3、7、14、21天各組隨機(jī)處死1只大鼠，術(shù)眼取材，固定包埋，5μm切片后固定于有明膠的載玻片上。用3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉10min后滴加兔抗大鼠CD25單克隆抗體(Abcam公司，英國)，4℃過夜，陰性對照用PBS代替一抗。PBS洗滌后加生物素化山羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)，滴加辣根過氧化物標(biāo)記的鏈霉卵白素，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，光鏡下觀察。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR檢測植片中CD25 mRNA的表達(dá) 術(shù)后第3、7、14、21天各組隨機(jī)處死3只大鼠取其角膜。采用Trizol試劑盒(Invitrogen公司，美國)提取總R NA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TakaR a生物工程有限公司)合成cDNA。采用 SYBR Green Ⅰ實(shí)時熒光定量PCR檢測角膜中CD 2 5 m R N A的表達(dá)。所用引物由上海生工有限公司合成，序列如下：G A P D H上游5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3'，下游5'-GGGCCATCCACAGTCTTCTG-3'；CD25上游5'-GAGGAAGAGCAGAAGAAC-3'，下游5'-GTCTCGGGACTTCATAAC-3'。采用10μl反應(yīng)體系，反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性10min；95℃變性30s，60℃退火及延伸45s，共40個循環(huán)。結(jié)果以2–ΔΔCt表示，以GAPDH值為內(nèi)參照。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。角膜植片生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組角膜移植術(shù)后植片的一般情況 因前房出血、白內(nèi)障及術(shù)后植片感染導(dǎo)致手術(shù)失敗6只眼，排除在外，同時補(bǔ)充相應(yīng)例數(shù)。角膜移植術(shù)后4d，各組角膜植片均透明，有輕度水腫，角膜緣可見火焰狀細(xì)小新生血管長入。術(shù)后5～9d，對照組(A組和B組)表現(xiàn)為植片高度混濁水腫、明顯增厚，大量新生血管長入植片，術(shù)后10d左右植片發(fā)生免疫排斥反應(yīng)(圖1A、B)，治療組(C組和D組)排斥反應(yīng)的發(fā)展相對緩慢，表現(xiàn)為進(jìn)行性混濁、水腫加重，新生血管由植床逐漸長入植片(圖1C、D)，于術(shù)后14d左右發(fā)生排斥反應(yīng)。之后植片的混濁、水腫逐漸減輕，新生血管充盈減輕。

2.2 各組植片的存活時間及生存曲線 C組和D組的角膜存活時間(分別為12.75±1.71、13.67±1.07d)均明顯長于A、B組(分別為8.9 2±1.4 4、8.42±1.56d)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)，而A組和B組、C組和D組之間植片存活時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

圖1 術(shù)后第10天各組大鼠角膜裂隙燈圖像Fig. 1 Rat corneas on day 10 after transplantation observed under the slim lamp microscope

圖2 各組角膜植片生存曲線圖Fig. 2 Survival curves of the corneal graft in 4 groups

2.3 術(shù)后14d角膜排斥反應(yīng)指數(shù)比較 術(shù)后14d時A組和B組角膜水腫、混濁及新生血管比C、D組更為明顯。C組和D組角膜排斥反應(yīng)指數(shù)均明顯低于A、B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而A組與B組、C組與D組植片角膜排斥反應(yīng)指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 各組術(shù)后14d角膜植片排斥反應(yīng)指數(shù)比較(±s，n=12)Tab. 1 Corneal graft rejection index (RI) on day 14 after transplantation (±s, n=12)

表1 各組術(shù)后14d角膜植片排斥反應(yīng)指數(shù)比較(±s，n=12)Tab. 1 Corneal graft rejection index (RI) on day 14 after transplantation (±s, n=12)

(1)P<0.01 compared with group A; (2)P<0.01 compared with group B

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2.4 各組角膜植片組織病理學(xué)檢查結(jié)果 HE染色顯示，移植術(shù)后10d，對照組(A組和B組)角膜植片明顯增厚，角膜基質(zhì)水腫，膠原纖維排列紊亂，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，大量新生血管(黑色箭頭示)長入，內(nèi)皮細(xì)胞基本未見；治療組(C組和D組)植片未見明顯增厚，膠原纖維排列較規(guī)則，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤等排斥反應(yīng)改變(圖3)。術(shù)后14d，治療組均有炎性細(xì)胞浸潤，新生血管長入，發(fā)生排斥反應(yīng)。排斥后期，植片中的炎性細(xì)胞數(shù)量、水腫及新生血管充盈都較排斥期減輕。

2.5 各組角膜植片超微結(jié)構(gòu)改變 透射電鏡觀察顯示，術(shù)后3d各組角膜各層排列整齊，角膜表層可見短小的微絨毛，上皮、基質(zhì)及內(nèi)皮均未見細(xì)胞凋亡特征(圖4A)，B、C組內(nèi)皮層有少量空泡(圖4B)。術(shù)后10d，A、B組植片上皮細(xì)胞明顯水腫，間隙增寬，基質(zhì)層膠原纖維排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤，可見新生血管，成纖維細(xì)胞核濃縮，核膜不清，內(nèi)皮細(xì)胞大量壞死，可見細(xì)胞凋亡與壞死并存的特征(圖4C、D)；C、D組植片上皮細(xì)胞水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤，基質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞未見水腫、壞死等征象(圖4E)。術(shù)后14d，A、B組膠原纖維增生較術(shù)后10d明顯，排列紊亂(圖4F)；C組部分基質(zhì)層成纖維細(xì)胞體積縮小，胞核固縮，染色質(zhì)邊集，細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)不清，膠原纖維增生、排列稍紊亂(圖4G)；D組基質(zhì)層成纖維細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)欠清晰，膠原纖維少量增生、排列稍紊亂(圖4H)。

圖3 術(shù)后10d角膜植片病理組織學(xué)改變(HE ×200)Fig. 3 Histopathologic image of corneal graft on day 10 after transplantation (HE ×200)

2.6 角膜植片中CD25蛋白及mRNA的表達(dá) 免疫組化染色顯示，術(shù)后3d各組角膜上皮可見少量CD25陽性表達(dá)，基質(zhì)層和內(nèi)皮層未見CD25表達(dá)；術(shù)后7d對照組(A組和B組)角膜上皮及基質(zhì)層有少量CD25表達(dá)；術(shù)后14d對照組角膜各層均可見CD25強(qiáng)陽性表達(dá)，較同時間點(diǎn)治療組(C組和D組)表達(dá)量明顯增多(圖5)。實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，CD25 mRNA表達(dá)水平在術(shù)后逐漸升高，于14d達(dá)到高峰，然后逐漸下降。治療組CD25 mRNA表達(dá)水平與同時間點(diǎn)對照組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖6)。

圖4 各組角膜植片超微結(jié)構(gòu)改變(透射電鏡)Fig. 4 Ultrastructural changes of the corneal grafts (TEM)

3 討 論

正常角膜中無血管和淋巴管，處于相對的“免疫赦免”狀態(tài)。然而，堿燒傷后可誘發(fā)角膜新生血管和新生淋巴管，并在燒傷后2周達(dá)到高峰，從而破壞角膜的“免疫赦免”狀態(tài)[7]，導(dǎo)致高危角膜移植術(shù)的成功率低于35%[8]。因此，抑制免疫排斥反應(yīng)是提高角膜移植成功率的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞尤其是CD4+T細(xì)胞在角膜移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[9]，IL-2和IL-2R是介導(dǎo)其增殖和分化的關(guān)鍵因素。IL-2R由α、β、γ三條鏈組成，靜息的T細(xì)胞表面組成性表達(dá)IL-2R的β和γ鏈，對IL-2親和力低，T細(xì)胞活化后，CD25快速表達(dá)，與β和γ鏈共同形成三聚體，對IL-2有高親和力[10]。CD25的表達(dá)是T細(xì)胞活化和免疫反應(yīng)啟動的重要標(biāo)志[3]。目前CD25抑制免疫排斥反應(yīng)已在肝腎移植中發(fā)揮了重要作用[11]，但其在防治角膜移植免疫排斥方面的報道鮮見。

圖5 各組角膜植片中CD25表達(dá)(IHC ×400)Fig. 5 Expression of CD25 in the corneal graft after transplantation(IHC ×400)

圖6 各組角膜植片中CD25 mRNA的表達(dá)Fig. 6 Expression of CD25 mRNA in the corneal graft after transplantation

siRNA是RNA干擾發(fā)揮效應(yīng)的關(guān)鍵分子，可高效、特異地抑制靶基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默[12]。本課題組為克服前期實(shí)驗采用慢病毒載體[13]毒副作用大的弱點(diǎn)，改用EntransterTM納米載體將siRNA包裹在其中，可阻止核酸酶在體內(nèi)的降解，同時具有緩釋作用，克服了siRNA本身易被降解和吞噬的弱點(diǎn)[14]。同時EntransterTM納米載體在前期大量研究(大鼠腦缺血損傷模型[15]、CVB3感染小鼠模型[16]、小鼠哮喘模型[17])中均表現(xiàn)出安全高效的轉(zhuǎn)染優(yōu)勢。

本研究發(fā)現(xiàn)，CD25siRNA納米粒治療組術(shù)后植片的存活率明顯高于對照組，且CD25siRNA納米粒能夠延緩排斥反應(yīng)的發(fā)生。其原因可能是CD25siRNA納米粒降解了同源CD25 mRNA，使IL-2R無法形成高親和力三聚體，在一定程度上阻斷了T細(xì)胞的活化。組織病理學(xué)檢查也發(fā)現(xiàn)CD25siRNA可使植片中炎性細(xì)胞的浸潤程度明顯減輕，提示CD25的下調(diào)可在一定程度上減輕植片的炎癥反應(yīng)，從而抑制排斥反應(yīng)的發(fā)生。筆者認(rèn)為，CD25siRNA降低CD25(Th1)表達(dá)的同時，上調(diào)了IL-10等因子(Th2)的表達(dá)，而IL-10是重要的細(xì)胞因子合成抑制因子，可抑制促炎細(xì)胞因子的分泌，減輕炎癥反應(yīng)和組織破壞[18]。為探討在角膜排斥反應(yīng)開始發(fā)生時，CD25siRNA再次鞏固治療是否有效，本研究在術(shù)后7d時再次給藥，結(jié)果顯示在植片存活時間和CD25表達(dá)水平上，術(shù)后單次給藥和術(shù)后7d再次給藥兩組差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。這不僅證實(shí)了角膜排斥反應(yīng)早期干預(yù)的必要性和有效性，也揭示了CD25主要在早期參與誘導(dǎo)排斥反應(yīng)的發(fā)生。透射電鏡觀察顯示在C組和D組，治療基因有一過性細(xì)胞毒性，但毒性甚小，表現(xiàn)為術(shù)后3d內(nèi)皮細(xì)胞少量水腫，基質(zhì)細(xì)胞未見水腫，之后恢復(fù)正常。大量研究表明，角膜免疫排斥高峰期有細(xì)胞凋亡與壞死并存的特征[19]，炎性細(xì)胞的浸潤程度也與排斥反應(yīng)程度呈正相關(guān)，本實(shí)驗結(jié)果也證實(shí)了這個觀點(diǎn)。在植片存活期間，成纖維細(xì)胞增生有助于膠原纖維重塑，但膠原纖維排列紊亂會加速植片的免疫排斥。本研究結(jié)果顯示，CD25siRNA納米?？稍诔⒔Y(jié)構(gòu)水平上改變膠原纖維的排列，減少成纖維細(xì)胞的凋亡與壞死，從而延長植片存活時間，術(shù)后7d再次給予基因治療的效果更為確切。

本研究中CD25siRNA納米粒治療雖然可以延長角膜植片的存活時間，但不能完全抑制角膜的免疫排斥反應(yīng)，其原因可能是由于IL-2R中α鏈缺乏，CD25通路被阻斷，β和γ鏈的作用也被放大，β/γ二聚體能通過一些自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)和靜息的T細(xì)胞誘導(dǎo)免疫排斥的發(fā)生，也可能是CD25的下調(diào)在抑制Th1因子的同時也促進(jìn)了Th2因子的表達(dá)所致。而有研究表明同時抑制Th1、Th2因子更能延長角膜植片的存活時間[20]。因此，如何更好地抑制角膜移植后的免疫排斥反應(yīng)，尚需進(jìn)一步深入研究。

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An experimental study on inhibiting graft rejection following high-risk penetrating keratoplasty by CD25 siRNA nanocarrier in rats

SHI Yun-jie, QIN Qin, ZHAO Min*
Department of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
*

, E-mail: minzhao8866@163.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81170822)

ObjectiveTo investigate the effects of CD25 siRNA nanoparticles against immune rejection and prolongation of corneal graft survival time after high-risk corneal grafting in rats.MethodsOrthotopic corneal transplantation was performed in SD rats with alkali burned corneas to mimic high-risk rat models. Donor cornea (Wistar rats) was grafted into the right cornea of SD recipients on day 14 after alkali burn. The grafted rats were randomly divided into control group (Group A), EntransterTM-control CD25siRNA instillation treatment (Group B), EntransterTM-CD25siRNA instillation treatment (Group C) and EntransterTMCD25siRNA twice instillation treatment (Group D, first administration at 2-hour post-surgery and second on day 7 post-surgery). The recipient eyes were examined using a slit lamp microscope. Then, the mean survival time and rejection index (RI) were calculated. The morphologies of grafts were microscopically examined with HE staining, and TEM. CD25 expression after operation was determined by quantitative RT-PCR and immunohistochemistry.ResultsThe survival curves of transplanted cornea showed that the mean survival time in rats of groups C and D was significantly longer than that in groups A and B (P<0.05). No significant difference was found in survival time between group A and group B, and the same between group C and group D. The grafts in groups A and B showed obvious edema and thickening, with irregular arrangement of collagen fibers and infiltration of a large amount of inflammatory cells. Immunohistochemical results showed that expression of CD25 was found in the corneal epithelium, stroma and endothelium in all rats, and higher CD25 expression was observed in groups A and B. Transmission electron microscopy revealed that the degree of stromal fibroblast apoptosis and necrosis in corneal graft was obviously lower in groups C and D thanthat of groups A and B, with a significant statistical difference. The expression of CD25 mRNA in the experimental group was significantly lower at every single time points.ConclusionsCD25siRNA gene transfer could successfully down-regulate CD25 expression, inhibit graft rejection and prolong the survival time of allogeneic corneal graft.

corneal transplantation; graft rejection; nanostructures; interleukin-2 receptor alpha subunit

R772.2

A

0577-7402(2015)04-0297-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.04.09

2014-11-12；

2015-01-05)

(責(zé)任編輯：李恩江)

國家自然科學(xué)基金(81170822)

石韻潔，碩士研究生。主要從事角膜病及眼表疾病的基礎(chǔ)與臨床研究

400016 重慶 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科(石韻潔、秦琴、趙敏)

趙敏，E-mail：minzhao2002@163.com