香樟與雜種馬褂木樹葉乙醇提取物對菜青蟲的拒食作用

楊超偉， 胡偉華， 夏 莘， 張云嶺， 黃文豪

(國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心, 河南 鄭州 450003)

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香樟與雜種馬褂木樹葉乙醇提取物對菜青蟲的拒食作用

楊超偉， 胡偉華*， 夏 莘， 張云嶺， 黃文豪

(國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心, 河南 鄭州 450003)

為豐富植物源殺蟲劑資源，降低蔬菜產(chǎn)品農(nóng)藥殘留風(fēng)險，提高質(zhì)量安全，采用選擇性葉碟法研究香樟和雜種馬褂木的葉片粗提物及其共有的主成分芳樟醇和樟腦對菜青蟲的拒食作用。結(jié)果表明：香樟和雜種馬褂木葉片的乙醇提取物對菜青蟲有極顯著的拒食作用，拒食反應(yīng)指數(shù)分別為97.74和62.97；芳樟醇和樟腦以2 mg/1.5 cm ID葉碟的劑量使用時，拒食反應(yīng)指數(shù)分別達(dá)89.36和39.88。菜青蟲依賴嗅覺系統(tǒng)不能識別芳樟醇和樟腦，在2種物質(zhì)處理葉碟上的取食持續(xù)期為30 s左右，表明2種物質(zhì)具有攝入后的生理毒性。

香樟； 雜種馬褂木； 乙醇提取物； 芳樟醇； 樟腦； 菜青蟲； 拒食作用

菜青蟲(Pierisrapae)是白菜、甘藍(lán)和花椰菜等十字花科葉菜類的嚴(yán)重常發(fā)性害蟲[1]，蔬菜受害后其商品價值和產(chǎn)量均受到嚴(yán)重影響。當(dāng)前，各蔬菜產(chǎn)區(qū)主要依賴阿維菌素及其結(jié)構(gòu)改良產(chǎn)品進(jìn)行防治，但對阿維菌素的過分依賴有大面積產(chǎn)生抗性的潛在風(fēng)險。

有研究發(fā)現(xiàn)[2]，現(xiàn)有48萬種植食性昆蟲絕大多數(shù)為單食性和寡食性，理論上講，用于開發(fā)拒食劑的非寄主植物資源大量存在。利用植物源拒食劑調(diào)控作物的適口性，可以將食葉類害蟲的危害控制在蔬菜受害前，第三級營養(yǎng)層的天敵可以獲得無毒素的食物，是一種更安全的替代性方法，能夠?qū)崿F(xiàn)真正意義上的預(yù)防為主。

近10年來，針對菜青蟲拒食材料篩選的研究非常活躍，如香菜、胡椒、蔥、川楝、銀杏葉、銀杏種皮、杠柳根皮和老鴉皮等[3-8]。然而，上述研究盡管拓寬了拒食材料篩選范圍，取得了可喜的進(jìn)展，但存在取食量下降的問題，其原因可能是因嗅覺驅(qū)避、生理毒性等所致[9]，且僅以特定時間內(nèi)害蟲取食量為試驗指標(biāo)并不能確認(rèn)拒食材料的生物活性。

香樟(Cinnamomumcamphora)和雜種馬褂木(Liriodendronchinense×L.tulipiferaLinn.)全株富含精油，其葉和種子粉碎后有濃郁的樟腦氣味，具有天然的抗蟲性。前期筆者對雜種馬褂木的抗蟲性作過初步研究[10-11]，通過對目標(biāo)昆蟲的選擇試驗，確定了雜種馬褂木樹葉的抽提物對不同昆蟲的抗蟲作用，但試驗并未對其拒食活性以及主要成分的作用機(jī)制進(jìn)行研究。另有文獻(xiàn)報道，香樟對菜青蟲有拒食活性[12]，但研究內(nèi)容簡單，未對其劑量、主要成分及其作用機(jī)制進(jìn)行研究。為此，筆者于2013年采用選擇性葉碟法，針對具有相同成分(芳樟醇和樟腦)的香樟和雜種馬褂木樹葉的乙醇提取物的拒食活性進(jìn)行對比，對拒食活性更強(qiáng)的香樟提取物進(jìn)行劑量反應(yīng)研究，并對二者主成分的作用活性進(jìn)行分析，以期豐富植物源拒食劑資源，降低蔬菜產(chǎn)品農(nóng)藥殘留風(fēng)險及提高其質(zhì)量安全，為植物源拒食劑的研究提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菜青蟲 2013年6月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)花椰菜田采集，放入氣候箱中用新鮮的花椰菜葉片飼養(yǎng)備用。

1.1.2 植物材料 香樟和雜種馬褂木樹葉，分別采于湖北省荊州市香樟基地和中國林科院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心原陽基地，將葉片自然干燥并粉碎后備用。

1.1.3 試劑 芳樟醇和樟腦(分析純)分別購買于Fluka Co Ltd.和天津Kermel化學(xué)試劑有限公司，無水乙醇購買于天津Kermel化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備 氣候箱，MLR-351H，日本三洋。(26±2)℃，RH為(75±10)%，14L∶10D。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 2種樹葉乙醇提取物對菜青蟲的拒食活性比較 采用新鮮無蟲害的花椰菜葉碟作為取食基質(zhì)進(jìn)行選擇性葉碟法取食測試。試驗前首先將菜青蟲4齡幼蟲饑餓處理12 h，并將上述2種植物葉粉末用無水乙醇(2 g/15 mL)常溫提取1 d，經(jīng)充分振蕩取上清液備用。試驗設(shè)3個處理，分別以香樟樹葉和雜種馬褂木葉的提取物及無水乙醇(對照)為處理試劑。測定時，在14 cm ID培養(yǎng)皿底部鋪上濕濾紙，用打孔器制備1.5 cm ID葉碟，放入4枚葉碟，其中2枚涂布20 μL提取物作為處理，另外2枚涂布等量無水乙醇作為對照(交叉設(shè)置)。每個培養(yǎng)皿引入1頭試蟲。當(dāng)對照葉碟被食量在50%～80%時采用透明坐標(biāo)紙進(jìn)行取食量測定，每組處理重復(fù)20次。

1.2.2 菜青蟲對香樟樹葉提取物的反應(yīng)劑量 試驗設(shè)5個處理，即：將香樟樹葉提取液分別稀釋1倍、1.5倍、2倍和4倍的4個處理，以及原提取溶劑作為試驗的空白對照。測試方法同1.2.1，每處理重復(fù)20次。

1.2.3 菜青蟲對芳樟醇和樟腦的取食反應(yīng) 試驗設(shè)3個處理，即：將芳樟醇和樟腦按100 mg/mL分別溶于無水乙醇進(jìn)行測試，無水乙醇為對照。試驗時每個處理葉碟涂布的樣品劑量仍為20 μL(相當(dāng)于2 mg有效成分)。測試方法同1.2.1，每處理重復(fù)20次。

1.2.4 菜青蟲對芳樟醇和樟腦的訪問頻次測定 采用2項選擇式測試法，在培養(yǎng)皿內(nèi)壁邊緣放入芳樟醇或樟腦處理的葉碟1枚，每個處理葉碟涂布的樣品劑量為20 μL，在沿著直徑的另一側(cè)放置1枚未經(jīng)處理的對照葉碟。然后引入菜青蟲1頭，立刻放在熒光燈下觀察，使熒光燈與2枚葉碟所在的直徑平行且位于正上方。觀察并記錄初次選擇的葉碟類型。由于芳樟醇和樟腦具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，測試時間過長可能會導(dǎo)致氣味在培養(yǎng)皿中擴(kuò)散均勻，故5 min內(nèi)試蟲既不選擇處理也不選擇對照的即終止試驗并重做。通過上述試驗觀察發(fā)現(xiàn)，通常經(jīng)過饑餓處理12 h，這類不表現(xiàn)出選擇性趨向反應(yīng)的個體不足總數(shù)的5%。芳樟醇和樟腦各重復(fù)測試50頭幼蟲。

1.2.5 菜青蟲對芳樟醇和樟腦處理葉碟的取食持續(xù)期 采用非選擇性方法測試菜青蟲對芳樟醇和樟腦處理葉碟的取食持續(xù)時間，以判斷2種物質(zhì)對菜青蟲的拒食是攝入前效應(yīng)(作用于味覺系統(tǒng))還是攝入后效應(yīng)(生理毒性)。試驗設(shè)3個處理，分別為芳樟醇和樟腦處理及乙醇處理(對照)，每個處理葉碟涂布的樣品劑量為20 μL。在培養(yǎng)皿中央放置相應(yīng)處理的葉碟1枚，引入菜青蟲1頭，一旦幼蟲開始在葉碟上試咬開始計時，直到幼蟲離開時終止計時。為了避免取食經(jīng)歷的影響，每頭個體僅測試1次。每個處理重復(fù)測定20頭。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

選擇性取食數(shù)據(jù)均采用配對t測驗比較處理組內(nèi)處理和對照被食量差異顯著性(a=0.05)，根據(jù)Renwick J J A & Huang X P的方法計算拒食反應(yīng)指數(shù)(Feeding deterrence index，F(xiàn)DI)[13]，并對組間的FDI值差異進(jìn)行方差分析和多重比較。趨向頻次采用χ2測驗分析，取食持續(xù)時間經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析和Duncan氏多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 香樟和雜種馬褂木樹葉乙醇提取物對菜青蟲的拒食活性

從圖1可見，2種樹葉提取物處理的葉碟被食量均極顯著小于對照葉碟(t雜種馬褂木=11.265 3，t香樟=20.392 5，P<0.01)，拒食反應(yīng)指數(shù)分別為62.97%和97.74%。說明，雜種馬褂木樹葉和香樟樹葉中均含有菜青蟲的拒食活性成分，但香樟樹葉更強(qiáng)。試驗觀察到香樟樹葉提取物處理葉碟僅有少量的菜青蟲試咬點。

注：**表示處理與對照的差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)

Note: **indicated very significantly different with CK at 0.01 level.

圖 1 雜種馬褂木和香樟樹葉乙醇提取物對菜青蟲的拒食活性

Fig.1 Feeding deterrence of the extracts of the hybrid tulip tree andC.camphoraleaves againstP.rapaelarvae

表1 不同劑量香樟樹葉提取物對菜青蟲的拒食活性

2.2 不同香樟樹葉提取物對菜青蟲的拒食活性

從表1可見，完全不含香樟樹葉提取物的處理組和對照的葉碟被食量沒有顯著性差異(t= 0.18)，其余處理組的和對照的葉碟被食量之間均存在極顯著差異。其中，20 μL時拒食反應(yīng)指數(shù)最高，為FDI=98.08。從組間顯著性看，20 μL和15 μL劑量的FDI之間差異不顯著，而10 μL與5 μL劑量的FDI之間差異不顯著，但前二者劑量的FDI指數(shù)顯著大于后二者；所有含有香樟樹葉的提取物均有一定拒食活性。

2.3 芳樟醇和樟腦對菜青蟲的拒食活性

從表2可見，芳樟醇、樟腦的處理組與對照組的葉碟被食量均存在極顯著差異，芳樟醇的FDI指數(shù)為89.36，樟腦的FDI指數(shù)為39.88。說明，芳樟醇的活性更強(qiáng)。

表2 香樟樹葉主要揮發(fā)物成分對菜青蟲的拒食活性

圖2 菜青蟲對芳樟醇和樟腦處理葉碟的選擇頻次 和取食持續(xù)時間

Fig.2 Choice frequency and initial feeing duration ofP.rapaelarvae to linalool and camphor treated leaf discs

2.4 菜青蟲對芳樟醇和樟腦的趨向反應(yīng)

芳樟醇和樟腦具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，由此推測其對菜青蟲具有嗅覺驅(qū)避作用，造成菜青蟲取食量下降，因此，測試了菜青蟲對2種物質(zhì)處理花椰菜葉碟的訪問頻次。從圖2可見，與預(yù)期結(jié)果相反，菜青蟲對2種物質(zhì)處理的與對照的葉碟選擇頻次之間無顯著性差異(χ2芳樟醇=0.08，(χ2樟腦=0.32，(χ20.05=3.84)。說明，2種物質(zhì)對菜青蟲的嗅覺系統(tǒng)沒有明顯的刺激活性，取食量的下降可能是攝入后的味覺拒食或生理毒性所致。

2.5 菜青蟲在芳樟醇和樟腦處理葉碟上的取食持續(xù)時間

從圖2還可見，菜青蟲對3組葉碟的取食持續(xù)時間存在極顯著差異(F=14.62，F(xiàn)0.05=3.153 1，F(xiàn)0.01=4.984 1)。其中，芳樟醇和樟腦的取食持續(xù)時間在30 s左右，二者差異不顯著，但均顯著低于對照。

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，香樟樹葉提取物的拒食活性比雜種馬褂木樹葉提取物的強(qiáng)；芳樟醇和樟腦2種主成分表現(xiàn)出較強(qiáng)的拒食活性，通過香樟樹葉提取物的劑量反應(yīng)試驗，可以解釋2種植物材料拒食活性的差異。通過趨性測試和取食持續(xù)時間測試發(fā)現(xiàn)，芳樟醇和樟腦雖然具有明顯可辨的氣味，但對菜青蟲卻沒有基于嗅覺系統(tǒng)的驅(qū)避作用。然而，該蟲對該2種物質(zhì)處理葉碟的取食持續(xù)時間均為30 s左右，顯著低于對照。根據(jù)Glendining[9]判斷標(biāo)準(zhǔn)，純粹基于味覺系統(tǒng)的驅(qū)避作用往往在數(shù)秒內(nèi)就會回避取食，攝入后效應(yīng)往往在30～60 s發(fā)揮作用。因此，可以判定是芳樟醇和樟腦攝入后效應(yīng)導(dǎo)致菜青蟲取食量的下降，而不是驅(qū)避作用和基于外周神經(jīng)系統(tǒng)的攝入前效應(yīng)所致。此發(fā)現(xiàn)對于菜青蟲的綜合治理具有重要的意義。因為鱗翅目幼蟲移動能力較差，其取食位置往往由上一世代雌成蟲的產(chǎn)卵選擇決定，故基于嗅覺驅(qū)避活性的物質(zhì)仍然難以避免作物受害；基于外周味覺感覺系統(tǒng)的攝入前效應(yīng)活性的物質(zhì)長期處理非常容易引起害蟲的適應(yīng)和味覺習(xí)慣化現(xiàn)象[18]，而攝入中腸之后發(fā)揮生理毒性的物質(zhì)則失去了行為調(diào)控的本意，盡管毒性比化學(xué)農(nóng)藥小得多，但仍然有可能對第三營養(yǎng)層的生物造成負(fù)面的影響。因此，基于攝入后效應(yīng)的拒食劑有較大的利用潛力，芳樟醇和樟腦正是屬于這種類型的活性成分。這些物質(zhì)如果還能影響雌成蟲的產(chǎn)卵選擇，就能在大田應(yīng)用中以點氣味源的方式保護(hù)作物免受菜青蟲產(chǎn)卵而無需大面積的噴霧處理，但需要未來通過試驗進(jìn)一步驗證。

本試驗取得進(jìn)展的關(guān)鍵在于研究對象和供試材料的選擇。首先，菜青蟲為十字花科的寡食性害蟲，對非寄主中的次生代謝物比較敏感；另外，香樟樹和馬褂木均為富含精油的高大喬木，與十字花科植物具有很遠(yuǎn)的遺傳距離，農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，菜青蟲與這些植物幾乎沒有接觸的機(jī)會。系統(tǒng)發(fā)育保守假說認(rèn)為，寄主植物在系統(tǒng)發(fā)育樹上的位置對植食者的寄主轉(zhuǎn)移有強(qiáng)烈的限制作用，植食者對多種寄主的利用或者寄主轉(zhuǎn)移局限于近緣的植物，因為近緣植物共享一些植食者再認(rèn)識和利用其理化性狀[13-17]。當(dāng)前，蔬菜重要害蟲菜青蟲的拒食劑篩選范圍不斷擴(kuò)大，但真正能夠用于防治實踐替代阿維菌素及類似藥劑的活性物質(zhì)非常少，原因可能就在于選擇的非寄主資源多是農(nóng)田常見的雜草類植物。筆者認(rèn)為，應(yīng)當(dāng)根據(jù)植食者-寄主的系統(tǒng)發(fā)育保守假說，精選與十字花科植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的植物尤其是高大的喬木作為拒食劑的篩選資源。

另外，高等植物往往利用多重防衛(wèi)機(jī)制抵御植食者的攻擊，克服后者味覺系統(tǒng)的習(xí)慣化現(xiàn)象和進(jìn)而發(fā)生的寄主?；痆18]。從植物葉片的提取物和純化合物的拒食反應(yīng)指數(shù)比較看，芳樟醇和樟腦僅能部分地解釋香樟樹葉對菜青蟲的拒食活性，可能一些含量低的成分對這2種物質(zhì)起著協(xié)同增效的作用。該文僅對2種植物材料中的活性成分進(jìn)行了定性分析，如果能通過芳樟醇和樟腦二元混劑最佳配比篩選，確定二者是否存在增效性的相互作用，則有可能進(jìn)一步提高這些物質(zhì)開發(fā)應(yīng)用的可能性。

致謝：感謝河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院李為爭老師在項目研究中的指導(dǎo)及李惠玲等同學(xué)的協(xié)助。

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(責(zé)任編輯： 王 海)

Antifeeding Activity of the Ethanol Extracts ofCinnamomumcamphoraandLiriodendronchinense×L.tulipiferaAgainstPierisrapae

YANG Chaowei, HU Weihua*, XIA Xin, ZHANG Yunling, HUANG Wenhao

(PaulowniaResearchandDevelopmentCenter,StateForestryAdministration,Zhengzhou,Henan450003,China)

To enrich botanical insecticide resource, reduce the risk of pesticide residue in vegetable products and enhance the quality safety, Using the method of selective leaf disc test, the author tested the antifeeding activity of two species,C.camphoraandL.chinense×L.tulipifera, againstP.rapaelarvae. The common components (linalool and camphor) of the two species were extracted and used in the test. Results: The ethanol extracts of the two species had very significant antifeeding activity for theP.rapaelarvae. The antifeeding indices ofC.camphoraandL.chinense×L.tulipiferawere 97.74 and 62.97, respectively；When the dose of 2 mg per 1.5 cm ID leaf disc for linalool and camphor was used, the antifeeding responses reached 89.36 and 39.88, respectively. The larvae used in the test could not recognize the difference between linalool and camphor by olfactory feeling. The feeding duration of larva individuals on the treated leaf discs containing linalool or camphor was about 30 s, suggesting that the two common major components of the two species had physiological toxicity after ingested.

Cinnamomumcamphora;Liriodendronchinense×L.tulipifera; ethanol extract; linalool; camphor;Pierisrapae; antifeeding activity

2014-06-20； 2015-07-06修回

河南省重點科技攻關(guān)計劃項目“植物源蔬菜害蟲調(diào)控劑的研究”(112102110037)

楊超偉(1982-)，男，工程師，從事經(jīng)濟(jì)林培育研究。E-mail：ycw371@126.com

*通訊作者:胡偉華(1964-)，女，副研究員，從事植物內(nèi)含物研究。E-mail：hua64@sohu.com

1001-3601(2015)07-0364-0068-04

S482.3+9； S433.4

A