補腎抗癌方對TAM誘導的小鼠Lewis肺癌中VEGF表達影響

趙慶香　鄧海濱　吳　繼　王中奇

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·基礎(chǔ)研究·

補腎抗癌方對TAM誘導的小鼠Lewis肺癌中VEGF表達影響

趙慶香鄧海濱吳繼王中奇

【摘要】目的探討補腎抗癌方對不同活化表型的腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)誘導的肺腺癌小鼠移植瘤模型中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達的影響。方法構(gòu)建不同活化表型TAM的肺腺癌小鼠移植瘤模型，將50只C57BL/6J小鼠隨機分成5組：空白組；TAM模型對照組；TAM中藥組；活化TAM模型對照組；活化TAM中藥組。于接種后給予相應藥物干預，第21天處死各組小鼠，剝離皮下腫瘤，流式細胞儀檢測TAM的數(shù)量；采用免疫組織化學法檢測小鼠皮下移植瘤組織中VEGF表達。結(jié)果在建模第21天，各中藥組小鼠移植瘤體積明顯小于各模型對照組，TAM模型對照組小鼠移植瘤體積明顯小于活化TAM模型對照組，各中藥組小鼠移植瘤組織中CD206表達水平顯著低于各模型對照組，各中藥組小鼠移植瘤組織中VEGF表達水平低于各模型對照組。結(jié)論補腎抗癌方可能通過抑制TAM和VEGF表達從而達到抗腫瘤的效果。

【關(guān)鍵詞】補腎抗癌中藥；腫瘤相關(guān)巨噬細胞；血管內(nèi)皮生長因子

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:0001～0005)

腫瘤相關(guān)巨噬細胞是外周血單核細胞浸潤到實體腫瘤組織中演變成的巨噬細胞，在腫瘤基質(zhì)細胞中占很大的比例，是機體抗腫瘤免疫中重要的效應細胞，其在腫瘤免疫中的作用日益受到人們的重視。TAM根據(jù)活化狀態(tài)和發(fā)揮的功能多表現(xiàn)為M1和M2型，M2型巨噬細胞在IL-4、IL-13等刺激下抑制T細胞增生，促進腫瘤的增生、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移。M2型巨噬細胞更有助于腫瘤的生長發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移，與VEGF關(guān)系密切。肺腺癌惡性程度高，進展快，轉(zhuǎn)移早，預后不良，補腎抗癌方在臨床中應用廣泛并取得良好療效，在文獻研究方面補腎抗癌方有一定理論基礎(chǔ)[1]，研究表明其對多種腫瘤有抑制作用，近年來其抗腫瘤作用逐漸受到矚目。

1材料與方法

1.1實驗材料

小鼠Lewis肺癌細胞株由龍華醫(yī)院腫瘤研究所實驗室提供，腫瘤相關(guān)巨噬細胞選用小鼠巨噬細胞系RAW264.7原代細胞株，購于中國科學院細胞庫。雌性C57BL/6小鼠，共50只，4～6周齡，體重(18.0±2)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號碼為SCXK(滬)：2012-0002。清潔級，室溫25℃，自由進食與飲水，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學龍華醫(yī)院實驗動物部。

1.2藥物

補腎抗癌中藥方由十位中藥組成：巴戟天、肉蓯蓉、淫羊藿、黃精、女貞子、山茱萸、白花蛇舌草、蚤休、守宮、蟾皮。諸藥并用大補腎陰腎陽，解毒抗癌以治療肺癌，以上中藥均由上海中醫(yī)藥大學龍華醫(yī)院制劑室按水煎醇沉工藝制備，水浴濃縮至生藥含量為1 g/ml，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3主要試劑

IL-4購于加拿大Biobasic Inc公司，大鼠抗小鼠CD206抗體、FITC標記的羊抗兔IgG購于美國BioLegend公司，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(streptavidin-biotin peroxidase method，S-P)試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司，血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)一抗(兔抗鼠，按1∶50稀釋)購于美國proteintech group公司，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶均購自杭州四季青生物工程科技有限公司。

1.4主要儀器

層流超凈臺(SW-CJ-2D)(蘇州凈化公司)；熒光倒置顯微鏡(DMI3000B)和免疫組化顯微鏡(德國Leica公司)；CO2培養(yǎng)箱(MCO-20AIC)(日本SANYO公司)；酶標儀(Spectra Max M5)(美國MD公司)；流式細胞儀(FACSVerse)(美國BD公司)；臺式高速冷凍離心機(5430R)(德國Eppendorf公司)。

1.5Lewis肺癌細胞株和RAW264.7細胞株的培養(yǎng)

1.5.1細胞培養(yǎng)小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞和小鼠肺腺癌細胞Lewis細胞，均用含10%胎牛血清及100 U/mL青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.5.2RAW264.7細胞的活化取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，以2×106個/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，以IL-4(終濃度10 IU/ml)處理[3]，取重組鼠IL-4先離心，然后選取PBS溶液溶解，加入含有血清DMEM培養(yǎng)基中，以終濃度10 IU/ml加入已經(jīng)貼壁的細胞培養(yǎng)板中，24～48 h后即可建立起替代活化性模型。

1.5.3RAW264.7細胞的活化鑒定取生長旺盛、處于對數(shù)生長期的上述活化完成的RAW264.7巨噬細胞，棄去培養(yǎng)液，加入PBS液洗滌細胞2次，加入0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化并離心，棄上清液后再用100 μl PBS重懸細胞，制成1×106cells/L的細胞懸液，將其分裝至1.5 ml的EP管內(nèi)后，加入1 μgFITC標記的抗小鼠CD206抗體，4℃共育30 min，用PBS洗去游離的抗體，應用0.3 ml PBS重懸后用流式細胞儀FACS Calibur(BD，USA)檢測巨噬細胞表面CD206表達。以FITC標記的抗小鼠IgG2b同型抗體作為陰性對照，以未與抗體作用的巨噬細胞作為空白對照。

1.6小鼠皮下移植瘤模型建立

實驗先將小鼠隨機分為5組：空白組；TAM模型對照組；TAM中藥組；活化TAM模型對照組；活化TAM中藥組。將上述未活化巨噬細胞RAW264.7和活化好的RAW264.7細胞分別與LLC(Lewis lung cancer)細胞以3∶1混合后(分別為3×107個/ml和1×107個/ml，共0.2 ml細胞懸液)注射至C57BL/6小鼠頸部背側(cè)皮下，即可建立皮下移植瘤模型，當腫瘤大小超過2 mm×2 mm時，判斷為模型建立成功。第2天給予藥物干預，第21天脫臼處死小鼠，剝離移植瘤和肺組織，取部分組織以石蠟包埋，行免疫組組織化學法檢測。

1.7動物分組與給藥方法

空白組正常飼養(yǎng)，TAM模型對照組和活化TAM模型對照組在造模后第2天開始給予生理鹽水0.4 ml灌胃×21天，余正常飼養(yǎng)。TAM中藥組和活化TAM中藥組在造模后第2天開始給藥，補腎抗癌方藥液0.4 ml(相當于生藥量36.1 g/kg)灌胃×21天，余正常飼養(yǎng)。

1.8檢測瘤重及抑瘤率

觀察接種前后各組小鼠的飲食情況、活動、毛色、大便狀況等。引頸脫臼處死動物，完整剝?nèi)∑は履[瘤，去除血污、脂肪等非腫瘤組織，用電子天平稱瘤重，以均數(shù)加標準差統(tǒng)計，取均值進行t檢驗處理，計算抑瘤率，計算公式：抑瘤率=(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

1.9流式細胞儀檢測小鼠移植瘤中CD206表達

將腫瘤組織浸泡在含有PSB的平皿中，用眼科剪將腫瘤組織剪碎，勻漿；0.25%胰蛋白酶消化，經(jīng)300目濾網(wǎng)過濾成單細胞懸液，在濾液中加入2 ml含有1%牛血清的PSB，混勻后，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液；將細胞再懸浮于0.2 ml的PSB中，加入FITC標記的抗小鼠CD206抗體，4℃共育30 min，用PBS洗去游離的抗體，用PBS重懸后用流式細胞儀。

1.10免疫組織化學(S-P)法

取各組小鼠移植瘤，4%多聚甲醛溶液固定。將已固定的各組腫瘤組織標本分別常規(guī)脫水，浸蠟，包埋，連續(xù)切片，60度烤片2 h。取4 μm石蠟切片，二甲苯常規(guī)脫蠟，梯度酒精脫水。PBS洗滌3次，3 min/次；將切片浸入0.01 mol/L pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液中，水浴鍋(95℃)進行抗原修復，20 min/次，取出后在室溫下自然冷卻；滴加10%正常血清封閉內(nèi)源性非特異性抗原，室溫30 min；滴加一抗(為上述抗體及相應抗體稀釋度)，4℃冰箱過夜；PBS洗滌3次，3 min/次；滴加生物素化羊抗兔IgG 1∶200，37℃ 30 min；PBS洗滌3次，3 min/次；VEGF 1∶50，37℃30 min；PBS洗滌3次，3 min/次；0.05%DAB+0.03%H2O2顯色8～12 min，流水洗；蘇木精襯染，流水洗；吹干，常規(guī)樹脂封片。以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒者判定為VEGF陽性細胞，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.11結(jié)果判定

在光學顯微鏡下對切片染色情況進行評估，以細胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為VEGF陽性。其結(jié)果判斷標準參考文獻[2]評定：每張切片隨機選取5個視野，每個視野在高倍鏡下(×400)計數(shù)100個腫瘤細胞中陽性細胞的比例，根據(jù)陽性細胞數(shù)所占比例判讀免疫組化結(jié)果。

1.12統(tǒng)計學方法

2結(jié)果

2.1活化RAW264.7的鑒定結(jié)果

CD206主要標記TAM細胞中的M2型細胞，應用流式細胞儀檢測經(jīng)過IL-4處理過的小鼠腫瘤相關(guān)巨噬細胞RAW264.7細胞，其TAM中CD206表達率為51.0%，其同型對照為10.2%；而未用IL-4處理的RAW264.7細胞，其CD206表達率僅為24.7%，故經(jīng)過IL-4處理過的RAW264.7細胞即為活化的TAM細胞。

2.2小鼠瘤重和抑瘤率

接種Lewis肺癌(鼠源)細胞后，成瘤率為90%，各組皮下移植瘤的體積逐漸增大，腫瘤成局部結(jié)節(jié)狀生長，接種后的第1～4天，移植瘤生長基本相同，第15～21天，對照組移植瘤生長明顯快于中藥組，活化組腫瘤生長較快；處死后解剖觀察見腫瘤質(zhì)硬，有薄層膜狀結(jié)構(gòu)包繞，表面有血管生長分布，實驗結(jié)束后，各中藥組瘤重均輕于對照組(P<0.05)，中藥組、活化中藥組抑瘤率分別為16.68%、14.43%，與各對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，活化組平均瘤重明顯重于未活化組，各組lewis肺癌小鼠平均瘤重及抑瘤率比較見表1。

表1　實驗后各組Lewis肺癌小鼠瘤重及抑瘤率的比較±s)

▲▲為與TAM模型對照組比較，P<0.01；▲為TAM中藥組比較P<0.05。

2.3 小鼠移植瘤組織中CD206表達

流式細胞儀檢測各組移植瘤細胞中CD206表達，CD206是M2型巨噬細胞表面甘露糖受體。流式細胞儀檢測一萬個細胞中標記為CD206的細胞所占比例，以百分數(shù)表示。結(jié)果表明CD206表達量在各組小鼠移植瘤細胞中從多到少依次為活化TAM模型組、活化TAM中藥組、TAM模型組、TAM中藥組。單因素方差比較，P<0.01，差異均有統(tǒng)計學意義，見表2、圖1。

表2　各組小鼠CD206表達情況

各組間多重比較(LSD比較)：★★表示TAM模型組與其他三組比較，P<0.01，▲▲表示活化TAM模型組與其他三組比較，P<0.01，◆◆表示與TAM中藥組比較，P<0.01。

2.4VEGF表達

中藥組與模型組相比較，VEGF表達水平明顯下降(P<0.05)，VEGF表達情況見表3，單因素方差比較，P<0.01，組間比較差異有統(tǒng)計學意義，見圖2。

圖1　小鼠移植瘤中CD206表達

組別nVEGF/%TAM模型對照組10 53.45±4.14★★TAM中藥組10 30.51±3.99活化TAM模型對照組10 89.04±2.98▲▲活化TAM中藥組10 73.72±4.51◆◆

各組間多重比較(LSD比較)：★★表示TAM模型組與其他三組比較，P<0.01；▲▲表示活化TAM模型組與其他三組比較，P<0.01；◆◆表示與TAM中藥組比較，P<0.01。

圖2　各組中VEGF表達情況

3討論

機體的免疫功能狀態(tài)是影響腫瘤生長的一個重要因素，癌細胞可以通過多種機制使宿主免疫功能異常，逃避機體的免疫監(jiān)視，使機體的免疫系統(tǒng)無法對腫瘤細胞進行識別和殺傷，以致腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)。巨噬細胞是一類重要的免疫細胞，廣泛參與免疫應答、免疫效應與免疫調(diào)節(jié)。一般認為，激活的巨噬細胞能更有效地發(fā)揮殺瘤作用，但是相關(guān)研究卻發(fā)現(xiàn)腫瘤部位浸潤的巨噬細胞量越大，活性越強，其抗腫瘤效果卻越差，巨噬細胞是1種異質(zhì)性細胞，受所處微環(huán)境的影響發(fā)生不同性質(zhì)活化，成為不同表型和功能的亞群，主要為M1型和M2型。M1型巨噬細胞參與Th1型免疫應答，殺傷病原體和腫瘤細胞。M2型巨噬細胞參與Th2型免疫應答，促進血管生成，組織重建和損傷修復，參與到細胞的免疫應答。正常情況下，機體的Th1/Th2細胞因子處于動態(tài)平衡之中，Th1細胞因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12等，以IFN-γ為最典型的代表；Th2細胞因子包括IL-4、IL-6和IL-10等，以IL-4為最典型的代表，且Th2漂移與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。

參考章必武等[3]體外以IL-4處理人巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)TAM能高表達活化替代M2型TAM，我們在實驗中用IL-4處理過的小鼠巨噬細胞誘導其表現(xiàn)M2型TAM的替代活化的特征，T淋巴細胞CD206在小鼠肺癌移植瘤中表達升高，標記M2型TAM細胞在小鼠移植瘤模型中成高表達狀態(tài)。CD分子是確定淋巴細胞表型和分離純化淋巴細胞的重要依據(jù)。已有文獻報道[4]，M2型巨噬細胞表面甘露糖受體(CD206)表達明顯上調(diào)。實驗中發(fā)現(xiàn)活化組的CD206細胞在小鼠移植瘤中的比例明顯高于未活化組，而各對照組的CD206細胞表達明顯高于各中藥組，探討補腎抗癌中藥有可能抑制了M2型細胞生長從而達到有效的抑制小鼠移植瘤的生長。

血管形成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[5]，雖然眾多因子參與其中，但VEGF仍是這一過程中最重要的因子。新生血管生成在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)移灶的生長過程中起重要作用，在腫瘤微環(huán)境中具有促進腫瘤血管生成作用，影響腫瘤的生物學行為導致腫瘤轉(zhuǎn)移，我們課題組在中藥復方抗小鼠移植瘤血管生成方面有相關(guān)的實驗研究表明中藥可以抑制微血管生成[6]。腫瘤間質(zhì)中的TAM越多，新生微血管越豐富，腫瘤轉(zhuǎn)移性就越強，這可能是癌組織易發(fā)生轉(zhuǎn)移的原因之一。VEGF的表達和CD206分布呈正相關(guān)關(guān)系，并且我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，活化組的小鼠移植瘤在后期生長增快，后期移植瘤出現(xiàn)潰瘍和空洞，活化的TAM可能是通過促進VEGF的表達在腫瘤血管形成過程中起關(guān)鍵作用。

Chen等[7]發(fā)現(xiàn)將巨噬細胞和多個NSCLC細胞株共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，后者的侵襲能力和降解基質(zhì)的活性明顯增加，IL-8、MMP-9、VEGF、VEGF-C和MMP-1等基因表達上調(diào)。我們在實驗中用TAM細胞和成熟的小鼠肺癌細胞一起建立小鼠移植瘤模型，并將TAM誘導成活化替代的TAM表現(xiàn)出M2型特征與小鼠肺腺癌細胞一起建立小鼠移植瘤模型，明確的觀察到活化組的TAM小鼠移植瘤模型比未活化組的小鼠移植瘤模型增長迅速，惡性程度升高，VEGF高表達，兩者對小鼠移植瘤的預后不良成正相關(guān)。補腎抗癌中藥在臨床中治療非小細胞肺癌和抑制肺癌轉(zhuǎn)移，延長生存期等方面達到了很好的臨床效果，我們的中藥復方主要組成為巴戟天、肉蓯蓉、淫羊藿、黃精、女貞子、山茱萸、白花蛇舌草、蚤休、守宮、蟾皮等十位中藥，晚期肺癌多腎精虧虛，是正氣虛弱的重要病因病機之一，上述中藥可以溫補腎陽，滋補腎陰，升提人體正氣，增加人體抗病能力和機體免疫力。各中藥組和各對照組的VEGF表達，均比對照組顯著降低，表明補腎抗癌中藥明顯抑制小鼠移植瘤的生長和VEGF的表達。并且活化TAM中藥組比活化TAM對照組的VEGF表達有顯著降低，推測中藥在抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機制之一可能是通過下調(diào)TAM的替代活化表達從而降低VEGF的表達。中藥有可能通過多靶點的免疫調(diào)節(jié)降低了TAM的M2型表達，達到抑制小鼠VEFG的表達，但具體的機制還有待進一步的實驗研究。

參考文獻

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(編輯：吳小紅)

Effect of Tonifying Kidney and Anticancer Prescription on the VEGF Expression of TAM-induced Mice Lewis Lung Cancer

ZHAOQingxiang，DENGHaibin，WUJi，etal.LonghuaHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shanghai，200032

【Abstract】ObjectiveTo study the tonifying kidney and anticancer prescription on the vascular endothelial growth factor (VEGF)expression in different activation phenotype of tumor-associated macrophages (TAM) induced lung adenocarcinoma xenograft mouse model.MethodsDifferent TAM activation phenotype in mice lung adenocarcinoma xenograft model were constructed，and 50 C57BL/6J mice randomly divided into 5 groups：control group，TAM model control group，3.TAM TCM group，activated TAM model control group，and activated TAM TCM group； appropriate drug intervention was applied after inoculation，all mice were executed on day 21，subcutaneous cancer was peeled，the number of TAM was calculated by flow cytometry； and immunohistochemistry staining method was used to detect the expression of VEGF subcutaneously transplanted tumor tissue in mice.ResultsOn day 21 after modeling，volume of the TCM mouse xenograft was significantly smaller than that of the control group，volume of TAM mouse xenograft model control group was significantly smaller than the activation TAM model control group，CD206 cells ratio of mice transplanted tumor tissue in the TCM group was significantly lower than the proportion of each model control group，the expression of CD206 in tumor tissues of TCM group was lower than the models in other groups.ConclusionTonifying kidney and anticancer prescription may inhibit the expression of TAM and VEGF to achieve antitumor effect.

【Key words】Tonifying Kidney and Anticancer Prescription；Tumor-associated Macrophages(TAM)；Vascular endothelial growth factor(VEGF)

(收稿日期2014-03-25修回日期 2014-04-18)

中圖分類號：R737.11

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2015)01-0001-05

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.01.001

通訊作者：王中奇

基金項目：上海市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研基金課題(2012J004A)；上海市市級醫(yī)院新興前沿技術(shù)聯(lián)合攻關(guān)項目(SHDC1201211)；國家中醫(yī)藥管理局重點學科(中醫(yī)腫瘤學)學科建設(shè)課題(LHZLK-11047)
作者單位：200032 上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院