褪黑素受體對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的調(diào)控及其機(jī)制研究

趙國(guó)龍，張秋芳，翟蒙恩，于立明，高文麗，金振曉，段維勛，俞世強(qiáng)，王 云

·基礎(chǔ)研究·

褪黑素受體對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的調(diào)控及其機(jī)制研究

趙國(guó)龍，張秋芳，翟蒙恩，于立明，高文麗，金振曉，段維勛，俞世強(qiáng)，王 云

目的 研究褪黑素膜受體（MR）在褪黑素（Mel）抗心肌缺血再灌注（MI／R）損傷機(jī)制中的作用。方法 雄性SD大鼠80只隨機(jī)分為四組：假手術(shù)組（Sham）、MI／R＋溶劑對(duì)照組（MI／R＋V）、MI／R＋Mel治療組（MI／R＋Mel）、MI／R＋Mel＋Luz組（MI／R＋Mel＋Luz），Luz（Luzindole）為MR特異性阻斷劑。大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎和松開方法建立大鼠MI／R模型，心肌缺血30min，再灌6 h后ELISA法檢測(cè)心肌組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率，Evans blue－TTC雙染法測(cè)定梗死面積，Western blot法檢測(cè)沉默信息轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子1（SIRT1）、乙?；骖^轉(zhuǎn)錄因子1（Ac－Foxo1）、Caspase－3及褪黑素受體（MR）的表達(dá)水平，再灌注72 h后超聲心動(dòng)圖法檢測(cè)各組大鼠心功能。結(jié)果 與缺血再灌注組相比，Mel治療顯著改善心臟左室射血分?jǐn)?shù)［LVEF，（65．18±5．863）%vs（47．37±4．201）%，P＜0．01］及左室短軸縮短率［LVFS，（36．19±3．299）%vs（22．80 ±0．8881）%，P＜0．01］，下調(diào)心肌組織超氧化物［（2．881±0．1908）RLU／（mg·s）vs（3．955±0．3022）RLU／（mg·s），P＜0．01］、丙二醛（MDA）生成［（269．1±11．24）pmol／mg vs（412．7±24．39）pmol／mg，P＜0．01］及gp91phox的表達(dá)［（3．404±0．2440）vs（4．388± 0．1463），P＜0．01］，上調(diào)超氧化物歧化酶（SOD）［（35．83±2．959）U／mg vs（21．11±2．004）U／mg，P＜0．01］、SIRT1［（0．8033±0．05357）vs（0．3313±0．04337）］，P＜0．01］，下調(diào)Ac－Foxo1水平［（0．2393±0．01440）vs（0．3536±0．01384），P＜0．01］；而Luz阻斷MR后逆轉(zhuǎn)Mel的上述作用（均P＜0．01）。結(jié)論 Mel通過(guò)MR激活SIRT1信號(hào)通路，顯著減輕大鼠MI／R氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激抗凋亡心肌保護(hù)作用。

褪黑素；褪黑素受體；心肌缺血再灌注損傷；沉默信息轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子1；心肌保護(hù)

心肌缺血／再灌注（myocardial ischemia／reperfusion，MI／R）損傷是指缺血期處于可逆損傷的心肌細(xì)胞，恢復(fù)血液供應(yīng)后轉(zhuǎn)化為不可逆損傷。這種損傷是由多種觸發(fā)物、媒介物和效應(yīng)器參與的復(fù)雜生物反應(yīng)過(guò)程，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血流障礙、心功能異常、心肌細(xì)胞壞死和凋亡［1］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，沉默信息轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子1（SIRT1）是保護(hù)心臟最基本的內(nèi)源性抗凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子之一，激活SIRT1具有明確的抗 MI／R損傷作用［2］。褪黑素（melatonin，Mel）是松果體分泌的一種吲哚類激素，化學(xué)成分是N－乙酰－5－甲氧基色胺。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)Mel可激活SIRT1信號(hào)通路減輕線粒體氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)缺血心?。?］。有文獻(xiàn)報(bào)道褪黑素膜受體（melatonin membrane receptor，MR）被激活后，對(duì)缺氧／復(fù)氧損傷后的H9C2細(xì)胞具有保護(hù)作用［4］。但是MR是否介導(dǎo)Mel激活SIRT1信號(hào)通路減輕MI／R損傷尚未見報(bào)道。為此本研究采用大鼠MI／R模型，研究褪黑素對(duì)心肌缺血再灌注（MI／R）損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，探討MR對(duì)MI／R損傷的影響。

1 材料和方法

1．1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清潔級(jí)雄性SD大鼠80只，體重200～250 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。30 g／L戊巴比妥鈉，褪黑素（Mel，Sigma公司），褪黑素受體阻斷劑（Luz，Santa Cruz公司），原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)試劑盒（Roche公司），氯化三苯氮四唑（TTC）檢測(cè)試劑（Sigma公司），SIRT1、Ac－Foxo1、gp91phox、Caspase－3、Mel－1a－R、Mel－1b－R抗體（Santa Cruz公司）。

1．2 方法

1．2．1 動(dòng)物的分組 80只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組（每組20只）：①M(fèi)I／R＋溶劑對(duì)照組（MI／R＋V組）：MI／R手術(shù)前，腹腔注射含0．1 mol／L的乙醇的生理鹽水7 d（1 m l／d），再灌注前15 min注射一次；②MI／R＋Mel治療組（MI／R＋Mel組）：MI／R手術(shù)前腹腔注射Mel 7 d，10 mg／（kg·d），再灌注前15 min再注射1次，15 mg／（kg·d）；③MI／R＋Mel＋Luz組（MI／R＋Mel＋Luz組）：Luzindole（Luz），Mel給藥同前，MI／R手術(shù)前腹腔注射Luz 7 d，1 mg／（kg· d），再灌注前20 min注射一次，2 mg／kg；④假手術(shù)組（Sham組）不結(jié)扎冠脈，作為對(duì)照。按文獻(xiàn)［5－6］方法于胸骨左緣2～4肋間打開胸腔及心包膜，暴露心臟；在肺動(dòng)脈圓錐右緣、平左心耳下緣1～2 cm處，經(jīng)左冠狀動(dòng)脈下淺層心肌穿一5－0號(hào)絲線，連同一直徑2 mm聚氯乙烯管結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，造成心肌缺血，Sham組僅穿線而不結(jié)扎動(dòng)脈。

1．2．2 心功能檢測(cè) MI／R手術(shù)后72 h，利用Vevo2100小動(dòng)物超聲儀（VisualSonics，Toronto，Canada）檢測(cè)并計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）等心功能的變化，測(cè)量5個(gè)心動(dòng)周期，取平均值作為最后檢測(cè)數(shù)據(jù)。

1．2．3 心肌梗死（MI）范圍的測(cè)定 再灌注結(jié)束后，再次結(jié)扎冠脈，向左心室腔注入20 g／L伊文氏藍(lán)（1～2 ml）。迅速取出心臟，凍存于－20℃。用心臟切片器垂直于心臟長(zhǎng)軸將其切成1 mm厚的薄片，分片置于2ml10 g／L TTC（pH 7．4）的12孔培養(yǎng)皿中，于37℃孵育15 min。用數(shù)碼相機(jī)拍照并輸入計(jì)算機(jī)。采用單盲法分別將伊文氏藍(lán)染色區(qū)（非缺血區(qū)）、TTC染色區(qū)（紅染，缺血區(qū)但組織仍存活）及非TTC染色區(qū)（MI區(qū)），用Sigma Scan面積測(cè)算，Image J圖像分析軟件進(jìn)行計(jì)算處理。MI的范圍以每一心臟總梗死面積（INF）占總?cè)毖獏^(qū)面積（AAR）的百分比表示（INF／AAR×100%）。

1．2．4 心肌細(xì)胞凋亡的TUNEL法檢測(cè) 按TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書操作。MI／R 6 h后，立即取出心臟，以預(yù)冷的PBS沖洗干凈，取心尖部約2～5mm組織。將取下組織切心臟冠狀面最大橫徑，置于40 g／L甲醇溶液中固定24 h后進(jìn)行石蠟包埋切片。每張切片在凋亡區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)以上高倍視野，計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野內(nèi)凋亡細(xì)胞核數(shù)，總細(xì)胞核數(shù)，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率（apoptotic rate）。

1．2．5 氧化應(yīng)激損傷相關(guān)分子表達(dá)的檢測(cè) 心肌中超氧化物含量的檢測(cè)采用光澤精增強(qiáng)發(fā)光測(cè)定法，超氧化物產(chǎn)物以相對(duì)光單位（RLU）／（mg·s）表示。Western blot法檢測(cè)gp91phox蛋白表達(dá)。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，并按其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程進(jìn)行檢測(cè)。

1．2．6 SIRT1相關(guān)分子及MR表達(dá)的檢測(cè) 再灌注結(jié)束后，迅速取出心臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗后，剪取缺血區(qū)心肌標(biāo)本，液氮中速凍，置－80℃冰箱中保存待測(cè)。取缺血區(qū)心肌標(biāo)本，勻漿、離心后，取上清液分裝保存?zhèn)溆?。BCA法測(cè)定蛋白濃度并進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離蛋白，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚氟乙烯膜，50 mol／L脫脂牛奶封閉，分別加羊抗SIRT1、羊抗Ac－Foxo1、兔抗Caspase－3抗體，稀釋比均為1：500，4℃過(guò)夜，TBST洗脫3次，分別加1：5 000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體、羊抗兔IgG抗體，室溫孵育1 h，TBST洗脫3次，使用ECL－plus試劑盒發(fā)光，通過(guò)生化檢測(cè)系統(tǒng)成像并分析結(jié)果，以β－actin作為內(nèi)參照，檢測(cè)SIRT1、Ac－Foxo1、Caspase－3、Mel－1a－R、Mel－1b－R的表達(dá)情況。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用Prism 5．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析（ANOVA），若總體差異顯著，再以t檢驗(yàn)分析相應(yīng)兩組間的顯著性差別。以P＜0．05為差異顯著的界限。

2 結(jié) 果

2．1 各組心功能的比較 大鼠心肌缺血再灌注72 h后超聲心動(dòng)圖顯示，與MI／R＋V組相比，MI／R＋Mel組LVEF與LVFS顯著提高，而MI／R＋Mel＋Luz組則較MI／R＋Mel組顯著下降（均P＜0．01，圖1）。

2．2 各組心肌細(xì)胞凋亡率及梗死面積的比較 大鼠MI／R 6 h留取心肌組織TUNEL凋亡檢測(cè)顯示，與MI／R＋V組相比，MI／R＋Mel組心肌細(xì)胞凋亡率顯著下降，而使用Luz組則較MI／R＋Mel組顯著上升（均P＜0．01，圖2A）；MI／R 6 h后取心臟進(jìn)行Evans blue－TTC雙染切片統(tǒng)計(jì)顯示，與MI／R＋V組相比，MI／R＋Mel組梗死面積顯著下降，而使用Luz組則較MI／R＋Mel組顯著上升（均P＜0．01，圖2B）。

2．3 各組 Superoxide generation、gp91phox、SOD、MDA的比較 大鼠MI／R 6 h留取心肌組織，檢測(cè)結(jié)果顯示，與MI／R＋V組相比，MI／R＋Mel組心肌細(xì)胞相關(guān)蛋白 Superoxide generation、Gp91phox、MDA顯著下降，而使用Luz組則較MI／R＋Mel組顯著上升（均P＜0．01，圖3A、B、D）；檢測(cè)SOD水平顯示，與MI／R＋V組相比，MI／R＋Mel組心肌細(xì)胞表達(dá)明顯上調(diào)，使用Luz后其表達(dá)水平較MI／R＋V組顯著下降（均P＜0．01，圖3C）。

2．4 各組SIRT1、凋亡相關(guān)蛋白及MR表達(dá)的比較

大鼠MI／R 6 h后，留取心肌組織，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與 Sham組相比，MI／R＋V組心肌SIRT1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，Mel治療后SIRT1表達(dá)較MI／R＋V組顯著上升，而使用Luz組可使SIRT1表達(dá)明顯降低（均P＜0．01，圖4A）；檢測(cè)Ac－Foxo1、Caspase－3水平顯示，缺血再灌注后 Ac－Foxo1、Caspase－3表達(dá)較Sham組明顯上調(diào)，給予Mel治療后其表達(dá)水平較MI／R＋V組顯著下降，而使用Luz組可使Ac－Foxo1、Caspase－3表達(dá)明顯上升（均P＜0．01，圖4B、C）；檢測(cè)MR顯示，MI／R后Mel－1a－R、Mel－1b－R水平明顯下，且Mel治療組較MI／R組和Luz組表達(dá)水平無(wú)明顯差異（均P＞0．05，圖4D、E）。

圖1 各組心功能的比較

圖2A

圖2 各組心肌細(xì)胞凋亡率及梗死面積的比較

圖3A

圖3B

圖3C

圖3 各組Superoxide generation、gp91phox、SOD、MDA的比較

圖4A

圖4D

圖4 各組SIRT1、凋亡相關(guān)蛋白及MR表達(dá)的比較

3 討 論

MI／R損傷是指在阻斷冠狀動(dòng)脈一定時(shí)間后缺血的心肌在開放循環(huán)再灌注期間出現(xiàn)的心臟功能、代謝及結(jié)構(gòu)上的損傷。在恢復(fù)血流再灌注后，早期缺血心肌損傷加重，引起更多心肌細(xì)胞死亡，心肌梗死面積變大，進(jìn)而進(jìn)一步損害心功能［7－8］。本研究和前期研究發(fā)現(xiàn)，Mel對(duì)MI／R損傷和血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有明確的拮抗作用［3］。

迄今為止，褪黑素的膜受體（褪黑素受體a、b）和核受體（視黃酸相關(guān)孤兒受體 α）已被發(fā)現(xiàn)［9］。研究證實(shí)Mel可直接發(fā)揮清除自由基抗氧化作用，但其間接抗氧化作用很可能是由膜受體介導(dǎo)的［10－11］。此外，有證據(jù)顯示Mel膜受體參與心臟保護(hù)作用：膜受體抑制劑Luz顯著抑制Mel對(duì)MI／R損傷的保護(hù)作用［12］，而Mel抗環(huán)孢素A誘導(dǎo)的心臟毒性也被證明是由膜受體介導(dǎo)的［13］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)SIRT1是目前心臟保護(hù)方面最基本的內(nèi)源性抗凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子之一［2］。SIRT1是存在于哺乳動(dòng)物的酵母沉默信息調(diào)節(jié)因子Sir2（silence information regulator）的同源物，是一種具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）＋依賴的組蛋白去乙酰化酶（HDACs）活性的多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，以組織特異性方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、衰老和代謝［14］。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，Mel可發(fā)揮抗凋亡作用減輕MI／R損傷并改善心功能，其具體機(jī)制可能與其激活SIRT1信號(hào)通路并降低Ac－Foxo1水平有關(guān)［3］，而Mel膜受體是否參與此過(guò)程尚無(wú)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：MI／R損傷后MR表達(dá)下降，同時(shí)伴有SIRT1表達(dá)下降及Ac－Foxo1水平上升，可能是MI／R損傷的重要機(jī)制之一。而使用Mel治療后明顯上調(diào)SIRT1的表達(dá)并降低Ac－Foxo1水平，發(fā)揮抗凋亡并改善心臟功能的作用。外源加入Mel膜受體特異性阻斷劑Luz可顯著下調(diào)SIRT1表達(dá)，抑制Mel抗氧化應(yīng)激減輕MI／R損傷的作用。以上結(jié)果表明：MI／R損傷下調(diào)心肌Mel膜受體表達(dá)，下調(diào)Mel下游保護(hù)性信號(hào)通路，而外源性給予Mel可激動(dòng)褪黑素膜受體，激活下游SIRT1信號(hào)，保護(hù)缺血心肌。

總之，本研究證實(shí)：MI／R后MR表達(dá)水平降低，Mel下游信號(hào)受損可能是MI／R損傷加重的重要因素，而Mel治療可在不改變MR表達(dá)水平情況下激活下游保護(hù)性信號(hào)通路，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、抗凋亡作用，顯著減輕MI／R損傷。本研究揭示了Mel及其受體參與缺血心肌保護(hù)新機(jī)制，為MI／R損傷治療提供了新靶點(diǎn)，并為Mel相關(guān)內(nèi)源性藥物的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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The role ofmelatonin receptor in the protective effects ofmelatonin againstm yocardial ischem ia reperfusion injury in rats

Zhao Guo－long，Zhang Qiu－fang，Zhai Meng－en，Yu Li－ming，Gao Wen－li，Jin Zhen－xiao，Duan Wei－xun，Yu Shi－qiang，Wang Yun
Ningxia Medical University，Yinchuan，750004，Ningxia，China

Wang Yun，Email：wywarrenw＠hotmail．com
Yu Shi－qiang，Email：shiqiangyu210＠126．com

ObjectiveTo investigate the protective effectofmelatonin（Mel）onmyocardial ischemia／reperfusion（MI／R）injury and the influence ofmelatoninmembrane receptor（MR）on MI／R injury．MethodsEighty male Sprague－Dawley rats were subjected to myocardial ischem ia／reperfusion（M I／R，I 30 m in，R 6 h）operation and random ly divided into 4 groups：Sham，MI／R＋V，MI／R＋Mel and MI／R＋Mel＋Luz（Luzindole，the specific antagonist of MR）．The cardiac function 72 h after reperfusion，oxidative stress damage related indicators，apoptotic index，infarct size，MR expression，SIRT1 expression，Ac－Foxo1 expression were detected．ResultsCompared with the MI／R＋V group，melatonin treatment group showed improved left ventricular ejection fraction（LVEF）（65．18±5．863）vs（47．37±4．201），（P＜0．01）and left ventricular fractional shortening（LVFS）（36．19±3．299）vs（22．80±0．8881），（P＜0．01），decreased myocardium superoxide generation（2．881±0．1908）RLU／（mg·s）vs（3．955±0．3022）RLU／（mg·s），（P＜0．01），malondialdehyde（MDA）level（269．1±11．24）pmol／mg vs（412．7±24．39）pmol／mg，（P＜0．01）and gp91phox expression（3．404±0．2440）vs（4．388±0．1463），（P＜0．01），up－regulated SIRT1 expression（0．8033±0．05357）vs（0．3313±0．04337），（P＜0．01），down－regulated Ac－Foxolexpression（0．2393±0．01440）vs（0．3536±0．01384），（P＜0．01）．Moreover，Luz exposure significantly blockedmelatonin＇s cardioprotective effect（all P＜0．01）．ConclusionThe experimentshowed thatMel protected the heart against MI／R injury by reducing oxidative stress damage via activation of SIRT1 signaling in a MR dependentmanner．

Melatonin，Melatonin receptor，Myocardial ischemia／reperfusion injury，SIRT1，Cardioprotection

2015-04-07）

2015-04-13）

10．13498／j．cnki．chin．j．ecc．2015．02．12

國(guó)家自然科學(xué)基金（81470415）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81470411）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃（2013KTCL03－01）；

作者單位：750004銀川，寧夏醫(yī)科大學(xué)（趙國(guó)龍、高文麗、王 云）；710004西安，第四醫(yī)院影像科（張秋芳）；710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心臟外科（翟蒙恩、于立明、金振曉、段維勛、俞世強(qiáng)）

王 云，Email：wywarrenw＠hotmail．com；俞世強(qiáng)，Email：shiqiangyu210＠126．com