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    To ll樣受體5激動(dòng)劑CBLB502對(duì)7.0Gy 60Co γ射線照射恒河猴的輻射防護(hù)作用觀察

    2015-03-02 05:27:48申星熊?chē)?guó)林謝玲郭玲玲李明趙艷芳王磊洪劍楊萌趙黎彭瑞云王勇楊曉明羅慶良余祖胤葛常輝邢爽
    解放軍醫(yī)學(xué)雜志 2015年4期
    關(guān)鍵詞:恒河對(duì)癥存活

    申星,熊?chē)?guó)林,謝玲,郭玲玲,李明,趙艷芳,王磊,洪劍,楊萌,趙黎,彭瑞云,王勇,楊曉明,羅慶良,余祖胤,葛常輝,邢爽

    近年來(lái),To ll樣受體(To ll-like recep to r,TLR)信號(hào)通路的調(diào)控已成為研究熱點(diǎn)[1],目前已研發(fā)出多種TLR激動(dòng)劑用于抗感染、抗腫瘤以及治療自身免疫性疾病[2]?;诖碳LR、調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號(hào)通路發(fā)揮抗輻射損傷作用的研究發(fā)現(xiàn)了一系列新的輻射防護(hù)劑[3-5],其中以TLR5激動(dòng)劑的作用最強(qiáng),能同時(shí)防護(hù)骨髓和腸道的輻射損傷,對(duì)重度以上骨髓型放射病有較好的輻射防護(hù)作用[5]。TLR5廣泛表達(dá)于樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及腸黏膜固有層內(nèi)皮細(xì)胞的表面,能夠被細(xì)菌鞭毛蛋白或其衍生物CBLB502識(shí)別,并激活NF-κB信號(hào)通路,從而抑制細(xì)胞凋亡、抵抗機(jī)體氧化損傷[6]。CBLB502是經(jīng)過(guò)改構(gòu)的鞭毛蛋白衍生物,高效且免疫原性低,研究表明其對(duì)致死劑量照射的小鼠和獼猴均有顯著的保護(hù)作用[5,7-8]。為進(jìn)一步探索CBLB502的輻射防護(hù)作用,本研究以恒河猴為模型動(dòng)物,采用輻射防護(hù)效果較好的WR-2721(氨磷汀,阿米福汀)[9]作為陽(yáng)性對(duì)照藥物,觀察了不同劑量CBLB502對(duì)7.0Gy60Co γ射線全身照射恒河猴的防護(hù)作用,旨在為CBLB502的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只健康成年恒河猴購(gòu)自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所,雌雄各半,體重5.0±1.0kg[動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK-(京)2005-0005]。動(dòng)物飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心普通級(jí)猴實(shí)驗(yàn)室內(nèi),24h負(fù)壓通風(fēng)換氣,室溫18~24℃,相對(duì)濕度40%~70%,10h日光燈照明,14h黑暗,每天沖洗清潔籠具2次。動(dòng)物到達(dá)后單籠單養(yǎng),除飼以軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心配制的猴用標(biāo)準(zhǔn)飼料外,適當(dāng)給予新鮮水果蔬菜等加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng),消毒涼水置籠內(nèi)自由飲用。動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施合格證號(hào):SYXK-(軍)2007-004。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求執(zhí)行。

    1.2 分組 依據(jù)性別、體重和外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)將入選的30只恒河猴分為對(duì)癥治療組、WR-2721組和CBLB502 2.5、10、40μg/kg組,每組6只。此外,預(yù)備3只體重為6~12kg的健康成年恒河猴用作對(duì)癥治療中輸血時(shí)的供血猴。

    1.3 給藥方法 CBLB502注射液由北京放射醫(yī)學(xué)研究所研制,批號(hào)20100613,4.0m g/支(1.0m l),為無(wú)色澄明水溶液。WR-2721由大連美羅大藥廠生產(chǎn),白色凍干粉劑,400m g/瓶,批號(hào)53090902。不同劑量CBLB502和WR-2721均于照射前0.5h一次肌肉注射,對(duì)癥治療組肌肉注射等體積生理鹽水(0.3m l/kg)。

    1.4 模型制備與對(duì)癥支持治療 采用軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所的60Co γ射線放射源,照射前10m in用3%戊巴比妥鈉(30m g/kg)靜脈注射麻醉恒河猴,將麻醉猴固定于特制照射木箱內(nèi)行7.0Gy一次全身雙側(cè)照射,照射距離為4.75m,照射劑量率為13.00~13.52cGy/m in。為防止照射動(dòng)物在觀察期內(nèi)過(guò)早死亡影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,依實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理及福利要求,受試動(dòng)物在相同原則下均給予綜合對(duì)癥治療,主要措施包括抗感染、抗出血、輸血、維持水電解質(zhì)和酸堿平衡、補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)等。腸道滅菌:自照前3d開(kāi)始,給予慶大霉素16萬(wàn)U+甲硝唑0.4g口服,1次/d,連續(xù)3d。預(yù)防感染:動(dòng)物外周血白細(xì)胞數(shù)低于1×109/L時(shí)開(kāi)始使用抗生素(青霉素80萬(wàn)U/d,肌肉注射,頭孢噻肟鈉1.0g/d,靜脈注射),根據(jù)病情及時(shí)調(diào)整、更換,連續(xù)3d外周血白細(xì)胞數(shù)超過(guò)1×109/L時(shí)停藥。條件輸血:動(dòng)物外周血小板(PLT)低于50×109/L時(shí),隔天一次靜脈輸注新鮮全血30m l,輸注前均經(jīng)15Gy60Co γ射線照射。

    1.5 觀察指標(biāo) 觀察照射后動(dòng)物一般體征并檢測(cè)外周血象,取照射后1d的外周血細(xì)胞和照射后39d的骨髓細(xì)胞進(jìn)行造血細(xì)胞集落培養(yǎng)。觀察動(dòng)物存活情況,死亡動(dòng)物即時(shí)解剖、存活動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采用安樂(lè)死方式處死,取胸骨、淋巴結(jié)、小腸進(jìn)行組織病理學(xué)檢查,上述臟器和組織用中性福爾馬林固定,常規(guī)制片、切片和染色后光鏡下觀察。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Orig in Pro 9.0軟件包作圖。計(jì)量資料以±s表示,血小板減少癥持續(xù)時(shí)間和生存率組間差異比較采用Kap lan-Meier檢驗(yàn)。外周血細(xì)胞數(shù)比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析(repeated m easures data of ANOVA),造血細(xì)胞集落數(shù)比較采用單因素方差分析(one-w ay ANOVA),進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)或Dunnett t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 7.0Gy γ射線全身照射猴損傷程度 7.0Gy60Co γ射線全身照射后,各組實(shí)驗(yàn)猴造血功能均嚴(yán)重受損,外周血淋巴細(xì)胞數(shù)迅速下降,照射后48h降至0.5×109/L左右,并于照射后第7天開(kāi)始陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)熱癥狀,最高體溫達(dá)40.4℃,發(fā)熱期間動(dòng)物食欲減退甚至拒食,體重明顯減輕。病程極期,各組實(shí)驗(yàn)猴外周血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血小板數(shù)均明顯減少,發(fā)生血細(xì)胞減少癥。對(duì)癥治療猴于照射后17d開(kāi)始出現(xiàn)死亡,其中4只猴在照射后3周內(nèi)死于嚴(yán)重感染和出血并發(fā)癥,存活時(shí)間為19.4±1.7d,40d時(shí)存活數(shù)僅為2只。對(duì)死亡猴進(jìn)行組織病理學(xué)分析見(jiàn)骨髓腔空虛,廣泛出血,造血細(xì)胞顯著減少;脾臟廣泛出血,紅髓白髓分界不清,淋巴細(xì)胞明顯減少,脾小體結(jié)構(gòu)消失;腸黏膜剝脫、出血,黏膜上皮細(xì)胞嗜酸性變,間質(zhì)細(xì)胞減少,淋巴細(xì)胞固縮等。根據(jù)一般臨床表現(xiàn)、造血損傷程度和存活情況,參考急性放射病的分型分度標(biāo)準(zhǔn)[10],本實(shí)驗(yàn)條件下,7.0Gy γ射線全身照射猴發(fā)生了重度骨髓型急性放射病。

    2.2 CBLB502對(duì)7.0Gy γ射線照射猴存活和體征的影響 7.0Gy60Co γ射線照射后各組實(shí)驗(yàn)猴均出現(xiàn)發(fā)熱癥狀,體重呈下降趨勢(shì)。CBLB502 2.5、10、40μg/kg組發(fā)熱動(dòng)物數(shù)少于對(duì)癥治療組,除其中1只實(shí)驗(yàn)猴在照射后36d死于皰疹病毒引發(fā)的感染外,其他動(dòng)物全部存活。WR-2721組照射后17d因外周血小板嚴(yán)重減少死亡1只,對(duì)癥治療組照射后40d內(nèi)死亡4只,死亡動(dòng)物存活時(shí)間為19.4±1.7d(表1)。該結(jié)果表明,照射前0.5h單次肌肉注射CBLB502可明顯提高7.0Gy γ射線全身照射所致重度急性放射病實(shí)驗(yàn)猴的存活率,改善其生存質(zhì)量。

    表1 7.0Gy γ射線全身照射恒河猴體征及存活情況(n=6)Tab. 1 Signs and survival of Rhesus monkey irradiated with 7.0Gy γ-ray (n=6)

    2.3 CBLB502對(duì)7.0Gy γ射線照射猴外周血小板數(shù)的影響 CBLB502治療組血小板數(shù)在照射后早期有一過(guò)性下降,在照射后2~7d明顯低于對(duì)癥治療組(P<0.05),各組照射猴外周血小板數(shù)自照射后第5天開(kāi)始急劇下降,第13~15天達(dá)最低值,CBLB502 10μg/kg和40μg/kg組最低值明顯高于對(duì)癥治療組(P<0.05,表2),CBLB502 40μg/kg組血小板減少和缺乏(血小板數(shù)<50×109/L,為臨床輸血指征)持續(xù)時(shí)間明顯低于CBLB502 2.5μg/kg組和WR-2721組(P<0.05,表3)。WR-2721組血小板數(shù)變化趨勢(shì)與

    表2 CBLB502對(duì)7.0Gy γ射線照射恒河猴外周血細(xì)胞數(shù)最低值的影響(×109/L,±s)Tab. 2 Effects of CBLB502 on peripheral b lood nad irs of Rhesus monkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (×109/L, ±s)

    表2 CBLB502對(duì)7.0Gy γ射線照射恒河猴外周血細(xì)胞數(shù)最低值的影響(×109/L,±s)Tab. 2 Effects of CBLB502 on peripheral b lood nad irs of Rhesus monkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (×109/L, ±s)

    (1)P<0.05 com pared with IR group; (2)P<0.05 com pared with WR-2721 group. PLT. Platelets; WBC. White b lood cells; NEUT. Neutrophil;LYM. Lym phocytes

    Hem ocyte IR WR-2721 CBLB502 (μg/kg)2.5 10 40 PLT 14.7±9.4 28.8±9.3 33.6±8.9 47.5±13.0(1) 53.7±38.2(1)WBC 0.2±0.1 0.4±0.1 0.4±0.2 0.6±0.2(1) 0.8±0.7(1)NEUT 0.01±0.01 0.03±0.03 0.02±0.02 0.09±0.07 0.13±0.15(1)(2)LYM 0.19±0.14 0.31±0.10 0.15±0.03(2) 0.33±0.10(1) 0.25±0.12

    表3 CBLB502對(duì)7.0Gy γ射線照射恒河猴外周血血小板數(shù)的影響(±s)Tab. 3 Effects of CBLB502 on peripheral blood p latelet count of Rhesus monkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (±s)

    表3 CBLB502對(duì)7.0Gy γ射線照射恒河猴外周血血小板數(shù)的影響(±s)Tab. 3 Effects of CBLB502 on peripheral blood p latelet count of Rhesus monkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (±s)

    (1)P<0.05 com pared with WR-2721 group; (2)P<0.05 com pared with CBLB502 2.5μg/kg g roup. Recovery initiation tim e w as the tim e point when PLT>100×109/L began to occur. Since 4/6 Rhesus monkeys in the IR group died during the crisis period, the duration of the PLT nad ir w as no t ca lcu lated.

    Group Du ration of PLT nad ir (d)PLT recovery in itiation (d)<100×109/L <50×109/L WR-2721 5.4±1.3 3.2±1.3 20.2±2.3 CBLB502 2.5μg/kg 12.2±5.8(1)4.8±3.9 21.0±2.0 CBLB502 10μg/kg 5.0±4.0(1)1.3±1.9(1)(2) 21.3±8.7 CBLB502 40μg/kg 3.8±2.8(1)1.3±1.6(1)(2) 15.5±8.3

    CBLB502 2.5μg/kg組相似,恢復(fù)稍快于對(duì)癥治療組。照射后39d各組血小板數(shù)相當(dāng),達(dá)照射前水平的56%~76%(圖1A)。

    2.4 CBLB502對(duì)7.0Gy γ射線照射猴外周血白細(xì)胞數(shù)的影響 CBLB502 10μg/kg和40μg/kg組照射猴外周血白細(xì)胞數(shù)最低值均明顯高于對(duì)癥治療組(P<0.05,表2),且開(kāi)始恢復(fù)時(shí)間提前(圖1B)。CBLB502 40μg/kg組白細(xì)胞數(shù)在照射后13d明顯高于WR-2721組和對(duì)癥治療組(P<0.05),15~17d明顯高于對(duì)癥治療組(P<0.01),其白細(xì)胞數(shù)減少和缺乏(白細(xì)胞數(shù)<1.0×109/L)持續(xù)時(shí)間明顯低于CBLB502 2.5μg/kg組和對(duì)癥治療組(P<0.05,表4,圖1B)。中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)變化趨勢(shì)(圖1C、D)與白細(xì)胞基本一致,CBLB502 40μg/kg組照射后15d

    表4 CBLB502對(duì)7.0Gy γ射線全身照射恒河猴外周血白細(xì)胞的影響(±s)Tab. 4 Effects of CBLB502 on peripheral b lood WBC count of Rhesus m onkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (±s)

    表4 CBLB502對(duì)7.0Gy γ射線全身照射恒河猴外周血白細(xì)胞的影響(±s)Tab. 4 Effects of CBLB502 on peripheral b lood WBC count of Rhesus m onkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (±s)

    Group Du ration of WBC nad ir (d)WBC recovery in itiation (d)<2.0×109/L <1.0×109/L WR-2721 16.2±3.1 12.0±3.2 21.4±2.6 CBLB502 2.5μg/kg 17.8±2.6 12.8±3.3 22.6±2.2 CBLB502 10μg/kg 16.3±3.3 10.5±5.2 21.0±2.8 CBLB502 40μg/kg 12.5±6.4(1) 7.0±5.8(1)(2) 20.0±2.8

    (1)P<0.05 com pared with WR-2721 group; (2)P<0.05 com pared with CBLB502 2.5μg/kg group. Recovery initiation tim e was the tim e point when WBC>2.0×109/L began to occur. Since 4/6 Rhesus monkeys in IR group died during crisis period, duration of WBC nadir w as no t ca lcu lated中性粒細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)癥治療組和WR-2721組(P<0.05),CBLB502 40和10μg/kg組照后各時(shí)間點(diǎn)的淋巴細(xì)胞絕對(duì)值相當(dāng),且在照射后17d均明顯高于對(duì)癥治療組(P<0.01,P<0.05)。該結(jié)果提示,照射前0.5h單次肌肉注射CBLB502可促進(jìn)7.0Gy γ射線全身照射恒河猴外周血白細(xì)胞數(shù)恢復(fù),以40μg/kg組效果最佳,其療效優(yōu)于WR-2721。

    圖1 CBLB502對(duì)7.0Gy γ射線全身照射恒河猴外周血細(xì)胞數(shù)的影響Fig. 1 Effect of CBLB502 on peripheral b lood cells coun t of the Rhesus monkeys irrad iated with 7.0Gy γ-ray A. Plate let; B. Leucocyte; C. Neu troph il; D. Lym phocyte; E. Eryth rocyte; F. Reticu locyte

    2.5 CBLB502對(duì)7.0Gy γ射線照射猴外周血紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞(RET)數(shù)的影響 恒河猴外周血紅細(xì)胞數(shù)在照射后緩慢下降,極期時(shí)CBLB502 10、40μg/kg組紅細(xì)胞數(shù)較其他各組略低(圖1E)。外周血中RET數(shù)可以間接反映受照射機(jī)體造血功能損傷程度及恢復(fù)情況,檢測(cè)結(jié)果表明:7.0Gy γ射線照射后9 d內(nèi)各組RET絕對(duì)值無(wú)明顯差異,對(duì)癥治療組RET低值持續(xù)至第21天才開(kāi)始逐漸恢復(fù),而CBLB502治療組外周血RET于照射后9~15d有小幅升高且高于同期對(duì)癥治療組,第15天后CBLB502 2.5μg/kg組與對(duì)癥治療組恢復(fù)速度相當(dāng),但CBLB502 10、40μg/kg組迅速上升并明顯高于同期CBLB502 2.5μg/kg組、對(duì)癥治療組及WR-2721組(P<0.05,圖1F)。該結(jié)果提示,照射前0.5h單次肌肉注射CBLB502可加速7.0Gy γ射線全身照射恒河猴造血功能的恢復(fù)。

    2.6 CBLB502對(duì)7.0Gy γ射線照射猴骨髓和外周血造血細(xì)胞集落形成的影響 照射后1d外周血造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)結(jié)果顯示,CBLB502治療組巨核細(xì)胞集落形成單位(co lonyform ing unit-m egakaryocyte,CFU-MK)、紅系爆式集落形成單位(bu rst-fo rm ing un it-eryth roid,BFU-E)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成單位(colonyform ing unit-granulocyte m acrophage,CFU-GM)集落數(shù)均有所增加,但是受樣本數(shù)量所限,僅CBLB502 2.5μg/kg組CFU-GM集落數(shù)優(yōu)于對(duì)癥治療組、WR-2721組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表5)。第39天骨髓造血集落培養(yǎng)結(jié)果顯示,各組集落生成數(shù)相當(dāng),提示此時(shí)存活照射猴的造血損傷均已得到恢復(fù)(表6)。

    表5 7.0Gy γ射線照射后1d各組外周血細(xì)胞集落形成單位數(shù)(/2×104單個(gè)核細(xì)胞,±s)Tab. 5 Colony counting in peripheral b lood of the anim als 1-day after radiation with 7.0Gy γ-ray (/2×104 m ononuclear cells, ±s)

    表5 7.0Gy γ射線照射后1d各組外周血細(xì)胞集落形成單位數(shù)(/2×104單個(gè)核細(xì)胞,±s)Tab. 5 Colony counting in peripheral b lood of the anim als 1-day after radiation with 7.0Gy γ-ray (/2×104 m ononuclear cells, ±s)

    CFU-MK. Co lony form ing unit-m egakaryocyte; BFU-E. Burstform ing unit-erythroid; CFU-E. Colony form ing unit erythroid; CFU-GM.Colony form ing unit-granulocyte m acrophage; CFU-M ix. M ixed colonyfo rm ing unit. (1)P<0.05 com pared with CBLB502 2.5μg/kg g roup

    Group CFU-MK BFU-E CFU-E CFU-GM CFU-M ix IR 0.6±0.90.5±1.00.1±0.3 4.1±2.8(1)0.1±0.3 WR-2721 0.3±0.40.8±0.9 0.0 5.8±2.8(1) 0.0 CBLB502 2.5μg/kg 1.4±0.70.4±0.40.5±0.9 14.8±6.7 0.5±0.4 CBLB502 10μg/kg 2.0±2.02.9±3.9 0.0 7.2±4.1(1) 0.0 CBLB502 40μg/kg 1.1±0.33.3±3.3 0.0 9.1±5.2 0.6±0.9

    2.7 CBLB502對(duì)7.0Gy γ射線全身照射恒河猴對(duì)癥治療的影響 統(tǒng)計(jì)各組動(dòng)物接受對(duì)癥治療的用藥情況發(fā)現(xiàn),CBLB502 40μg/kg組有2只動(dòng)物照射后外周血小板數(shù)一直>100×109/L,不需輸血或接受止血藥治療,另4只動(dòng)物接受止血藥治療時(shí)間較WR-2721組明顯縮短(P<0.05),且輸血量較WR-2721組及CBLB502 2.5μg/kg組明顯減少(P<0.05,表7)。該結(jié)果提示,照射前0.5h單次肌肉注射40μg/kg CBLB502可明顯縮短7.0Gy γ射線全身照射恒河猴接受抗生素和止血藥治療的時(shí)間并減少輸血量。

    2.8 各組7.0Gy照射猴組織病理學(xué)改變 組織病理學(xué)觀察顯示,照射前0.5h單次肌肉注射CBLB502可明顯減輕7.0Gy60Co γ射線全身照射后骨髓、腸道、腸系膜淋巴結(jié)等組織的損傷,其中CBLB502 10μg/kg和40μg/kg組的改善作用更為突出,主要表現(xiàn)為骨髓、腸道、腸系膜淋巴結(jié)組織結(jié)構(gòu)良好,細(xì)胞數(shù)量增加,血管淤血、出血減輕或消失。

    表6 7.0Gy γ射線照射后39d各組骨髓血細(xì)胞集落形成單位數(shù)(/2×104單個(gè)核細(xì)胞,±s)Tab. 6 Colony counting in bone m arrow of the anim als 39 days after radiation with 7.0Gy γ-ray (/2×104 mononuclear cells, ±s)

    表6 7.0Gy γ射線照射后39d各組骨髓血細(xì)胞集落形成單位數(shù)(/2×104單個(gè)核細(xì)胞,±s)Tab. 6 Colony counting in bone m arrow of the anim als 39 days after radiation with 7.0Gy γ-ray (/2×104 mononuclear cells, ±s)

    CFU-MK. Colony form ing unit-m egakaryocyte; BFU-E. Burstform ing unit-erythroid; CFU-E. Co lony form ing unit erythroid; CFUGM. Colony form ing unit-granulocyte m acrophage; CFU-M ix. M ixed co lony-form ing unit. Since 4/6 Rhesus monkeys from IR group died during crisis period, colony counting was not done to bone m arrow

    Group CFU-MK BFU-E CFU-E CFU-GM CFU-M ix WR-2721 8.9±2.814.2±1.95.6±1.994.8±16.05.2±3.1 CBLB502 10μg/kg9.1±1.613.5±1.53.8±1.2102.6±3.72.4±0.4 CBLB502 10μg/kg7.2±1.514.8±3.44.9±1.792.5±13.64.5±2.1 CBLB502 40μg/kg6.5±1.514.1±5.73.9±1.682.4±14.23.6±1.7

    表7 各組對(duì)癥治療情況(±s)Tab. 7 Sym p tom atic therap ies of experim en tal g roup s (±s)

    表7 各組對(duì)癥治療情況(±s)Tab. 7 Sym p tom atic therap ies of experim en tal g roup s (±s)

    (1)P<0.05 com pared with WR-2721 group; (2)P<0.05 com pared with CBLB502 2.5μg/kg group. Since 4/6 Rhesus monkeys from IR group died du ring crisis period, sym p tom atic therapy du ration w as no t calcu lated

    Item WR-2721 CBLB502 (μg/kg)2.5 10 40 An tibio tics treatm en t du ration (d) 20.2±2.6 20.6±4.2 19.3±3.1 20.3±4.6 Hem ostatic treatm ent duration (d) 8.3±3.0 9.6±2.9 6.7±4.2 4.3±3.7(1)To ta l transfusion vo lum e (m l) 95.0±22.6 75.0±33.2 20.0±15.5(1)(2) 37.5±56.8(1)(2)

    骨髓:對(duì)癥治療組4只恒河猴在21d內(nèi)死亡,組織病理學(xué)觀察見(jiàn)骨髓腔空虛,廣泛出血,造血細(xì)胞顯著減少,殘留的造血細(xì)胞以成熟細(xì)胞為主,胞核固縮,并見(jiàn)大量含鐵血黃素沉積(圖2A)。WR-2721組可見(jiàn)骨髓腔少量出血,造血細(xì)胞增生,以粒細(xì)胞為主,其結(jié)構(gòu)損傷較對(duì)癥治療組有所改善(圖2B)。CBLB502 40μg/kg組骨髓均見(jiàn)造血細(xì)胞增生活躍,形態(tài)良好,核分裂象多見(jiàn),出血減少(圖2C)。該結(jié)果提示,CBLB502預(yù)防給藥對(duì)7.0Gy γ射線全身照射猴的骨髓組織有明顯保護(hù)作用。

    腸道:對(duì)癥治療組恒河猴腸黏膜脫落、出血,腸腔散在細(xì)胞碎片,黏膜上皮細(xì)胞可見(jiàn)嗜酸性變,間質(zhì)細(xì)胞減少,淋巴細(xì)胞固縮,隱窩未見(jiàn)明顯增生(圖3A)。WR-2721組存活猴腸上皮排列整齊、結(jié)構(gòu)完整,隱窩和淋巴細(xì)胞增生,有少量出血,其結(jié)構(gòu)損傷較對(duì)癥治療組減輕(圖3B)。CBLB502 40μg/kg組恒河猴腸黏膜上皮細(xì)胞排列整齊,隱窩明顯增生,淋巴細(xì)胞數(shù)目增加,間質(zhì)細(xì)胞豐富、形態(tài)正常(圖3C),其結(jié)構(gòu)損傷較對(duì)癥治療組和WR-2721組明顯改善。

    圖2 7.0Gy照射猴骨髓病理組織學(xué)觀察(HE ×400)Fig. 2 Histopatho logical observation of bone m arrow of Rhesus m onkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (HE ×400)A. Anim al in IR g roup and d ied on 21d; B. Anim al in WR-2721 g roup; C. Anim al in CBLB502 40μg/kg g roup

    圖3 7.0Gy照射猴小腸病理組織學(xué)觀察(HE ×200)Fig. 3 Histopatho log ical observation of sm all in testine of Rhesus m onkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (HE ×200)A. An im a l in IR g roup and d ied on 21d; B. An im a l in WR-2721 g roup; C. Anim a l in CBLB502 40μg/kg g roup

    腸系膜淋巴結(jié):對(duì)癥治療組腸系膜淋巴結(jié)皮質(zhì)變薄,皮髓分界不清,淋巴細(xì)胞顯著減少,核固縮、溶解,可見(jiàn)含鐵血黃素沉積(圖4A)。WR-2721組腸系膜淋巴結(jié)皮髓質(zhì)可見(jiàn)少量淤血、出血,淋巴細(xì)胞壞死和增生并存,可見(jiàn)核碎片和核分裂結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)損傷較對(duì)癥治療組有所改善(圖4B)。CBLB502 40μg/kg組恒河猴腸系膜淋巴結(jié)出血減少,皮髓質(zhì)分界清晰,淋巴細(xì)胞增生活躍(圖4C),其結(jié)構(gòu)損傷較對(duì)癥治療組和WR-2721組明顯改善。

    圖4 7.0Gy照射猴腸系膜淋巴結(jié)病理組織學(xué)觀察(HE ×200)Fig. 4 Histopathological observation of m esenteric lym ph node of Rhesus monkey irradiated with 7.0Gy γ-ray (HE ×200)A. Anim al in IR g roup and d ied on 21d; B. Anim al in WR-2721 g roup; C. Anim al in CBLB502 40μg/kg g roup

    3 討 論

    本研究以7.0Gy60Co γ射線全身照射恒河猴為模型動(dòng)物,觀察了CBLB502對(duì)重度骨髓型急性放射病的防護(hù)效果。對(duì)動(dòng)物體征、存活率與存活時(shí)間、造血功能的損傷與重建、非造血器官及組織的損傷和修復(fù)等方面進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn):7.0Gy γ射線全身照射后,對(duì)癥治療組恒河猴在3周內(nèi)死亡4只,死亡動(dòng)物存活時(shí)間為19.4±1.7d;所有動(dòng)物均出現(xiàn)不同程度的發(fā)熱,體溫最高達(dá)40.4℃;照射前0.5h單次肌肉注射CBLB502可明顯提高動(dòng)物活存率,其中2.5μg/kg CBLB502提高存活的效果與30m g/kg WR-2721相同(均存活5/6);CBLB502 10、40μg/kg組恒河猴全部存活,發(fā)熱動(dòng)物數(shù)減少,體重下降幅度較對(duì)癥治療組有所改善。照前0.5h單次肌肉注射2.5、10、40μg/kg CBLB502均可明顯促進(jìn)7.0Gy γ射線全身照射恒河猴造血功能恢復(fù),升高外周血白細(xì)胞、血小板和中性粒細(xì)胞數(shù)的最低值,縮短外周血細(xì)胞數(shù)最低值持續(xù)時(shí)間并使其開(kāi)始恢復(fù)時(shí)間提前。此外,CBLB502可明顯減輕7.0Gy60Co γ射線照射后骨髓、淋巴結(jié)和腸道等主要造血、免疫和消化器官的組織損傷。照射后39d骨髓造血細(xì)胞集落培養(yǎng)并未觀察到CBLB502可促進(jìn)造血細(xì)胞集落的生成,可能是因?yàn)楣撬铇颖静杉瘯r(shí)間較晚,此時(shí)各組動(dòng)物的造血功能均已恢復(fù)正常。本研究結(jié)果顯示,抗輻射損傷作用以CBLB502 40μg/kg組最佳,10μg/kg CBLB502仍具有較好的輻射防護(hù)效果;經(jīng)比較發(fā)現(xiàn),照前0.5h單次肌肉注射40μg/kg CBLB502對(duì)7.0Gy γ射線全身照射恒河猴的輻射防護(hù)作用明顯優(yōu)于國(guó)際公認(rèn)的輻射防護(hù)劑WR-2721(照前0.5h單次肌內(nèi)注射30m g/kg)。

    TLR是最先被發(fā)現(xiàn)的模式識(shí)別受體,在人類(lèi)固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用[11-12],迄今為止在人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)其11個(gè)家族成員,且不同的TLR有其相應(yīng)的配體。目前研究發(fā)現(xiàn),TLR2/6、TLR5以及TLR9的激動(dòng)劑均能發(fā)揮輻射防護(hù)作用[2-5],其中細(xì)菌鞭毛蛋白是TLR 5已知的唯一配體。CBLB502是利用大腸埃希菌制備的重組蛋白,包含了沙門(mén)菌鞭毛蛋白完整的N末端和C末端保守的結(jié)構(gòu)域,不但可在常溫下長(zhǎng)時(shí)間保存而不喪失藥物活性,而且與鞭毛蛋白具有同樣的穩(wěn)定性,毒性和免疫原性卻大為較低[5]。利用TLR5基因敲除小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),CBLB502可通過(guò)TLR5依賴途徑激活NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮輻射防護(hù)效應(yīng),其具體機(jī)制包括:①誘導(dǎo)IAP、Bc l-2表達(dá),抑制輻射所致的細(xì)胞凋亡;②誘導(dǎo)超氧化物歧化酶2的表達(dá),促進(jìn)機(jī)體清除氧自由基;③誘導(dǎo)多種具有輻射防護(hù)作用的細(xì)胞因子如G-CSF和IL-6的表達(dá),刺激白細(xì)胞和血小板的生成[5]。此外,不同于造血刺激生長(zhǎng)因子類(lèi)輻射防護(hù)劑,CBLB502在保護(hù)造血系統(tǒng)的同時(shí),還對(duì)消化系統(tǒng)有明確的輻射防護(hù)作用。目前,CBLB502的抗氧化損傷作用已在小鼠腎臟缺血再灌注損傷研究中得到證實(shí)[13]。由于對(duì)放射性腸道上皮損傷有顯著的治療作用,CBLB502也被用于頭頸部放療所致的皮炎及口腔黏膜炎的實(shí)驗(yàn)治療,可減輕輻射所致的上皮細(xì)胞損傷,且不降低腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性[14]。值得關(guān)注的是,有報(bào)道稱(chēng)CBLB502對(duì)放射性間質(zhì)性肺炎和肺纖維化也有明顯的預(yù)防作用[15]。相信隨著研究的不斷深入,CBLB502作為安全、有效的新型輻射防護(hù)劑,可擁有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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