苯那普利與厄貝沙坦對心衰大鼠心肌膠原的影響及機制探討

任亞麗，徐濟良，虞　玨，趙　喜，吳　鋒，孟國梁(.江蘇省南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術學校，.南通大學藥學院，江蘇南通　600)

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苯那普利與厄貝沙坦對心衰大鼠心肌膠原的影響及機制探討

任亞麗1，徐濟良2，虞玨1，趙喜2，吳鋒2，孟國梁2
(1.江蘇省南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術學校，2.南通大學藥學院，江蘇南通226001)

中國圖書分類號: R-332; R322.11; R341.26; R541. 61; R542. 23; R972. 4

摘要:目的觀察苯那普利、厄貝沙坦單用及聯(lián)合應用對慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)大鼠心肌膠原的影響，并深入探討其作用機制。方法采用腹主動脈縮窄法，造成壓力負荷性心肌肥厚致心力衰竭大鼠模型。苯那普利或(和)厄貝沙坦連續(xù)給藥8周，監(jiān)測大鼠尾動脈收縮壓，透射電鏡檢測心肌細胞超微結(jié)構(gòu)，堿水解法檢測心肌組織羥脯氨酸含量，并評估心肌膠原交聯(lián)程度，免疫組化測定心肌Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白水平，Western blot檢測心肌p-38MAPK和p-p38MAPK的蛋白表達。結(jié)果與心衰模型組相比，各治療組血壓無明顯變化，但心肌羥脯氨酸含量、膠原交聯(lián)程度、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、p-p38MAPK蛋白表達明顯降低(P＜0. 05)，其中聯(lián)合應用療效最好。結(jié)論苯那普利與厄貝沙坦聯(lián)用對改善心衰大鼠心肌膠原纖維的總量與性質(zhì)具有協(xié)同作用，可能與下調(diào)p-p38MAPK蛋白表達有關。

關鍵詞:心力衰竭;苯那普利;厄貝沙坦;膠原; p-38MAPK;心肌纖維化

網(wǎng)絡出版時間:2015－6－5 11:22網(wǎng)絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.024.html

孟國梁(1981－)，男，博士，講師，通訊作者，研究方向:心血管藥理學，E-mail: mengguoliang@ ntu.edu.cn

心室重構(gòu)引起的心肌結(jié)構(gòu)和功能改變是慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)發(fā)生發(fā)展的重要機制之一［1］。心肌纖維化是指心肌正常組織中膠原纖維過量聚積或膠原成分發(fā)生改變，最終導致心肌僵硬及心功能紊亂，是心肌重塑過程中心功能由代償變?yōu)槭Т鷥數(shù)闹匾h(huán)節(jié)［2］。p-38信號通路作為促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的一個重要分支，可以激活心肌纖維化相關轉(zhuǎn)錄因子和基因的表達，參與細胞的增殖、分化、生長和凋亡等生理或病理過程［3］。本研究旨在探討苯那普利與厄貝沙坦聯(lián)合用藥對壓力負荷性心力衰竭大鼠心肌膠原的影響，并探討可能作用機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物SD大鼠80只，♀♂各半，220～240 g，購自南通大學實驗動物中心。

1.1.2藥品與試劑鹽酸苯那普利片(北京諾華制藥有限公司)，厄貝沙坦(修正藥業(yè)集團柳河制藥有限公司)，羥脯氨酸測試盒(南京建成生物工程研究所)，胃蛋白酶(加拿大Bio Basic Inc公司)，兔抗大鼠Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、p-38MAPK多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，抗GAPDH(上?？党缮锕こ逃邢薰?，抗p-p38MAPK(Cell Signaling Technology)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶7 000，上?？党缮锕こ逃邢薰?，預染蛋白Marker(6. 5～175 ku，New England Biolabs)。

1.1.3儀器RBP-1B型大鼠尾動脈血壓心率測定儀(中日友好臨床醫(yī)學研究所)，JEM-1230型透射電鏡(日本JEOL電子公司)，蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司)，SONOS 5500型超聲診斷儀(美國Agilent公司)。

1.2方法

1.2.1模型制作采用腹主動脈縮窄法［4］造成壓力負荷性心肌肥厚致心力衰竭大鼠模型。正常喂養(yǎng)8周后通過超聲心動圖檢測心功能，以心臟射血分數(shù)(ejection fraction，EF)≤45%作為心衰模型成功標準［5］，假手術組除不縮窄腹主動脈以外，其他操作與手術組完全相同。

1.2.2分組與給藥將成模大鼠分為心衰模型組(Mod)、苯那普利組(Ben，給予苯那普利10 mg· kg－1·d－1)、厄貝沙坦組(Irb，給予厄貝沙坦50 mg ·kg－1·d－1)、聯(lián)合組(Com，給予苯那普利5 mg· kg－1·d－1和厄貝沙坦25 mg·kg－1·d－1)，假手術組(Con)作為對照，和Mod組同時給予等量生理鹽水，連續(xù)灌胃治療8周。

1.3檢測指標

1.3.1大鼠尾動脈收縮壓測定每隔2周，采用RBP-1B型大鼠尾動脈壓測量儀監(jiān)測大鼠尾動脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)，重復3次，每次間隔1 min，計算均值作為收縮壓。

1.3.2超聲心動圖檢測運用SONOS 5500型超聲診斷儀，取胸骨旁左室長軸切面，探頭頻率3～11Hz，測量心臟EF。

1.3.3心肌細胞超微結(jié)構(gòu)開胸后迅速取心尖部位心肌組織，用預冷的生理鹽水洗去血污，切成體積約1 mm3的心肌數(shù)塊，置于體積分數(shù)為0. 04的戊二醛前固定;再用體積分數(shù)為0. 01的鋨酸后固定，經(jīng)系列丙酮脫水，Epon812包埋，1 μm半薄切片，甲苯胺藍染色后，以光鏡定位，超薄切片機切片70 nm，醋酸鈾－檸檬酸鉛雙重染色，利用透射電鏡觀察并攝像。

1.3.4心肌組織羥脯氨酸測定采用樣本堿水解法，按試劑盒說明操作，依次進行樣本處理、調(diào)節(jié)pH、樣本稀釋和樣本檢測。

1.3.5心肌膠原交聯(lián)程度檢測用胃蛋白酶限制性降解法。100 mg心肌組織在預冷的1 mol·L－1醋酸中剪碎，加入胃蛋白酶，封口，4℃勻速攪拌消化，冷凍離心。上清液中含胃蛋白酶可溶性膠原(pepsin-soluble collagen，PSC)，沉淀物中含胃蛋白酶不溶性膠原(pepsin-insoluble collagen，PIC)。取上清液1 mL，與沉淀分別進行羥脯氨酸含量測定，計算膠原限制性胃蛋白酶降解程度，即PSC占膠原總量(PSC和PIC之和)的百分比，反映心肌膠原交聯(lián)程度。

1.3.6免疫組織化學檢測取左心室心肌組織，應用體積分子為0. 1的福爾馬林固定，石蠟包埋，切片。依次加入兔抗大鼠Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原，生物素化山羊抗兔二抗，封片，顯微鏡觀察。PBS代替一抗作為空白對照。每個樣本在200倍視野范圍內(nèi)尋找100個細胞測定其積分光密度，取平均值作統(tǒng)計學分析。

1.3.7 Western blot取約100 mg左室心肌，BCA法蛋白定量。取各樣本50 μg蛋白質(zhì)進行SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，分別加入p-38MAPK、pp38MAPK及GAPDH一抗孵育，TBS洗3次，滴加含有二抗的封閉液，ECL法顯影。四星圖像處理系統(tǒng)測定各組蛋白表達量與內(nèi)參表達量(GAPDH)的比值。

1.4統(tǒng)計學分析利用Stata 13. 0統(tǒng)計軟件進分析處理數(shù)據(jù)，各組資料用±s表示，組間采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗。

2　結(jié)果

2.1大鼠尾動脈收縮壓實驗前，各組大鼠血壓無差異(P＞0. 05)，整個實驗過程中Con組血壓維持不變。腹主動脈縮窄術后4周，各組血壓與Con組相比明顯升高(P＜0. 01)。治療8周后，各治療組血壓與Mod組相比無統(tǒng)計學意義(P＞0. 05，F(xiàn)ig 1)。

2.2心功能超聲心動圖統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，Con組EF為(81. 67±4. 65)%，Mod組EF值為(42. 11± 4. 47)%，提示出現(xiàn)心力衰竭; Ben組、Irb組和Com組分別為(64. 67±6. 90)%、(64. 22±8. 89)%、(70. 00±6. 35)%，各用藥組與Mod組相比均有不同程度的升高(P＜0. 01)，但各治療組間差異無統(tǒng)計學意義。

Fig 1　Systolic blood pressure of rat tail artery(±s，n =9 rats in each group)△P＜0.05，△△P＜0.01 vs Con

2.3心肌細胞超微結(jié)構(gòu)Con組心肌細胞內(nèi)肌原纖維清晰，排列整齊，橫紋清楚，線粒體串珠樣整齊排列于肌原纖維之間，大小形態(tài)正常，可見清晰的閏盤;間質(zhì)纖維無增生。Mod組心肌細胞內(nèi)肌原纖維模糊，排列紊亂、斷裂嚴重，橫紋不清，線粒體大量增生，分布紊亂，腫脹變形，可見閏盤;間質(zhì)內(nèi)大量膠原纖維增生。各治療組大部分肌原纖維排列緊密，線粒體增生、水腫較模型組明顯好轉(zhuǎn)，排列相對整齊，可見閏盤，存在輕度扭曲、斷裂;間質(zhì)內(nèi)膠原纖維增生明顯減少(Fig 2)。

2.4心肌羥脯氨酸含量羥脯氨酸只參與膠原的合成，其含量占膠原的13. 4%，故測定心肌組織中羥脯氨酸的含量就可估算心肌膠原蛋白的含量。與Con組相比，Mod組羥脯氨酸含量較高(P＜0. 01)，提示模型組心肌膠原總量升高;與Mod組相比，各治療組羥脯氨酸含量均明顯下降(P＜0. 01)，且Com組較Ben組或Irb組低(P＜0. 05)。提示苯那普利與厄貝沙坦聯(lián)用在降低心力衰竭心肌膠原纖維總量方面優(yōu)于單用(Tab 1)。

Fig 2　Ultrastructure of myocardium under transmission electron microscope(scare bar: 2μm)1: Myocardial cell，mitochondria，intercalated disc; 2: interstitial collagen

2.5心肌膠原交聯(lián)程度實驗結(jié)果(Tab 1)發(fā)現(xiàn)，Mod組心肌膠原在胃蛋白酶溶液中的降解程度較Con組下降(P＜0. 01)，提示Mod組心肌膠原的交聯(lián)程度增加;各治療組心肌膠原在胃蛋白酶溶液中的降解程度均明顯提高(P＜0. 05或P＜0. 01)，表明心肌膠原的交聯(lián)程度下降，但各組之間差異無統(tǒng)計學意義。

Tab 1　Content of hydroxyproline and degree of collagen cross-linked in left ventricle myocardium of rats(±s，n =9)

Tab 1　Content of hydroxyproline and degree of collagen cross-linked in left ventricle myocardium of rats(±s，n =9)

＊＊P＜0.05，△△P＜0.01 vs Con;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs Mod;#P＜0.05 vs Ben or Irb

Group　Hydroxyproline/Limited pepsin μg·g－1degradation/% Con　193.24±11.01　95.69±5.99 Mod　563.41±98.99△△　66.02±8.42△△Ben　337.88±46.89△＊＊　80.08±4.44△△＊Irb　349.27±62.85△＊＊　79.74±5.83△△＊Com　244.44±19.76△＊＊#　85.64±5.30

2.6免疫組化檢測大鼠心?、瘛ⅱ笮湍z原蛋白表達

Con組大鼠左室心肌間質(zhì)Ⅰ型、Ⅲ型膠原低表達，陽性顆粒散在，染色較淺; Mod組高表達，棕黃色信號強，融合成片;各治療組心?、裥?、Ⅲ型膠原表達明顯降低，Com組最為明顯(Fig 3－4，Tab 2)。

Tab 2　Immunohistochemical integral optical density value of typeⅠand typeⅢcollagen in myocardium of rats(±s，n =9)

Tab 2　Immunohistochemical integral optical density value of typeⅠand typeⅢcollagen in myocardium of rats(±s，n =9)

Group　TypeⅠ　TypeⅢCon　0.14±0.01　0.15±0.01 Mod　0.80±0.11△△　0.49±0.06△△Ben　0.62±0.08△△＊＊　0.36±0.03△△＊＊Irb　0.59±0.10△△＊＊　0.35±0.03△△＊＊Com　0.39±0.06△△＊＊##　0.26±0.06△△＊＊##△△P＜0.01 vs Con;＊＊P＜0. 01 vs Mod;##P＜0. 01 vs Ben or Irb

2.7 Western blot檢測心肌p-38MAPK、pp38MAPK蛋白表達Mod組p-p38MAPK的表達明顯高于Con組(P＜0. 01)，各治療組有不同程度的降低(P＜0. 05)(Fig 5)。

Fig 3　TypeⅠcollagen expression in myocardium of rats by immunohistochemistry

Fig 4　TypeⅢcollagen expression in myocardium of rats by immunohistochemistry

Fig 5　Expression of p38MAPK and p-p38MAPK in left ventricular myocardium in rats(n =4)1: Con; 2: Mod; 3: Ben; 4: Irb; 5: Com;△P＜0. 05，△△P＜0. 01 vs Con;*P＜0. 05 vs Mod;#P＜0. 05 vs Ben or Irb

3　討論

心室重構(gòu)引起的心肌結(jié)構(gòu)和功能的改變是CHF發(fā)生發(fā)展的核心機制［1］，其中心肌纖維化是心肌重塑過程中心功能由代償轉(zhuǎn)變?yōu)槭Т鷥數(shù)闹匾h(huán)節(jié)［2］。生理情況下，Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維構(gòu)成心肌膠原網(wǎng)絡支架，在保護心肌細胞、維持心臟幾何構(gòu)型和僵硬度等方面起著十分重要的作用［6］。心肌僵硬度是指心肌發(fā)生應變的程度，是心臟舒張功能的主要決定因素。Yamamoto等［7］研究發(fā)現(xiàn)，心肌僵硬度主要取決于心室纖維化而非心室肥厚［7］; Matsubara等［8］發(fā)現(xiàn)心肌膠原堆積可增加心肌僵硬度，而左心室肥厚卻未觀察到此類現(xiàn)象的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，Mod組大鼠心肌組織羥脯氨酸總量明顯增高，免疫組織化學結(jié)果顯示，Ⅰ、Ⅲ型膠原表達明顯增加，超微結(jié)構(gòu)亦可見間質(zhì)纖維增生明顯，提示實驗中模型大鼠已出現(xiàn)心肌膠原含量增加和心肌纖維化。

除膠原總量外，Ⅰ、Ⅲ型膠原的比值亦可影響心肌僵硬度，兩者的比例與不良心血管事件關系密切，是決定膠原性質(zhì)與判斷心肌僵硬程度的重要依據(jù)［9］。心肌纖維化時，除膠原總量增多這一特征外，常伴隨Ⅰ型膠原增多，而Ⅲ型膠原相對減少，且這兩型膠原的比例與心肌僵硬程度呈正比［10］。另外，膠原交聯(lián)亦可影響心臟的僵硬度。研究顯示，心衰大鼠伴隨左心室重量、左心室舒張末期壓力及肺重量/體重的增加同時，其心臟羥脯氨酸含量、Ⅰ/Ⅲ型膠原比例及左心室心肌僵硬度均增高，而可溶性膠原的含量下降，說明除了膠原含量、Ⅰ/Ⅲ型膠原比值等因素之外，心肌膠原交聯(lián)程度亦可影響心肌僵硬度［6］。因此，若要改善心功能，減輕心肌僵硬度，除了降低心室膠原總量外，尚需考慮Ⅰ和Ⅲ型膠原的比值及膠原交聯(lián)度的影響。腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)抑制劑除了影響膠原總量，尚可通過調(diào)節(jié)膠原的比例及網(wǎng)路支架重構(gòu)來改善心肌纖維化。賈志梅等［11］通過對心肌梗死大鼠非梗死區(qū)心室重構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，雷米普利可抑制Ⅰ型膠原下調(diào)心肌僵硬度。邢曉倩等［12］研究發(fā)現(xiàn)，氯沙坦可減少心室膠原沉積、降低Ⅰ/Ⅲ比值，進而改善膠原類型比例、增加心室順應性、抑制心衰大鼠心肌纖維化。苯那普利是臨床最常用的的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)之一，厄貝沙坦是中等強度的血管緊張素受體阻斷劑(angiotensin receptor blocker，ARB)，其強度介于纈沙坦與厄貝沙坦之間，兩者合用可在不同水平阻斷RAAS。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應用苯那普利和厄貝沙坦可下調(diào)AngⅡ、血管緊張素I型受體，上調(diào)血管緊張素Ⅱ型受體、ACE2［13］。本研究也發(fā)現(xiàn)，苯那普利及厄貝沙坦治療后能降低心肌纖維化程度，減少交聯(lián)膠原的比例，提高心衰大鼠射血分數(shù)，改善心功能。

p-38信號通路是MAPK通路的一個重要分支，是介導各種細胞因子、應激刺激，導致細胞凋亡、分化及炎癥反應的重要細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑［14－15］。各種刺激下，p-38被激活并進入細胞核或轉(zhuǎn)移到其它部位，參與應激條件下免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應和細胞凋亡過程［16］。ARB可完全阻斷p-38MAPK的活性，從而逆轉(zhuǎn)自發(fā)性高血壓心衰大鼠左心室肥厚現(xiàn)象，提示心臟重構(gòu)與p-38MAPK信號通路密切相關［17］。本研究中Western blot結(jié)果顯示:心力衰竭時，p-38激酶磷酸化水平明顯增高;治療后，各組大鼠心肌組織p-38激酶蛋白總量無明顯變化，但磷酸化水平明顯下降，提示兩藥可抑制心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中p-38MAPK磷酸化修飾。在壓力容量負荷過重、心肌缺血缺氧情況下，p-38MAPK被激活，誘導心肌胚胎基因表達和細胞骨架重組，促使心肌代償性重構(gòu)，同時也可誘導心肌細胞凋亡反應，加重心力衰竭的進程［18］。苯那普利和(或)厄貝沙坦可降低心肌組織p-38MAPK磷酸化水平，對心臟起保護作用，可能與抑制促凋亡信號相關，但對該家族成員信號轉(zhuǎn)導途徑中的上/下游蛋白和各種激酶的激活機制還有待于進一步探討明確。

本研究提示，苯那普利及厄貝沙坦均可改善心衰大鼠心肌膠原纖維的總量與性質(zhì)，減輕心室纖維化，并使心衰大鼠p-38MAPK的磷酸化水平下降。

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Effects of benazepril and irbesartan on myocardial collagen in chronic heart failure rats and mechanisms

REN Ya-li1，XU Ji-liang2，YU Jue1，ZHAO Xi2，WU Feng2，MENG Guo-liang2
(1.Nantong Higher Vocational and Technical Health School of Jiangsu Province，2.Dept of Pharmacology，School of Pharmacy，Nantong University，Nantong Jiangsu 226001，China)

Abstract:Aim To observe the effects of benazepril and irbesartan on myocardial collagen in chronic heart failure(CHF)rats and the possible mechanisms.

Methods CHF model in rats was made by partiallybanding abdominal aorta to induce pressure overload cardiac hypertrophy.The rats were given benazepril or/and irbesartan for 8 weeks.Systolic blood pressure(SBP)was monitored by rat tail artery.The ultrastructure of myocardium was detected by transmission electron microscope.The content of myocardial hydroxyproline and amount of cross-linked collagen were measured by hydrolysis method.The expression of typeⅠandⅢcollagen protein in myocardium was investigated by immunohistochemistry.The expression of p-38MAPK and p-p38MAPK proteins was detected by Western blot.Results Compared with the model of CHF，there was no significant difference in SBP after treatment.The content of hydroxyproline in myocardium，degree of cross-linked collagen，as well as expression of type I collagen，typeⅢcollagen and pp38MAPK proteins were significantly decreased after treatment with benazepril or irbesartan(P＜0. 05)，and the combined treatment of them had better effects.

Conclusion There is a synergistic effect of attenuating the quantity and quality of myocardial collagen in CHF rats by combined use of benazepril and irbesartan，which may be related to the down regulation of pp38MAPK protein expression.

Key words:chronic heart failure; benazepril; irbesartan; collagen; p-38MAPK; myocardial fibrosis

作者簡介:任亞麗(1982－)，女，碩士，講師，研究方向:心血管藥理學，E-mail: ylren2000@126.com;

基金項目:江蘇省高校自然科學基金項目(No 12KJB310012);南通大學自然科學基金項目(No 13ZY004)

收稿日期:2015－01－14，修回日期:2015－04－30

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－1009－06

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.024