流感病毒H1N1感染A549細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡及黃芩苷干預(yù)作用的研究

劉曉婷，張　沂，顧立剛，吳　珺，邱澤計(jì)，于卓男，王玥琦(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院.中醫(yī)藥抗病毒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、.關(guān)鍵技術(shù)中心，北京　0009)

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流感病毒H1N1感染A549細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡及黃芩苷干預(yù)作用的研究

劉曉婷1，張沂1，顧立剛1，吳珺1，邱澤計(jì)1，于卓男1，王玥琦2
(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.中醫(yī)藥抗病毒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2.關(guān)鍵技術(shù)中心，北京100029)

中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào): R284.1; R329.25; R373.13; R394.2; R978. 7

摘要:目的研究黃芩苷對(duì)流感病毒H1N1感染A549細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡干預(yù)作用，探討黃芩苷抗流感病毒感染的作用機(jī)制。方法采用基因芯片技術(shù)研究流感病毒感染細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)通路中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的變化。同時(shí)，采用熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中天門(mén)冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白-8(caspase-8)和caspase-3的mRNA表達(dá)的變化。Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中的相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果利用基因芯片技術(shù)，通過(guò)KEGG pathway分析涉及細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑。與細(xì)胞對(duì)照組相比，H1N1感染組差異表達(dá)基因Casp3、Casp7、Casp8、Casp10、TRAIL、MYD88、IL1A、和IL1B明顯上調(diào);與H1N1感染組比較，奧司他韋對(duì)照組對(duì)差異表達(dá)基因Casp3、Casp4和Casp8明顯下調(diào);黃芩苷高劑量組對(duì)差異表達(dá)基因Casp3、Casp4、Casp6和Casp8明顯下調(diào);黃芩苷低劑量組除上述差異表達(dá)基因外，還明顯下調(diào)了IL1RAP 和Cn。qRT-PCR結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，H1N1感染組caspase-3和-8的mRNA表達(dá)均明顯升高。與H1N1感染組比較，奧司他韋對(duì)照組、黃芩苷高低劑量組的caspase-3 和-8的mRNA表達(dá)均明顯降低(P＜0. 01);并且，黃芩苷低劑量組的治療效果優(yōu)于高劑量組;該結(jié)果和基因芯片表達(dá)的結(jié)果基本相符。結(jié)論流感病毒體外感染細(xì)胞A549后誘導(dǎo)凋亡，黃芩苷能通過(guò)調(diào)控天門(mén)冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白家族介導(dǎo)凋亡通路的相關(guān)基因表達(dá)，對(duì)病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有干預(yù)作用，從而發(fā)揮抗病毒作用。

關(guān)鍵詞:黃芩苷;流感病毒H1N1;人肺腺癌上皮細(xì)胞A549;基因芯片;細(xì)胞凋亡;天冬半胱氨酸蛋白酶

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2015－6－5 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.010.html

顧立剛(1952－)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:中醫(yī)藥抗病毒藥理學(xué)，通訊作者，Tel: 010-64286972，E-mail: lggulg@163.com

流感病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制增殖，最終使感染細(xì)胞變性直至凋亡［1］;細(xì)胞凋亡受多種相關(guān)基

因及其蛋白調(diào)控，其中天冬半胱氨酸蛋白酶(caspase)與細(xì)胞凋亡關(guān)系最密切。黃芩苷是一種來(lái)源于植物的多羥基黃酮類(lèi)化合物，具有抗病毒［2］，抗氧化［3］，抗腫瘤［4］，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化［5］，等藥理活性。有研究報(bào)道黃芩苷能緩解炎性病理?yè)p傷，通過(guò)抑制流感病毒感染引起的轉(zhuǎn)錄因子AP-1高表達(dá)而降低炎性細(xì)胞因子的分泌水平［6］;還通過(guò)影響細(xì)胞凋亡受體途徑FAS/FASL，病毒感染小鼠肺組織細(xì)胞的凋亡系統(tǒng)［7］，從而發(fā)揮抗流感病毒感染的作用。目前，黃芩苷對(duì)感染細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制尚末完全闡明。因此，本研究以黃芩苷作用于流感病毒H1N1感染人肺腺癌A549細(xì)胞，探討其對(duì)細(xì)胞凋亡關(guān)鍵酶caspase-3和-8的基因表達(dá)水平的影響，明確黃芩苷體外對(duì)流感病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用機(jī)制，為進(jìn)一步闡明其抗流感作用機(jī)制提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1流感病毒與實(shí)驗(yàn)細(xì)胞甲型H1N1流感病毒，A1/黔防/166/85株提供為中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥所為本室長(zhǎng)期低溫保存?zhèn)溆谩＝臃N于9日齡雞胚尿囊腔連續(xù)傳代2次后，病毒原液血凝滴度為2－7，TCID50=10－3.778。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為人肺腺癌上皮細(xì)胞(A549)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物黃芩苷，黃色粉末，純度98. 2%，分子質(zhì)量446. 35，北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院關(guān)鍵技術(shù)中心王玥琦教授惠贈(zèng);陽(yáng)性對(duì)照磷酸奧司他韋膠囊(達(dá)菲)，瑞士巴塞爾豪夫·邁羅氏公司生產(chǎn)產(chǎn)品，批號(hào)B1354，分裝批號(hào)SH0037。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑McCoy’s 5A培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司，美國(guó)); 0. 25%胰酶－0. 02% EDTA(Thermo公司，美國(guó));細(xì)胞培養(yǎng)液(含胎牛血清體積分?jǐn)?shù)0. 10和含青－鏈霉素混合物體積分?jǐn)?shù)0. 01的完全McCoy’s 5A培養(yǎng)基)，細(xì)胞維持液(胎牛血清體積分?jǐn)?shù)0. 30的McCoy’s 5A培養(yǎng)基); 1. 5%雞紅細(xì)胞混懸液; PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成; M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司); qRT-PCR擴(kuò)增試劑盒(北京澤平生物技術(shù)有限公司); 100 bp DNA ladder(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞對(duì)照組(A)、H1N1感染組(B)、奧司他韋對(duì)照組(C: 0.75 mg·L－1)、黃芩苷高劑量組(F: 3. 96 mg·L－1)和黃芩苷低劑量組(G:0. 99 mg·L－1)。除正常細(xì)胞對(duì)照組外，均接種100TCID50的病毒液，每孔100 μL，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h，吸棄病毒液，輕輕加入PBS清洗2次后，分別加入上述濃度的藥物。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后棄去上清，PBS清洗1次后，加入Tris-HCl裂解液吹打，裂解液使得細(xì)胞變圓形，浮起，收集細(xì)胞裂解液置凍存管中，置－80℃冰箱凍存。

1.2.3基因芯片分析芯片實(shí)驗(yàn)由華聯(lián)生物科技股份有限公司完成。提取各組細(xì)胞的總RNA，定量并鑒定。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用熒光染料Cy3和Cys雙色熒光標(biāo)記，檢定熒光強(qiáng)度和標(biāo)記效率，芯片雜交及掃描計(jì)算探針信號(hào)在各組與模型組的強(qiáng)度比值。查找基因信息功能及生物路徑，篩選出與凋亡相關(guān)通路中密切相關(guān)的差異表達(dá)基因。各組探針訊號(hào)的強(qiáng)度比值，以log2(Ratio)表示。與H1N1感染組比較，log2(Ratio)＞1，表示明顯上調(diào)的表達(dá)基因; log2(Ratio)＜－1，表示明顯下調(diào)的表達(dá)基因。

1.2.4熒光定量PCR檢測(cè)設(shè)計(jì)GAPDH，caspase-3和caspase-8的引物序列，見(jiàn)Tab 1，提取各組細(xì)胞總mRNA后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按試劑盒說(shuō)明，進(jìn)行PCR反應(yīng)。RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。將凝膠置于紫外自動(dòng)成像系統(tǒng)，啟動(dòng)自動(dòng)分析軟件，記錄目的基因擴(kuò)增條帶的灰度值，并分別計(jì)算內(nèi)參基因GAPDH值與各樣本目的基因的比值，統(tǒng)計(jì)目的基因表達(dá)的相對(duì)量，采用2－ΔΔCT方法計(jì)算。

Tab 1　Primer sequence of GAPDH，Caspase-3 and Caspase-8

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料以±s表示，各組間差異采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1基因芯片數(shù)據(jù)分析生物學(xué)路徑及部分經(jīng)典差異表達(dá)基因通過(guò)KEGG pathway分析細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑。與細(xì)胞對(duì)照組(A)相比，H1N1感染組(B)差異表達(dá)基因Casp3、Casp7、Casp8、Casp10、TRAIL、MYD88、IL1A、和IL1B明顯上調(diào);與H1N1感染組(B)比較，奧司他韋對(duì)照組(C)對(duì)差異表達(dá)基因Casp3、Casp4和Casp8明顯下調(diào);黃芩苷高劑量組(F)對(duì)差異表達(dá)基因Casp3、Casp4、Casp6和Casp8明顯下調(diào);黃芩苷低劑量組(G)對(duì)差異表達(dá)基因Casp3、Casp4、Casp6、Casp8、IL1RAP和Cn明顯下調(diào)(Tab 2)。

Tab 2　Effects of A549 infected with influenza virus on apoptosis-related gene expression

2.2黃芩苷對(duì)病毒感染細(xì)胞中凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)mRNA表達(dá)的影響與細(xì)胞對(duì)照組(A)比較，H1N1感染組(B)Caspase-3、-8的mRNA表達(dá)均明顯升高(均P＜0. 01)。與H1N1感染組(B)比較，奧司他韋對(duì)照組(C)Caspase-3、-8的mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0. 05或P＜0. 01);黃芩苷組(F和G)的Caspase-3、-8的mRNA表達(dá)均明顯降低(P＜0. 01);該結(jié)果和基因芯片表達(dá)的結(jié)果基本相符。見(jiàn)Fig 1。

3　討論

流感病毒侵犯呼吸道其主要特征引起細(xì)胞凋亡［8］。細(xì)胞凋亡又叫細(xì)胞程序性死亡，一般被分為4個(gè)階段，其中第3階段是中心控制和效應(yīng)階段，凋亡信號(hào)激活I(lǐng)CE酶類(lèi)-caspase(半胱氨酸蛋白酶家族)，caspase執(zhí)行細(xì)胞有秩序的死亡。凋亡途徑分為caspase-8介導(dǎo)外源性途徑(死亡受體途徑)和內(nèi)源性途徑(caspase-9介導(dǎo)依賴(lài)線(xiàn)粒體途徑等)［9－10］。其中caspase-3是引發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子［11］。當(dāng)caspase-3被激活后，作用于Bcl-2家族某些成員如Bad，進(jìn)而引起宿主胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白及DNA穩(wěn)定被破壞，引起細(xì)胞凋亡。

Fig 1　Comparison of expression of casp-3 and 8 in expression among groups(n =4，±s)△△P＜0.01 vs normal;＊＊P＜0.01 vs model

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因芯片篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞對(duì)照組(A)相比，H1N1感染組(B)差異表達(dá)基因Casp3、Casp7、Casp8、Casp10、TNFSF10、MYD88、IL1A、和IL1B明顯上調(diào);這表明，流感病毒在體外感染細(xì)胞并誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡是通過(guò)外源性途徑，并且主要通過(guò)高表達(dá)TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡［12－13］。

而黃芩苷組(F和G)對(duì)與凋亡發(fā)生密切相關(guān)的差異表達(dá)基因Casp3、Casp4、Casp6和Casp8明顯下調(diào)。應(yīng)用熒光定量RT-PCR方法，檢測(cè)相關(guān)病毒感染細(xì)胞中凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示黃芩苷組(F和G)的Casp-3、-8的mRNA表達(dá)均明顯降低(P＜0. 01)。以上結(jié)果表明:黃芩苷能通過(guò)調(diào)控Casp-3、-8的表達(dá)干預(yù)流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

此外，在內(nèi)源性途徑中又包括caspase-9介導(dǎo)依賴(lài)線(xiàn)粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)參與維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、膜蛋白的合成、修飾和折疊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在凋亡信號(hào)處理過(guò)程中有重要作用［14］。鈣離子穩(wěn)態(tài)改變和蛋白質(zhì)未折疊或錯(cuò)誤折疊并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蓄積可以引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)接激活存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的caspase-12，存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的caspase-7會(huì)轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，進(jìn)一步活化caspase-12，活化的caspase-12剪切caspase-3，而引發(fā)細(xì)胞凋亡。近年來(lái)研究表明，人的caspase-4與小鼠的caspase-12為同源物，并且可以可特異性被ERS誘導(dǎo)試劑剪切激活，因而，caspase-4可能是人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路途經(jīng)凋亡相關(guān)蛋白［15］。此外，蛋白磷酸酶3催化亞基-α-亞型基因(Cn)也可作用于Bad，引起細(xì)胞凋亡。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，黃芩苷組(F和G)對(duì)與凋亡發(fā)生密切相關(guān)的差異表達(dá)基因Casp4有明顯下調(diào);黃芩苷低劑量組(G)還引起Cn的明顯下調(diào);這表明黃芩苷在對(duì)流感病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用中，還有可能通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路途徑來(lái)調(diào)控。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中沒(méi)有涉及Caspase-9的變化，因而黃芩苷可能并未通過(guò)線(xiàn)粒體依賴(lài)途徑發(fā)揮拮抗凋亡作用。

綜上所述，甲型流感病毒H1N1體外感染人肺腺癌細(xì)胞A549后誘導(dǎo)凋亡，黃芩苷能通過(guò)調(diào)控Caspase-8介導(dǎo)外源性途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路途徑的凋亡相關(guān)基因表達(dá)，從而抑制流感病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡涉及眾多基因，網(wǎng)絡(luò)狀信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控模式非常復(fù)雜，因此，黃芩苷對(duì)H1N1感染的細(xì)胞凋亡的機(jī)制有待深入的實(shí)驗(yàn)研究。

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Effect of baicalin on apoptosis induced by H1N1 virus in vitro and its mechanism

LIU Xiao-ting1，ZHANG Yi1，GU Li-gang1，WU Jun1，QIU Ze-ji1，YU Zhuo-nan1，WANG Yue-qi2
(1.Laboratory of Chinese Medicine on Viral Disease，School of Pre-clinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2.Key Technological Center of Chinese Medicine，School of
Pre-clinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Abstract:Aim To investigate the regulatory effects of baicalin on apoptosis induced by virus H1N1 in human pulmonary carcinoma cell A549.Methods The chips were used to screen the RNA samples in virus-infected A549 cells.Differentially expressed genes were selected in the pathway of apoptosis.The mRNA expressions of caspase-3 and -8 were verified by Real-Time PCR.Results With the DNA microarray，the functions of differentially expressed genes involved in apoptosis biological pathways were analyzed by Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)Pathway databases.caspase-3，-7，-8，-10，TRAIL，MYD88，IL1A and IL1B were up-regulated in virus-infected group.Oseltamivir could down-regulate gene expressions of caspase-3，-4 and -8.High-dose of baicalin could down-regulate gene expressions of caspase-3，-4，-6 and -8.Except gene expressions of above，low-

dose of baicalin could also down-regulate gene expressions of IL1RAP and Cn.Real-Time PCR experiments showed that baicalin could significantly decrease mRNA expression of caspase-3，-4，-6，-8，IL1RAP and Cn(P＜0. 01)，compared with the virus-infected group.The results also figured that the interference efficacy of low-dose baicalin was better than that of highdoses.As expected，real-time PCR data were in good agreement with the microarray assay.Conclusions Baicalin can be detected in their suppression effect of caspase-3，-4，-6，and -8 mRNA expression，so it resists against the apoptosis to fight against influenza virus in vitro.

Key words:baicalin; influenza(H1N1); human pulmonary carcinoma cell A549; gene chip; apoptosis; Caspase

作者簡(jiǎn)介:劉曉婷(1983－)，女，博士生，研究方向:中醫(yī)藥抗病毒免疫學(xué)及分子生物學(xué)機(jī)制，E-mail: siccy2-0-3@163.com;

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81173371)

收稿日期:2015－02－15，修回日期:2015－04－23

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978(2015)07－0936－04

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.010