2017年紹興地區(qū)106株非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果分析

金法祥 陶學(xué)芳 王華鈞 許文芳 陳雪芳

非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)是一種環(huán)境生長(zhǎng)菌，目前已鑒別出175種和13個(gè)亞種 (http://www.bacterio.net/mycobacterium．html),對(duì)人體具有致病性的有40余種[1]。NTM 可以侵犯人體肺臟、淋巴結(jié)、骨骼、關(guān)節(jié)、皮膚和軟組織等，并可引起全身播散性疾病。NTM感染肺臟，引起肺部病變稱為非結(jié)核分枝桿菌肺病。NTM感染的高危人群主要是慢性呼吸道疾病患者(慢性阻塞性肺疾病、肺結(jié)核殘余空洞、塵肺、支氣管擴(kuò)張等)、老年人和免疫功能缺陷者，特別是艾滋病(AIDS)患者。近年來(lái)，人口老齡化及其免疫力降低，各種免疫抑制劑的使用、AIDS的流行及醫(yī)原性感染機(jī)會(huì)增多、環(huán)境污染等諸多因素導(dǎo)致NTM 病呈快速增多趨勢(shì)[1]，并已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。NTM對(duì)人致病，90%以上發(fā)生NTM肺??；美國(guó)研究數(shù)據(jù)顯示，65歲以上的老年人肺部NTM感染的年發(fā)病率由1997年的20/10萬(wàn)增加到2007年的47/10萬(wàn)[2]。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的不斷提高、NTM菌種鑒定技術(shù)的進(jìn)步，以及免疫抑制劑使用等因素，臨床分離培養(yǎng)到NTM及其相關(guān)的疾病呈增多趨勢(shì)[3-4]。本研究對(duì)紹興地區(qū)2017年臨床分離的972株分枝桿菌進(jìn)行菌種鑒定，了解本地區(qū)NTM的優(yōu)勢(shì)菌群，為NTM病的診療提供科學(xué)依據(jù)。

資料和方法

一、菌株來(lái)源

2017年紹興市立醫(yī)院(現(xiàn)為紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院)采用BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀，紹興市中心醫(yī)院、諸暨市人民醫(yī)院、上虞市人民醫(yī)院、新昌縣人民醫(yī)院采用BACTEC MGIT 320全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀，共液體培養(yǎng)分離分枝桿菌972株。結(jié)核分枝桿菌(MTB)標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC27294)來(lái)源于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比室傳代培養(yǎng)。胞內(nèi)分枝桿菌(ATCC13950)、鳥分枝桿菌(ATCC25291)、堪薩斯分枝桿菌(ATCC12478)菌株來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。

二、試劑、儀器與操作

(一)試劑、儀器

分枝桿菌液體培養(yǎng)基由美國(guó)BD公司提供，結(jié)核分枝桿菌抗原檢測(cè)試劑盒(膠體金法)購(gòu)自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司，分枝桿菌菌種鑒定試劑盒由北京博奧生物集團(tuán)有限公司提供。

日本奧林巴斯顯微鏡，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司低溫高速離心機(jī)，上海Heal Force B2生物安全柜，杭州創(chuàng)新科技公司PCR擴(kuò)增儀，HybSet 微陣列芯片雜交儀、芯片洗干儀、微陣列芯片掃描儀(LuxScan 10K-B)均由北京博奧生物集團(tuán)有限公司提供。

(二)操作方法

1.核酸提?。簩⒑怂崽崛」懿捎秒x心半徑 8 cm，12 000 r/min 離心 1 min，備用；將1 ml NTM菌液加入到1.5 ml 的離心管中，離心半徑 8 cm，12 000 r/min 離心 10 min，棄上清液；向離心管中加入 1 ml 0.9%氯化鈉溶液，渦旋振蕩混勻，離心半徑 8 cm，12 000 r/min 離心 10 min，棄上液清；用移液器將離心管中剩余液體吸干；每個(gè)離心管中加入 50 μl NTM菌種鑒定核酸提取液，用移液器吹吸沉淀，將液體和沉淀一起轉(zhuǎn)移到核酸提取管中，渦旋充分振蕩混勻5 min；將核酸提取管置于 95 ℃金屬浴10 min；離心半徑 8 cm，12 000 r/min 離心 1 min，備用。

2.PCR擴(kuò)增：取出PCR反應(yīng)管，采用離心半徑 8 cm，5000 r/min 離心2 s，將PCR擴(kuò)增試劑按18 μl/管分裝，加入已提取的待測(cè)標(biāo)本DNA 2 μl，同時(shí)取2個(gè)PCR反應(yīng)管分別加入MTB陽(yáng)性質(zhì)控品和MTB陰性質(zhì)控品。擴(kuò)增條件：37 ℃ 5 min， 94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s×35次，94 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s×10次，72 ℃延伸10 min，保持4 ℃。

3.芯片雜交：PCR 產(chǎn)物置于 PCR 儀中 95 ℃變性 5 min， 隨后置于冰水混合物中5 min；按照 9 μl雜交液、6 μl PCR 產(chǎn)物的比例配制雜交混合液；在基因微陣列芯片雜交盒的底部加入 200 μl蒸餾水，將托架放入盒體內(nèi)的2個(gè)定位柱之間，芯片正面向上，蓋片4個(gè)凸臺(tái)向下蓋在芯片上；吸取 13.5 μl雜交混合液經(jīng)加樣孔加入芯片點(diǎn)陣中，蓋好盒蓋并用金屬條密封雜交盒；將雜交盒平穩(wěn)放入雜交儀托盤，以使托盤平衡；運(yùn)行分枝桿菌菌種鑒定雜交程序，雜交條件為 50 ℃雜交 120 min。

4. 芯片洗滌：根據(jù)芯片數(shù)量配制洗滌液Ⅰ和洗滌液Ⅱ，體積以洗滌時(shí)能完全浸沒芯片為準(zhǔn)。洗滌液Ⅰ：依次將蒸餾水、20×SSC(saline sodium citrate)、10%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS) 按 88∶10∶2 的比例配置 500 ml并混合；洗滌液Ⅱ：依次將蒸餾水、20×SSC 按 99∶1 的比例配置1000 ml并混合；預(yù)熱芯片洗干儀，待儀器屏幕顯示“請(qǐng)放入芯片進(jìn)行洗滌”的對(duì)話框時(shí)即可放入完成雜交的芯片，運(yùn)行分枝桿菌菌種鑒定芯片洗滌程序進(jìn)行洗滌。

5. 掃描判讀：使用LuxScanTM10微陣列芯片掃描儀。開啟掃描儀，運(yùn)行分枝桿菌菌種鑒定芯片判讀系統(tǒng)，點(diǎn)擊激光控制按鈕，預(yù)熱 10 min；輸入芯片編號(hào)、標(biāo)本編號(hào)等相關(guān)信息； 將芯片放入掃描儀插槽內(nèi)，點(diǎn)擊“開始檢測(cè)”按鈕進(jìn)行芯片掃描，結(jié)果將在屏幕上顯示并自動(dòng)保存；1張芯片掃描完畢后繼續(xù)重復(fù)下一張芯片的掃描；完成全部操作后，關(guān)閉激光，退出軟件，關(guān)閉掃描儀，詳細(xì)記錄判讀結(jié)果和芯片信息。

三、分枝桿菌菌種初步鑒定

分枝桿菌培養(yǎng)采用液體快速培養(yǎng)法，BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀報(bào)陽(yáng)性，培養(yǎng)液經(jīng)涂片抗酸染色確認(rèn)，為分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性。分枝桿菌陽(yáng)性菌液初步鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和 NTM，采用MTB抗原檢測(cè)試劑(膠體金法)。MTB：MTB抗原檢測(cè)陽(yáng)性；NTM：MTB抗原檢測(cè)陰性。

分枝桿菌菌種初步鑒定結(jié)果：紹興地區(qū)2017年972株分枝桿菌臨床分離株中，經(jīng)菌種初步鑒定866株為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(占89.09%)，106株為 NTM(占10.91%)。106株NTM中，91株分離于痰液標(biāo)本，14株分離于肺泡灌洗液，1株分離于膿液。

結(jié) 果

對(duì)確認(rèn)的106株NTM臨床分離株采用DNA微陳列芯片法進(jìn)行菌種鑒定，采用微陣列芯片掃描儀和相應(yīng)軟件進(jìn)行信號(hào)讀取，NTM菌株都獲得一張清晰的芯片圖，以下列舉胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、淺黃分枝桿菌的芯片圖(圖1)。

通過(guò)DNA微陣列芯片法進(jìn)行菌種鑒定，106株NTM菌株共有14個(gè)菌種，菌種數(shù)量位列前5位的是胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜-膿腫分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌(表1)。

討 論

近年來(lái)，結(jié)核病疫情呈下降趨勢(shì)而NTM病的患病率卻逐年上升，甚至可能超過(guò)結(jié)核病的發(fā)病率和患病率[5-6]。加拿大Marras等[7]研究顯示，在安大略省NTM患病率從1997年的9.1/10萬(wàn)增加到2003年的14/10萬(wàn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)安大略省的結(jié)核病患病率。在日本，NTM患病率由1971年的0.28/10萬(wàn)上升到1997年的3.52/10萬(wàn)[8]。我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)NTM病的發(fā)病率從2000年的2.7/10萬(wàn)增至2008年的10.2/10萬(wàn)，NTM病占所有分枝桿菌病的比率從2000年的32.3%升至2008年的49.8%，而結(jié)核病的比率從2000年的67.7%降至2008年的50.2%[9]。NTM在我國(guó)的抗酸染色陽(yáng)性的分枝桿菌標(biāo)本中的檢出率呈上升趨勢(shì)[10]。

圖1 列舉DNA微陣列芯片法對(duì)4種NTM菌種進(jìn)行鑒定的芯片圖。從左至右分別為胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)、鳥分枝桿菌(M.avium)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、淺黃分枝桿菌(M.gilvum)

表1 106株 NTM 采用DNA微陣列芯片法

目前，在我國(guó)部分基層醫(yī)院，抗酸染色涂片檢查是唯一的用來(lái)診斷MTB感染的方法，可能有不少NTM的感染者被誤診為MTB感染并接受了錯(cuò)誤的抗結(jié)核藥物治療[11],既往曾經(jīng)對(duì)MTB具有診斷指導(dǎo)性的抗酸染色,不能鑒別MTB與NTM[12]。NTM致病的顯著特點(diǎn)是很強(qiáng)的機(jī)會(huì)性，人體存在NTM致病的很多機(jī)會(huì)或條件導(dǎo)致繼發(fā)NTM肺病，如老年人免疫力下降、慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、慢性阻塞性肺疾病、惡性腫瘤、血液透析、器官移植，以及使用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等使免疫功能降低的藥物、AIDS患者并發(fā)的肺部感染中，NTM肺病占第3位，僅次于卡氏肺孢子蟲肺炎和巨細(xì)胞病毒肺炎[11]，繼發(fā)NTM感染是導(dǎo)致這些人群預(yù)后差和死亡的重要因素。NTM肺病多發(fā)生于結(jié)構(gòu)性肺部疾病的基礎(chǔ)上，如慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核、塵肺、肺囊性纖維化等，NTM肺病患者的肺通氣功能減退較肺結(jié)核更為明顯，NTM肺病病程較長(zhǎng)、肺組織破壞較重，加上各種并發(fā)癥的存在，因此NTM感染是慢性呼吸系統(tǒng)疾病患者的噩夢(mèng)[13]。

我國(guó)歷次的全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，NTM的分離率從1990年的4.9%持續(xù)增高[3]。隨著結(jié)核病疫情逐步得到控制，NTM感染在分枝桿菌疾病中所占的比例將逐步提高[4]。NTM分離率各地報(bào)道上海為5.9%，福建為10.2%，廣東為19.3%[14-16]。本研究結(jié)果顯示，紹興市共轄三縣三區(qū)，此次入選患者來(lái)源于我市的6個(gè)行政區(qū)，以紹興市區(qū)的柯橋區(qū)和越城區(qū)的NTM就診患者為主，就診患者中，絕大多數(shù)為住院臨床診斷為結(jié)核病的患者。上述研究表明，NTM 的流行有著顯著的區(qū)域性差異。本研究NTM菌種鑒定采用基因芯片法，又稱 DNA微陣列芯片法?；蛐酒ㄨb定NTM全流程只需要8 h，簡(jiǎn)化了操作，具備鑒定臨床常見NTM菌種的能力，能夠有效解決臨床NTM感染診斷的大部分問(wèn)題。

NTM 的感染發(fā)生率和菌種分布存在著地域差異，且與氣候環(huán)境相關(guān)。具有南方多于北方，氣候溫和地區(qū)多于氣候寒冷地區(qū)，沿海地區(qū)多于內(nèi)陸地區(qū)的特點(diǎn)。紹興地處浙江省北部，緊靠寧波沿海地區(qū)，氣候溫和。2017年NTM感染患者例數(shù)呈增加趨勢(shì)，且NTM菌種種類達(dá)14種。根據(jù)寧波地區(qū)報(bào)道，93株NTM中以胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和戈登分枝桿菌為主[17]；而湖南省報(bào)道的51株 NTM 菌株中以胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌和膿腫分枝桿菌為主[18]。本次研究結(jié)果顯示，2017年紹興地區(qū)NTM菌種以胞內(nèi)分枝桿菌為主，其次為鳥分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌，這三類均屬于緩慢生長(zhǎng)分枝桿菌。胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌系Ⅲ群NTM， 屬于不產(chǎn)色素緩慢生長(zhǎng)群；菌落均不產(chǎn)生色素，或呈灰白色、淡黃色；鳥-胞內(nèi)型復(fù)合群是NTM肺病最常見的致病菌，尤其常見于免疫功能低下者[19-22]。

臨床上，MTB與 NTM 引起的肺病、淋巴結(jié)炎等疾病常難以鑒別診斷，很容易誤診。大量研究及臨床治療經(jīng)驗(yàn)表明，多數(shù)傳統(tǒng)抗結(jié)核藥物對(duì) NTM 病很少或沒有抗菌活性，為避免臨床對(duì)NTM 感染患者給予常規(guī)抗結(jié)核藥物治療而延誤病情，準(zhǔn)確快速的分枝桿菌菌種鑒定對(duì)NTM病的早期診斷和治療非常重要。目前，國(guó)內(nèi)還沒有統(tǒng)一的針對(duì)NTM的藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)的方法，多數(shù)醫(yī)院沒有開展針對(duì)NTM 的藥敏試驗(yàn)，而NTM 病的治療常采用經(jīng)驗(yàn)治療。因此，NTM 菌種鑒定就顯得更為重要，以便有針對(duì)性地制訂化學(xué)治療方案。