西妥昔單抗對人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1的影響研究

韓慧芳，史健

·論著·

西妥昔單抗對人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1的影響研究

韓慧芳，史健

目的探討西妥昔單抗對人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1的影響。方法常規(guī)培養(yǎng)人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1，分別加入12．5、25．0、50．0、100．0 μg/ml濃度的西妥昔單抗，分別于24、48、72 h時在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，計算細胞抑制率;再加入DMEM培養(yǎng)基(空白對照組)、最佳細胞抑制濃度西妥昔單抗DMEM培養(yǎng)基(實驗組)，采用流式細胞技術檢測細胞周期，Westen blot法檢測細胞EGFR、β－catenin蛋白表達。結果100 μg/ ml西妥昔單抗作用24 h時對人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1的抑制率最高，西妥昔單抗對人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1的抑制作用呈時間和濃度依賴性。實驗組人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1 G0/G1期細胞比例較空白對照組增加，S期、G2/M期細胞比例較空白對照組減少。實驗組人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1的EGFR、β－catenin蛋白表達均較對照組減少。結論西妥昔單抗對人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1具有抑制作用，且呈時間和濃度依賴性，其可能作用機制為阻斷Wnt/β－catenin/EGFR信號通路。

胰腺腫瘤;西妥昔單抗;受體，表皮生長因子;分子靶向治療

胰腺癌是一種惡性度極高的惡性腫瘤，約占全部惡性腫瘤的2%，早期診斷率低，治療效果不理想，預后差，病死率接近100%，5年生存率不足5%。手術是目前胰腺癌的主要治療手段，但即使進行了根治性腫瘤切除手術，患者術后5年生存率也僅為15%～25%，而許多胰腺癌患者因多種原因無法進行手術治療，經(jīng)一線化療藥物吉西他濱治療的胰腺癌患者中位生存期僅為5．7個月，1年生存率僅為16%～19%［1］。

西妥昔單抗是由鼠表皮生長因子受體(EGFR)單抗M225可變區(qū)和人IgG1恒定區(qū)相融合而成的單克隆抗體，2004年2月被批準用于經(jīng)伊立替康治療后復發(fā)的轉移性結腸癌，體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，西妥昔單抗可抑制多種腫瘤細胞系生長［2－7］;臨床研究發(fā)現(xiàn)，西妥昔單抗能抑制人非小細胞肺癌(NSCLC)細胞增殖，聯(lián)合放療或化療(如順鉑)等具有協(xié)同抑制腫瘤作用［8］。本研究旨在探討西妥昔單抗對人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1的影響。

1 材料與方法

1．1 材料人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1獲贈于南京中國人民解放軍總醫(yī)院腫瘤中心實驗室;西妥昔單抗購自美國施貴寶公司;Annexin－V－FITC試劑盒、細胞周期檢測試劑盒、EGFR抗體、小鼠β－actin單克隆抗體購自Sigma公司;胰蛋白酶、RIPA、PMSF、aprotinin、leupeptin、Trizol購自美國Invitrogen公司; MTT、DMSO、小牛血清、PI、BCA蛋白檢測試劑盒購自四季青生物有限公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG、驢抗山羊IgG及山羊抗小鼠IgG、RNA酶、SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)低分子量標準蛋白質購自南京凱基生物公司;高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;β－catenin抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1．2 細胞復蘇、培養(yǎng)、傳代將凍存的原代人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1置于37℃水浴中快速溶解，在超凈臺內(nèi)將溶化的細胞液轉移至離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入DMEM培養(yǎng)液1 ml，吹散打勻，轉至含有10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，24 h后觀察細胞并更換培養(yǎng)液。人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1為貼壁生長細胞，換液時間為2～3 d，傳代時間為3～5 d。

1．3 細胞抑制率取處于對數(shù)生長期的細胞，采用胰蛋白酶消化，將DMEM培養(yǎng)基細胞懸液濃度調整為5× 105個/ml;采用96孔板，每孔加細胞懸液100 μl，每孔細胞數(shù)約為4 000個;5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育細胞貼壁后，分別加入12．5、25．0、50．0、100．0 μg/ml濃度的西妥昔單抗，每個濃度組設5個復孔;繼續(xù)孵育，分別于24、48、72 h時在顯微鏡下觀察細胞形態(tài);吸去培養(yǎng)液，每孔加100 μl含MTT的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;吸去含MTT的DMEM培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μl/每孔，搖床低速振蕩10 min，充分溶解結晶物;采用酶聯(lián)免疫檢測儀測量490 nm波長處各孔吸光度值。同時設置調零孔，即空白對照組。采用MTT法檢測不同濃度、不同作用時間西妥昔單抗對胰腺癌細胞增殖SW1990、PANC－1的影響，計算細胞抑制率，細胞抑制率=(1－實驗組平均吸光度值)/空白對照組平均吸光度值×100%。

1．4 細胞周期取處于對數(shù)生長期的細胞，采用胰蛋白酶消化，將DMEM培養(yǎng)基細胞懸液濃度調整為5× 105個/ml;采用6孔板，每孔加細胞懸液2 ml;培養(yǎng)箱孵育細胞貼壁后，加入DMEM培養(yǎng)基(空白對照組)、最佳抑制細胞濃度西妥昔單抗培養(yǎng)基孵育48 h;收集懸浮及貼壁細胞放置于離心管中，1 200 r/min離心5 min; PBS洗滌3次，將細胞濃度調整為1×105個/ml，采用70%乙醇固定，4℃保存24 h;1 200 r/min離心5 min后收集細胞，PBS洗滌3次;加入RnaseA 100 μl，37℃水浴30 min;加PI 400 μl染色混勻，4℃避光30 min;上機檢測，采用流式細胞技術檢測細胞周期，記錄488 nm波長處紅色熒光。

1．5 細胞EGFR、β－catenin蛋白表達取處于對數(shù)生長期的細胞，采用胰蛋白酶消化，將DMEM培養(yǎng)基細胞懸液濃度調整為5×105個/ml;孵育細胞貼壁后分別加入DMEM培養(yǎng)基(空白對照組)、最佳細胞抑制濃度西妥昔單抗DMEM培養(yǎng)基(實驗組);5%CO2、37℃孵育48 h;分別加入胰蛋白酶1 ml進行消化，37℃、5%CO2孵育3 min后停止消化;將細胞液轉移至10 ml離心管，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗滌3次;采用PBS 1 ml混勻，沉淀，移入1．5 ml EP管，3 000 r/min高速離心5 min，棄上清液，－70℃保存;采用RIPA細胞裂解液裂解細胞，設2個復孔，標準曲線5個孔，每孔加入200 μl工作液;配成BCA工作液(A∶B=50∶1);稀釋待測蛋白;每孔加入25 μl蛋白;37℃溫箱孵育2 h;標準蛋白曲線分別為1 mg/ml、750 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml、125 μg/ml、50 μg/ml;變性蛋白，把蛋白樣品和2×SDS加樣緩沖液等體積配置混合，100℃、5 min，之后冰浴10 min，－20℃保存;SDS－PAGE(聚丙烯酰胺)凝膠電泳分離蛋白(分離膠含TEMED 2 μl、10%過硫酸銨0．05 ml、10% SDS 0．05 ml、Tris 1．3 ml、丙烯酰胺2 ml、消毒水1．6 ml，積層膠含TEMED 3 μl、10%過硫酸銨0．03 ml、10%SDS 0．03 ml、Tris 0．038 ml、丙烯酰胺0．5 ml、消毒水2．1 ml);蛋白質電轉移、麗春紅染色，加抗體，顯色，以β－actin作為參照，采用Image J凝膠圖像分析軟件進行半定量分析，采用Westen blot法檢測細胞EGFR、β－catenin蛋白表達。

2 結果

2．1 細胞抑制率12．5、25．0、50．0、100．0 μg/ml西妥昔單抗作用24 h時對人胰腺癌細胞SW1990的抑制率分別為70．9%、86．6%、114．9%、142．4%，作用48 h時對人胰腺癌細胞SW1990的抑制率分別為－22．8%、7．3%、54．2%、63．1%，作用72 h時對人胰腺癌細胞SW1990的抑制率分別為－14．2%、26．7%、60．8%、76．3%(見圖1);作用24 h時對人胰腺癌細胞PANC－1的抑制率分別為53．9%、65．9%、99．4%、108．3%，作用48 h時對人胰腺癌細胞PANC－1的抑制率分別為－14．3%、26．7%、60．8%、76．3%，作用72 h時對人胰腺癌細胞PANC－1的抑制率分別為－20．0%、1．8%、40．0%、61．8%(見圖2)。100 μg/ml西妥昔單抗作用24 h時對人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1的抑制率最高，西妥昔單抗對人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1的抑制作用呈時間和濃度依賴性。

2．2 細胞周期實驗組人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1 G0/G1期細胞比例較空白對照組增加，S期、G2/M期細胞比例較空白對照組減少(見圖3～4)。

2．3 細胞EGFR、β－catenin蛋白表達實驗組人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1 EGFR、β－catenin蛋白表達均較空白對照組減少(見圖5～6)。

圖1 不同濃度不同作用時間西妥昔單抗對人胰腺癌細胞SW1990的抑制作用Figure 1 Inhibiting effect of cetuximab on human pancreatic cancer cell SW1990 at different densities and different time

圖2 不同濃度不同作用時間西妥昔單抗對人胰腺癌細胞PANC－1的抑制作用Figure 2 Inhibiting effect of cetuximab on human pancreatic cancer cell PANC－1 at different densities and different time

圖3 100 μg/ml西妥昔單抗作用24 h時對人胰腺癌細胞SW1990細胞周期的影響Figure 3 Effect of cetuximab on cell cycle of human pancreatic cancer cell SW1990 at density of 100 μg/ml and 24 hour

圖4 100 μg/ml西妥昔單抗作用24 h時對人胰腺癌細胞PANC－1細胞周期的影響Figure 4 Effect of cetuximab on cell cycle of human pancreatic cancer cell PANC－1 at density of 100 μg/ml and 24 hour

圖5 100 μg/ml西妥昔單抗作用24 h時對人胰腺癌細胞SW1990 EGFR、β－catenin蛋白表達的影響Figure 5 Effect of cetuximab on EGFR，β－catenin protein expression of human pancreatic cancer cell SW1990 at density of 100 μg/ml and 24 hour

圖6 100 μg/ml西妥昔單抗作用24 h時對人胰腺癌細胞PANC－1 EGFR、β－catenin蛋白表達的影響Figure 6 Effect of cetuximab on EGFR，β－catenin protein expression of human pancreatic cancer cell PANC－1 at density of 100 μg/ml and 24 hour

3 討論

EGFR突變常見于多種惡性腫瘤，且存在EGFR突變的惡性腫瘤患者預后不佳［9］，胰腺癌患者EGFR突變率為30%～95%。EGFR基因位于7號染色體短臂上，胰腺癌患者EGFR突變與7號染色體數(shù)量或結構變異有關［10］。2004年美國食品和藥物管理局(FDA)批準美國ImClone Systems公司與施貴寶公司聯(lián)合研發(fā)的一種EGFR特異性單克隆抗體——西妥昔單抗上市。西妥昔單抗由鼠抗EGFR抗體和人IgG1重鏈和輕鏈的恒定區(qū)組成，其一方面通過與表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子α(TGF－α)競爭性結合腫瘤細胞表面EGFR而阻斷EGF、TGF－α等配體對EGFR的酪氨酸磷酸化作用，另一方面與EGFR發(fā)生特異性結合并介導EGFR自身降解，下調其表達，阻斷EGFR的酪氨酸磷酸化作用及信號傳導途徑，可抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡。

臨床前研究表明，西妥昔單抗能夠有效抑制各種EGFR過表達腫瘤細胞的增殖，包括體外培養(yǎng)腫瘤細胞和移植模型中腫瘤細胞。研究表明，西妥昔單抗聯(lián)合放療較單一使用西妥昔單抗或放療更能促進頭頸部腫瘤細胞凋亡，更好地抑制腫瘤細胞增殖［11－12］;西妥昔單抗對人肝癌細胞具有有效的體內(nèi)外抑制作用［13］，且西妥昔單抗對人肝癌細胞的增殖抑制作用呈劑量依賴性。本研究結果顯示，100 μg/ml西妥昔單抗作用24 h時對人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1的抑制率最高，西妥昔單抗對人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1的抑制作用呈時間和濃度依賴性，為臨床應用西妥昔單抗治療胰腺癌提供了實驗依據(jù)。

目前研究認為，EGFR突變與惡性腫瘤發(fā)展階段有關，但其對患者生存期的影響仍存在爭議［14－15］。幾乎所有胰腺癌患者均存在1個KRAS致癌基因突變點［16－18］，KRAS突變作為EGFR拮抗劑治療的預測信號已在結腸直腸癌研究中證實，但其在胰腺癌中的預測價值尚未被研究證實。本研究結果顯示，實驗組人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1 G0/G1期細胞比例較空白對照組增加，S期、G2/M期細胞比例較空白對照組減少，且人胰腺癌細胞SW1990、PANC－1的EGFR、βcatenin蛋白表達均較對照組減少，提示其作用機制可能是通過阻斷Wnt/β－catenin/EGFR信號通路、抑制EGFR和β－catenin蛋白表達而抑制胰腺癌細胞增殖。

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ObjectiveTo investigate the impact of cetuximab on human pancreatic cancer cells SW1990 and PANC－1．MethodsHuman pancreatic cancer cells SW1990 and PANC－1 were routinely cultivated，and then given different concentrations of cetuximab(12．5，25．0，50．0，100．0 μg/ml)，and then observed the cell morphology after 24 hours，48 hours，72 hours，respectively，calculated the cell inhibition rate．After that，DMEM culture medium(control group)and the best cell inhibition concentration of cetuximab(experiment group)was given respectively，flow cytometry was used to detect the cell cycle，and Westen blot method was used to detect the protein expressions of EGFR and β－catenin．ResultsThe best cell concentration of cetuximab to inhibit the proliferation of human pancreatic cancer cells SW1990 and PANC－1 was 100 μg/ml，and the best acting time was 24 hours，it was time and concentration dependent．G0/G1phase cell proportion of experiment group was higher than that of control group，but S phase and G2/M phase cell proportion were lower．The protein expressions of EGFR and β－catenin of experiment group were lower than those of control group．ConclusionCetuximab has certain inhibiting effect on human pancreatic cancer cells SW1990 and PANC－1，and it is time and concentration dependent;its possible mechanism is interdict the Wnt/β－catenin/EGFR signal pathway．

Pancreatic neoplasms;Cetuximab;Receptor，epidermal growth factor;Molecular targeted therapy

R 735．9

A

10．3969/j．issn．1008－5971．2015．01．014

2014－08－10;

2014－12－20)

(本文編輯:鹿飛飛)

·用藥指導·

050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(韓慧芳，史健);邯鄲市第二醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(韓慧芳)

韓慧芳，史?。魍孜魡慰箤θ艘认侔┘毎鸖W1990、PANC－1的影響研究［J］．實用心腦肺血管病雜志，2015，23(1):45－48．［www．syxnf．net］

Han HF，Shi J．Impact of cetuximab on human pancreatic cancer cells SW1990 and PANC－1［J］．Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(1):45－48．

Impact of Cetuximab on Human Pancreatic Cancer Cells SW1990 and PANC－1HAN Hui－fang，SHI Jian．Department of Oncology，the Fourth Hospital of Hebei Medical Liniversity，Shijiazhuang 050011，China

【編者按】本期“用藥指導”欄目圍繞急診重癥監(jiān)護室肺部真菌感染、住院患者常見革蘭陽性球菌感染、慢性阻塞性肺疾病并發(fā)肺部感染情況及其耐藥情況展開，結合各地方、各醫(yī)院實際情況及具體數(shù)據(jù)，總結了其發(fā)病特點、高危因素、發(fā)展變化、病原菌分布等，這對促進臨床合理用藥、規(guī)范使用抗菌藥物、減少細菌耐藥等均具有一定指導意義，敬請關注!