棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因GhPRP10的克隆及其功能分析

石 淼,李艷軍,劉永昌,張新宇,薛 飛*,孫 杰

(1 石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,新疆石河子 832003;2 石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/新疆兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832003)

棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因GhPRP10的克隆及其功能分析

石 淼1,李艷軍2,劉永昌2,張新宇2,薛 飛2*,孫 杰2

(1 石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,新疆石河子 832003;2 石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/新疆兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832003)

利用電子序列拼接結(jié)合RT-PCR技術(shù),從12DPA(開花后天數(shù))棉纖維中克隆到1個(gè)編碼富含脯氨酸蛋白(PRPs)基因,命名為GhPRP10(登錄號(hào)KP036633)。GhPRP10基因開放閱讀框?yàn)?84 bp,編碼228個(gè)氨基酸,其中脯氨酸(Pro)含量為34.6%。序列分析發(fā)現(xiàn)GhPRP10蛋白具有N端信號(hào)肽和富含脯氨酸區(qū)域,屬于第一類PRPs。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)結(jié)果顯示,GhPRP10在棉纖維組織中優(yōu)勢(shì)表達(dá),在纖維發(fā)育過程中的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),在18DPA纖維中表達(dá)量最高。利用Gateway技術(shù)構(gòu)建植物過量表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入煙草BY-2懸浮細(xì)胞,表型觀察和細(xì)胞長(zhǎng)度測(cè)量結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)GhPRP10基因細(xì)胞比野生型細(xì)胞顯著增長(zhǎng)。根據(jù)該基因的組織表達(dá)特征和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表型分析,推測(cè)GhPRP10基因在纖維伸長(zhǎng)和次生壁合成過程中發(fā)揮作用。

棉花;纖維;富含脯氨酸蛋白;BY-2煙草懸浮細(xì)胞

棉花是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,中國(guó)是世界上最大的棉花生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)。棉纖維是棉花的主產(chǎn)品,其品質(zhì)優(yōu)劣直接決定紡織品的質(zhì)量和效益。棉纖維是由胚珠表皮細(xì)胞發(fā)育而成的單細(xì)胞,其伸長(zhǎng)率和最終長(zhǎng)度遠(yuǎn)超過其它植物細(xì)胞,是研究植物細(xì)胞伸長(zhǎng)和細(xì)胞壁生物合成的理想模型[1]?？寺∶蘩w維發(fā)育相關(guān)基因并解析其發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制,對(duì)改良棉纖維品質(zhì)具有十分重要的理論意義[2]。

細(xì)胞壁是植物細(xì)胞特有的結(jié)構(gòu),它可以保護(hù)細(xì)胞并決定細(xì)胞的大小和形狀,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用[3]。植物細(xì)胞壁中除含有多糖外,還含有大量的蛋白成分。細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白主要分為4類[4]:富含脯氨酸蛋白(proline-rich Proteins,PRPs)、富含甘氨酸蛋白(glycine-rich proteins,GRPs)、伸展蛋白和阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactan proteins,AGPs)。PRPs是一類富含脯氨酸和羥脯氨酸的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白,在植物中廣泛存在,前人已從大豆、小麥、玉米、水稻等植物中分離到多個(gè)編碼該蛋白的基因[5-8],這些基因在逆境脅迫[9-12]和激素[13-14]響應(yīng)的過程中發(fā)揮重要作用。此外,PRPs不僅能夠決定細(xì)胞形態(tài),而且能夠調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育,AtPRP3[15]主要在擬南芥的根毛基部和正在伸長(zhǎng)的根尖中表達(dá),該基因突變后導(dǎo)致根毛形態(tài)異常、分枝發(fā)生變化,突變體植株的根毛顯著減少,表明該基因參與根毛的形態(tài)建成。AtPRP4[16]在擬南芥的葉、莖、花、長(zhǎng)角果和根形成的早期階段表達(dá),該基因突變體植株的側(cè)根減少,葉片變小,種子生長(zhǎng)受到抑制。AtPRPL1[17]僅在擬南芥的根和毛狀體細(xì)胞中表達(dá),將AtPRPL1基因敲除后使擬南芥根毛明顯變短,該基因過量表達(dá)后能夠促進(jìn)根毛的伸長(zhǎng)。

目前人們已從棉纖維細(xì)胞中分離出多個(gè)優(yōu)勢(shì)或特異表達(dá)的PRPs基因[18-22],例如GhPRP1、GhPRP2、GhPRP3、GhPRP5等基因。過量表達(dá)GhPRP5的轉(zhuǎn)基因擬南芥生長(zhǎng)遲緩,葉表皮細(xì)胞變小,植株矮小[23]。雖然該類基因在棉纖維中大量存在,但功能研究仍較少,因此研究這類蛋白在纖維發(fā)育過程中的功能對(duì)明確纖維發(fā)育機(jī)制至關(guān)重要。本研究從棉纖維中克隆到1個(gè)新的PRP基因,命名為GhPRP10,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析該基因在棉花不同組織中的表達(dá)情況,構(gòu)建植物過量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化野生煙草BY-2懸浮細(xì)胞,對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草懸浮細(xì)胞的表型變化進(jìn)行觀察,為進(jìn)一步闡明該基因在棉纖維細(xì)胞發(fā)育過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

棉花(GossypiumhirsutumL.)品種‘新陸早33號(hào)’由石河子大學(xué)棉花研究所提供。將該材料播種于石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)田,按常規(guī)進(jìn)行農(nóng)事作業(yè)和田間管理,在盛花期掛牌標(biāo)記棉鈴,按3、6、9、12、15、18、21、24、27 DPA(開花后天數(shù))采集棉鈴,室內(nèi)剝?nèi)±w維,液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。

室內(nèi)取‘新陸早33號(hào)’種子剝?nèi)シN皮,將種仁浸泡于0.1% HgCl2溶液中消毒10 min,用無菌水反復(fù)沖洗3～5次,播種于1/2 MS固體培養(yǎng)基,28 ℃暗培養(yǎng)4 d,然后進(jìn)行水培。待長(zhǎng)出真葉后,取其根、莖、真葉,花在田間植株上采集,上述材料液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱,用于總RNA提取。

野生型煙草(Nicotianatabacum)BY-2懸浮細(xì)胞用LS固體培養(yǎng)基每15 d繼代1次進(jìn)行保存。

1.2 方 法

1.2.1 棉花總RNA提取和第一鏈cDNA合成 棉花根、莖、葉、花和不同發(fā)育時(shí)期纖維的總RNA提取采用改良CTAB法[24],使用Reverse Transcriptase M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和引物Oligo dT(T18)將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,具體步驟按照說明書進(jìn)行。

1.2.2GhPRP10基因克隆 以棉花PRP相關(guān)EST序列BQ410667為探針序列,使用NCBI BLASTn對(duì)棉花EST序列進(jìn)行比對(duì),對(duì)同源性高的EST序列利用DNASTAR軟件進(jìn)行序列拼接,得到一個(gè)新的PRP相關(guān)基因序列,長(zhǎng)度為864 bp。通過ORF finder預(yù)測(cè)其開放閱讀框(ORF),設(shè)計(jì)擴(kuò)增該ORF特異性引物ORF1-F和ORF1-R(表1),以12DPA棉纖維cDNA為模板,使用Primer STAR高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增,程序?yàn)?8 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性10 s,54 ℃退火15 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),回收PCR產(chǎn)物連接到載體pGEM-T easy上,熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽性克隆經(jīng)過PCR和酶切雙重驗(yàn)證,將質(zhì)粒送至北京六合華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 PCR擴(kuò)增引物

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用在線軟件InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析,預(yù)測(cè)GhPRP10的跨膜信號(hào)肽。用DNAMAN和Clustal X進(jìn)行多重序列比對(duì)及同源性比對(duì),采用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)GhPRP10基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物PRPS-F和PRPS-R(表1),分別以棉花根、莖、葉、花和不同時(shí)期棉纖維為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,反應(yīng)過程在羅氏Light Cycler 480儀器上進(jìn)行。內(nèi)參基因?yàn)閁BI(GenBank序列號(hào)為AY117057),根據(jù)其序列設(shè)計(jì)引物UBI-F和UBI-R(表1),產(chǎn)物大小為210 bp。反應(yīng)體系(10 μL)包含上、下游引物各0.2 μL,SYBR Premix ExTaq5 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O 3.6 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù):94 ℃預(yù)變性1 min,94 ℃變性15 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù),結(jié)果按照2-△Ct法處理數(shù)據(jù),并制作柱狀圖顯示該基因在棉花不同組織中的表達(dá)情況。

1.2.5 植物過量表達(dá)載體構(gòu)建及煙草BY-2懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 利用Gateway同源重組原理[25]構(gòu)建GhPRP10植物過量表達(dá)載體pGWB17-GhPRP10,構(gòu)建過程按照Invitrogen公司的pENTRTMDirectional TOPO?Cloning Kits和Gateway?LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix試劑盒進(jìn)行。采用農(nóng)桿菌電擊轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404的菌株中。根據(jù)吳科瀛的方法將植物過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草BY-2懸浮細(xì)胞[26],獲得轉(zhuǎn)基因抗性細(xì)胞團(tuán)。挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的抗性細(xì)胞團(tuán)繼代到新鮮篩選培養(yǎng)基中,每15 d繼代1次,去除嵌合的野生細(xì)胞,繼代4次后得到黃色純合體轉(zhuǎn)基因系。使用Trizol試劑盒提取總RNA以O(shè)RF1-F和ORF1-R為引物進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。取適量轉(zhuǎn)基因細(xì)胞用含有抗生素的LS液體培養(yǎng)基搖培3～4 d后,用熒光素(FDA)進(jìn)行染色后在熒光顯微鏡下連續(xù)6 d進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察拍照。使用Image J軟件對(duì)野生型和3個(gè)轉(zhuǎn)基因系細(xì)胞中分別選取的40個(gè)細(xì)胞的長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 17.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhPRP10基因克隆與序列分析

以12DPA棉纖維細(xì)胞cDNA為模板,利用引物ORF1-F和ORF1-R進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增拼接后的PRP基因ORF,獲得該基因序列大小為687 bp(圖1),將擴(kuò)增序列與拼接序列進(jìn)行比對(duì),一致性達(dá)到100%。序列分析發(fā)現(xiàn)該基因共編碼228個(gè)氨基酸,其中脯氨酸占34.6%,蘇氨酸占13.2%,絲氨酸占13.2%,分子量為22 209.5 kD,等電點(diǎn)9.75。蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)(圖2),該基因編碼的蛋白屬于第一類PRPs,第1～23個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽區(qū)域,有一個(gè)富含脯氨酸重復(fù)基序的區(qū)域,該區(qū)域含有15個(gè)分散的A(or S)T(or S)PPP基序,7個(gè)XPP基序和2個(gè)無規(guī)律的基序TQPPP和TSPPP,將該基因命名為GhPRP10。

圖1 GhPRP10基因PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果M.Marker Ⅲ;1.陰性對(duì)照;2～6.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 GhPRP10基因的cDNA及氨基酸序列方框部分表示N端信號(hào)肽;雙下劃線表示A(S)T(S)PPP基序;虛線表示TQPPP和TSPPP;粗下劃線表示XPP基序;星號(hào)表示終止密碼子

2.2 GhPRP10系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用Clustal X2.1將GhPRP10氨基酸序列與其它植物中PRPs氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)(圖3),圖中顯示GhPRP10與陸地棉GhPRP(AAA79360),亞洲棉Cotton_A_20973、Cotton_A_21704,雷蒙德氏棉Gorai_013G048900、Gorai_005G233500,海島棉GbPRP(AAA79364),可可樹TcUP(EOX98411)的一致性均較高。為進(jìn)一步明確該蛋白與其它植物中富含脯氨酸蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系,在GenBank中選取已登錄的不同植物的富含脯氨酸蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹(圖4),結(jié)果顯示GhPRP10是雷蒙德氏棉Go-rai013G048900、亞洲棉Cotton_A_20973基因的同源基因,GhPRP10與陸地棉GhPRP(AAA79360)親緣關(guān)系較近,與其他PRPs基因的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖3 植物中不同PRPs蛋白的氨基酸序列比對(duì)

圖4 棉花中GhPRP10與其它植物中PRPs的進(jìn)化樹分析圖中分支點(diǎn)的數(shù)字表示Bootstrap驗(yàn)證中基于1 000次重復(fù)該節(jié)點(diǎn)可信度的百分比;標(biāo)尺代表遺傳距離;三角符號(hào)代表GhPRP10

2.3 GhPRP10基因的表達(dá)分析

利用Real time PCR技術(shù)分析GhPRP10基因在棉花不同組織中的表達(dá)情況,結(jié)果表明該基因在棉花根、葉和花中幾乎不表達(dá),在莖中微弱表達(dá);在棉纖維中呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)表達(dá),且受棉纖維發(fā)育調(diào)控,即在3～9DPA纖維細(xì)胞中幾乎不表達(dá),12～18DPA表達(dá)量持續(xù)增高,在18DPA達(dá)到最高,21～27DPA表達(dá)量有所降低,但仍維持較高的表達(dá)水平(圖5)。由上述結(jié)果推測(cè)GhPRP10在棉纖維伸長(zhǎng)及次生壁合成階段發(fā)揮作用。

圖5 GhPRP10在棉花不同組織中的表達(dá)情況R.根;S.莖;L.葉;F.花;3～27分別為3～27 DPA棉纖維細(xì)胞

2.4 轉(zhuǎn)基因BY-2細(xì)胞的表型分析

將GhPRP10基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體上轉(zhuǎn)化煙草BY-2細(xì)胞。RT-PCR結(jié)果顯示8個(gè)BY-2細(xì)胞轉(zhuǎn)基因系均擴(kuò)增出約687 bp條帶(圖6),表明GhPRP10基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入煙草BY-2細(xì)胞中。將搖培好的野生型細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分別進(jìn)行染色后在熒光顯微鏡下連續(xù)觀察6 d,發(fā)現(xiàn)野生型細(xì)胞在6 d中均表現(xiàn)為不規(guī)則圓形,細(xì)胞團(tuán)由小迅速增大,增殖速度快(圖7,W1～W6);而轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在6 d中均呈現(xiàn)不規(guī)則長(zhǎng)形,分布較松散,細(xì)胞團(tuán)增殖速度慢(圖7,T1～T6)。對(duì)野生型和3個(gè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的細(xì)胞長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量,結(jié)果顯示3個(gè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系(n=40)的平均細(xì)胞長(zhǎng)度均顯著長(zhǎng)于野生型細(xì)胞,為野生型細(xì)胞的2倍以上(圖8)。表明該基因的表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng),推測(cè)其在棉纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)方面發(fā)揮作用。

圖6 轉(zhuǎn)基因BY-2細(xì)胞的RT-PCR驗(yàn)證M.Marker Ⅲ;1～8.8個(gè)轉(zhuǎn)基因BY-2細(xì)胞系;9.野生型細(xì)胞;10.陽性對(duì)照

圖7 野生型和轉(zhuǎn)基因BY-2細(xì)胞熒光顯微圖W1～W6.1～6 d野生型細(xì)胞的觀察圖;T1～T6.1～6 d轉(zhuǎn)基因細(xì)胞觀察圖

圖8 野生型和轉(zhuǎn)基因BY-2細(xì)胞長(zhǎng)度比較WT.野生型細(xì)胞;1～3.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系;標(biāo)注字母表示0.05水平顯著性

3 討 論

PRPs是植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白[27],按結(jié)構(gòu)可分為3類[11]:第一類由N端信號(hào)肽和富含脯氨酸重復(fù)基序區(qū)構(gòu)成;第二類由N端信號(hào)肽、富含脯氨酸重復(fù)基序區(qū)和C端含有半胱氨酸區(qū)構(gòu)成;第三類由N端親水結(jié)構(gòu)域和脯氨酸重復(fù)基序區(qū)構(gòu)成。本研究從棉纖維中克隆了1個(gè)新的PRPs基因GhPRP10,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)GhPRP10蛋白屬于第一類PRPs,含有N端信號(hào)肽,該結(jié)構(gòu)域可能起著將蛋白質(zhì)錨定到細(xì)胞壁上的作用。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)GhPRP10與其他已命名的陸地棉PRPs基因遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn),表明該基因是一個(gè)新的PRP基因。同源性分析發(fā)現(xiàn)GhPRP10在陸地棉供體祖先種雷蒙德氏棉、亞洲棉中的同源基因分別是Gorai013G-048900和Cotton_A_20973,說明GhPRP10在陸地棉中存在多個(gè)拷貝。

棉纖維發(fā)育分為4個(gè)時(shí)期,即起始期(0～5DPA)、伸長(zhǎng)期(5～20DPA)、次生壁合成期(20～45DPA)和成熟期(45～50DPA)[28]。前人已在棉纖維中發(fā)現(xiàn)多個(gè)PRP基因[18-22],其中GhPRP3、GhPRP5在棉纖維細(xì)胞中特異表達(dá),在伸長(zhǎng)期表達(dá)量較高,且受纖維發(fā)育調(diào)控[19-20]。本研究中實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明GhPRP10基因在棉花纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá),其表達(dá)量呈先上升,至18DPA達(dá)到最高峰,之后降低的趨勢(shì),但在21～27DPA表達(dá)量仍維持在較高水平。GhPRP10高表達(dá)時(shí)期處于棉纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)與次生壁合成期,推測(cè)GhPRP10不僅參與棉纖維伸長(zhǎng),且在次生壁的建成過程中發(fā)揮重要作用。

已有研究表明,富含脯氨酸蛋白涉及細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育以及應(yīng)對(duì)外界環(huán)境刺激等多種功能[3-4]。煙草NtProRP1是一個(gè)滲透脅迫響應(yīng)因子,對(duì)花粉管伸長(zhǎng)及在種胚發(fā)育的早期有重要作用[29]。HyPRP1在辣椒和煙草中對(duì)細(xì)胞壞死具有正調(diào)控作用,對(duì)病原菌的防御具有負(fù)調(diào)控作用[30]。關(guān)于棉花PRPs基因的功能研究很少,近期許文亮等發(fā)現(xiàn)在棉花中干擾GhPRP5表達(dá)后能使棉纖維變長(zhǎng),說明該基因在棉纖維發(fā)育過程中為負(fù)調(diào)控因子。同時(shí),GhPRP5還參與調(diào)控?cái)M南芥脅迫相關(guān)基因的表達(dá)[23]。本研究通過將GhPRP10基因轉(zhuǎn)化煙草BY-2細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)該基因過量表達(dá)使BY-2細(xì)胞長(zhǎng)度顯著增長(zhǎng),且細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的改變,由圓形細(xì)胞變?yōu)殚L(zhǎng)形細(xì)胞,這與該基因在棉纖維的伸長(zhǎng)期和次生壁增厚期優(yōu)勢(shì)表達(dá)相一致。綜上分析,GhPRP10基因能夠促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng),推測(cè)它能調(diào)控棉纖維的發(fā)育。Tábata等[31]發(fā)現(xiàn)快速堿化多肽因子AtRALF1通過調(diào)控AtPRP1、AtPRP3(富含脯氨酸的蛋白)、AtHRPG2(富含羥脯氨酸的糖蛋白),以及TCH4(木葡聚糖)來阻止油菜素類固醇的合成,從而影響根細(xì)胞的伸長(zhǎng)和側(cè)根的形成。GhPRP10能夠促進(jìn)煙草懸浮細(xì)胞的伸長(zhǎng),但如何調(diào)控棉纖維細(xì)胞的發(fā)育還有待進(jìn)一步研究。

[1] KIM H J,TRIPLETT B A.Cotton fiber growth in plant andinvitro:models for plant cell elongation and cell wall biogenesis[J].PlantPhysiology,2001,127(4):1 361-1 366.

[2] GUO W ZH(郭旺珍),SUN J(孫 敬),ZHANG T ZH(張?zhí)煺?.Cloning and molecular breeding of the fiber quality gene[J].ChineseScienceBulletin(科學(xué)通報(bào)).2003,48(5):410-417(in Chinese).

[3] KEEGSTRA K.Plant cell walls[J].PlantPhysiology,2010,154(2):483-486.

[4] SHOWALTER A M.Structure and function of plant cell wall proteins[J].ThePlantCell,1993,5(1):9-23.

[5] ZHAI Y(翟 瑩),LEI T T(雷婷婷),LI J W(李景文),etal.Cloning and expression of a stress-inducedGmPRPgene in soybean (Glycinemax)[J].ActaAgronomicaSinica(作物學(xué)報(bào)),2011,37(12):2 152-2 157(in Chinese).

[6] 趙維萍.普通小麥中一類富含脯氨酸蛋白基因的克隆與功能分析[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[7] VIGNOLS F,JOSE-ESTANYOL M,CAPARROS-RUIZ D,etal.Involvement of a maize proline-rich protein in secondary cell wall formation as deduced from its specific mRNA localization[J].PlantMolecularBiology,1999,39(5):945-952.

[8] WANG R,CHONG K,WANG T.Divergence in spatial expression patterns and in response to stimuli of tandem-repeat paralogues encoding a novel class of proline-rich proteins inOryzasativa[J].JournalofExperimentalBotany,2006,57(11):2 887-2 897.

[9] PRIYANKA B,SEKHAR K,REDDY V D,etal.Expression of pigeonpea hybrid-proline-rich protein encoding gene (CcHyPRP) in yeast andArabidopsisaffords multiple abiotic stress tolerance[J].PlantBiotechnologyJournal,2010,8(1):76-87.

[10] YI Z,MICHAEL SCHLPPI.Cold responsiveEARLI1 typeHyPRPsimprove freezing survival of yeast cells and form higher order complexes in plants[J].Planta,2007,227(1):233-243.

[11] HE C Y,ZHANG J S,CHEN S Y.A soybean gene encoding a proline-rich protein is regulated by salicylic acid,an endogenous circadian rhythm and by various stresses[J].TheoreticalandAppliedGenetics,2002,104(6-7):1 125-1 131.

[12] QIN L X,ZHANG D J,LI X B,etal.CottonGhHyPRP3 encoding a hybrid proline-rich protein is stress inducible and its overexpression inArabidopsisenhances germination under cold temperature and high salinity stress conditions[J].ActaPhysiologiaePlantarum,2013,35(5):1 531-1 542.

[13] ZHANG D J(張德靜),QIN L X(秦麗霞),LI L(李 龍),etal.Expression of cottonGhPRP5 gene inArabidopsisenhances susceptibility to ABA and salt stresses[J].ActaAgronomicaSinica(作物學(xué)報(bào)),2013,39(3):563-569(in Chinese).

[14] CHAI Q X(柴秋霞),LI B CH(李本昌),XU Z Q(徐子勤).Subcellular localization and resistance toGibberellafujikuroiof AtELHYPRP2 in transgenic tobacco[J].ChineseJournalofBiotechnology(生物工程學(xué)報(bào)),2014,30(3):472-484(in Chinese).

[15] BERNHARDT C,TIERNEY M L.Expression ofAtPRP3,a proline-rich structural cell wall protein fromArabidopsis,is regulated by cell-type-specific developmental pathways involved in root hair formation[J].PlantPhysiology,2000,122(3):705-714.

[16] RAAB S,HOTH S.A Mutation in theAtPRP4 splicing factor gene suppresses seed development inArabidopsis[J].PlantPhysiology,2007,9(3):447-452.

[17] BORON A K,VAN ORDEN J,NEKTARIOS MARKAKIS M,etal.Proline-rich protein-likePRPL1 controls elongation of root hairs inArabidopsisthaliana[J].JournalofExperimentalBotany,2014,65(18):5 485-5 495.

[18] JOHN M E,KELLER G.Characterization of mRNA for a proline-rich protein of cotton fiber[J].PlantPhysiology,1995,108(2):669-676.

[19] TAN H,CREECH R G,JENKINS J N,etal.Cloning and expression analysis of two cotton (GossypiumhirsutumL.) genes encoding cell wall proline-rich proteins[J].DNASequence,2001,12(5-6):367-380.

[20] XU W L(許文亮),HUANG G Q(黃耿青),LI X B(李學(xué)寶),etal.Molecular characterization and expression analysis of five novel genes encoding proline-rich proteins in cotton[J].ProgressinBiochemistryandBiophysics(生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展),2007,34(5):509-517(in Chinese).

[21] LI X B(李學(xué)寶),HUANG G Q(黃耿青),XU W L(許文亮),etal.Solation of the cotton genes that encoded cell wall proteins and their expression profile in cotton fibers[J].JournalofCentralChinaNormalUniversity(華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)),2005,39(4):509-513(in Chinese).

[22] FENG J X,JI S J,SHI Y H,etal.Analysis of five differentially expressed gene families in fast elongating cotton fiber[J].ActaBiochimicaandBiophysica,2004,36(1):51-56.

[23] XU W L,ZHANG D J,LI X B,etal.Cotton PRP5 gene encoding a proline-rich protein is involved in fiber development[J].PlantMolecularBiology,2013,82:353-365.

[24] JIANG J X(蔣建雄),ZHANG T ZH(張?zhí)煺?.Extraction of total RNA in cotton tissues with CTAB-acidic phenolic method[J].CottonScience(棉花學(xué)報(bào)),2003,15(3):166-167(in Chinese).

[25] KARIMI M,INZé D,DEPICKER A.GATEWAY vectors for agrobacterium-mediated plant transformation[J].TrendsinPlantScience,2002,7(5):193-195.

[26] WU K Y(吳科瀛),LIANG Y L(梁玉玲).Study on tobacco BY-2 cell culture and salt stress[J].AnimalHusbandryandFeedScience(畜牧與飼料科學(xué)),2009,30(4):8-9(in Chinese).

[27] FRANCISCO S M,TIERNEY M L.Isolation and characterization of a proline-rich cell wall protein from soybean seedlings[J].PlantPhysiology,1990,94(4):1 897-1 902.

[28] DU X M(杜雄明),PAN J J(潘家駒),WANG R H(汪若海).Differentiation and development of fiber cells on the ovules in cotton[J].CottonScience(棉花學(xué)報(bào)),2000,12(4):212-217(in Chinese).

[29] CHEN J,ZHAO J,NING J,etal.NtProRP1,a novel proline-rich protein,is an osmotic stress-responsive factor and specifically functions in pollen tube growth and early embryogenesis inNicotianatabacum[J].PlantCellandEnvironment,2014,37(2):499-511.

[30] YEOM S I,SEO E,OH S K,etal.A common plant cell-wall proteinHyPRP1 has dual roles as a positive regulator of cell death and a negative regulator of basal defense against pathogens[J].ThePlantJournal,2012,69(5):755-768.

(編輯:宋亞珍)

Cloning and Functional Analysis ofGhPRP10 Relatedto Fiber Development inGossypiumhirsutum

SHI Miao1,LI Yanjun2,LIU Yongchang2,ZHANG Xinyu2,XUE Fei2*,SUN Jie2

(1 College of Life Science,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China;2 College of Agronomy,Shihezi University/ Key Oasis Eco-agriculture Laboratory of Production and Construction Group,Shihezi,Xinjiang 832003,China)

In this study,a new gene encoding proline-rich protein was isolated from 12 days post anthesis(DPA) cotton fiber,and designated asGhPRP10.The ORF of the gene was 684bp encoding 228 amino acids,contained 34.6% proline.The bioinformatics analysis showed that the protein encoded by this gene belonged to the first class of PRPs,which has a signal peptide in N terminal and a proline rich conserved region.The quantitative RT-PCR results showed thatGhPRP10 is preferentially expressed in cotton fiber.The transcript level increased along with fiber development and reached the highest abundance at 18DPA,after which time it gradually decreased.The plant over-expression vector was constructed using Gateway technology and then transformed into tobacco suspension BY-2 cells.The phenotype observation and cell length measurement found that the transgenic cells were significantly longer than that of the wild type.Based on the expression profile ofGhPRP10 and phenotype analysis of transgenic cells,it is presumed that the gene plays an important role in the process of fiber elongation and secondary wall synthesis.

cotton;fiber;proline-rich protein;tobacco suspension BY-2 cells

1000-4025(2015)04-0639-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.04.0639

2014-11-26;修改稿收到日期:2015-03-05

國(guó)家自然科學(xué)基金(U1128301);十二五科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD35B05);石河子大學(xué)育種專項(xiàng)(gxjs2012-yz01,gxjs2012-yz04)

石 淼(1989-),女,在讀碩士研究生,主要從事棉花分子育種研究。E-mail:shim0501@163.com

*通信作者:薛 飛,副教授,博士,主要從事棉花分子育種研究。E-mail:xuefei2011@gmail.com

Q785;Q786

A