裸花紫珠的組培快繁技術(shù)體系

朱紅林，徐 靖，陳健曉，熊懷陽，王效寧

（海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所／農(nóng)業(yè)部作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制海南科學(xué)觀測試驗站，海南 海口571100）

裸花紫珠（Callicarpa nudiflora）為馬鞭草科紫珠屬植物，是我國珍稀藥材之一，主要分布于海南、廣東、廣西地區(qū)，生于平地至海拔1 200m的山坡、谷地、溪旁林中或灌木叢中［1］。干燥地上部分為藥用，化學(xué)成分主要包括黃酮類、萜類、揮發(fā)油和酚類等，具有抗菌止血、消炎解毒、散瘀消腫、驅(qū)風(fēng)祛濕之功效［2］。一直以來，裸花紫珠的原材料供給主要是依靠采挖野生資源，隨著市場需求量逐年增加，野生資源逐年銳減，已不能滿足生產(chǎn)需要。由于裸花紫珠種子最佳采種時間短以及種子不宜儲藏，分株繁殖苗的系數(shù)和效率較低［3－4］，無法提供大批優(yōu)質(zhì)種苗，以滿足產(chǎn)業(yè)化基地生產(chǎn)的需要。目前，國內(nèi)研究報道側(cè)重在藥理分析、治療效果等方面［2，5］，但在組培快繁方面較少，且仍停留在試驗階段，還未應(yīng)用于規(guī)模化產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)［6－7］。因此，筆者以實現(xiàn)裸花紫珠快速繁殖為目的，進(jìn)行外植體消毒時間、6－BA和NAA及不同基質(zhì)對成苗的影響試驗，建裸花紫珠組培快繁技術(shù)體系，為裸花紫珠種苗的規(guī)模化生產(chǎn)提供可靠的技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 植物

野生裸花紫珠當(dāng)年生莖段，植株采自海南五指山。

1.2 外植體消毒及接種

于晴天午后，剪取當(dāng)年生莖段置流水沖洗2～3h，晾干水分，分成5份。在超凈工作臺上用75%酒精消毒30s，再用0.1%升汞溶液分別振蕩浸泡滅菌3min、5min、8min、10min、12min，無菌水沖洗5遍。將消毒的外植體，切成約1.5～2.0cm的單節(jié)莖段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。外植體接種培養(yǎng)20d后，統(tǒng)計污染率、萌芽率和不定芽長勢。

1.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加6－BA 0mg／L、0.5mg／L、1.0mg／L、1.5mg／L、2.0mg／L 5個濃度水平，每瓶接種4個外植體，每處理接種10瓶。接種30d后統(tǒng)計莖段芽誘導(dǎo)率，其間觀察誘導(dǎo)出芽的生長狀況。

1.4 繼代增殖培養(yǎng)

當(dāng)誘導(dǎo)出的芽長4cm左右時，將其切割成單節(jié)莖段，接種到以MS為基本培養(yǎng)基、分別添加不同濃度 6－BA （0.5mg／L，1.0mg／L，1.5mg／L，2.0mg／L）和 NAA （0mg／L，0.05mg／L，0.1mg／L，0.2mg／L）的培養(yǎng)基中，共16個處理，每個處理5瓶，每瓶5個單節(jié)莖段，培養(yǎng)30d后記錄生長情況，并統(tǒng)計誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽數(shù)，計算繁殖系數(shù)。

1.5 生根培養(yǎng)

當(dāng)增殖培養(yǎng)過程中無根試管苗長至1.5cm左右時，從基部切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上。以1／2MS為基本培養(yǎng)基，添加IBA（0mg／L，0.5mg／L，1.0mg／L，1.5mg／L，2.0mg／L）5個濃度水平，共5個處理，每個處理10瓶，每瓶5株。觀察記錄開始生根天數(shù)及根生長情況，30d后統(tǒng)計生根率。

1.6 煉苗與移栽

當(dāng)苗高4～6cm、生根4條以上時移入拱棚煉苗7～10d，洗凈根部培養(yǎng)基后，放入0.2%高錳酸鉀浸泡1～2min，取出晾干后，栽入基質(zhì)①紅土、②河沙＋紅土（河沙∶紅土＝1∶1）、③河沙＋椰糠＋紅土（河沙∶椰糠∶紅土＝2∶1∶1）、④河沙＋椰糠＋紅土（河沙∶椰糠∶紅土＝1∶1∶1），栽后澆透定根水，蓋遮陽網(wǎng)，20d后揭去遮陽網(wǎng)，30d后隨機抽查100株統(tǒng)計移栽成活率，計算公式：

移栽成活率＝（成活苗數(shù)／統(tǒng)計苗數(shù)）×100%

1.7 培養(yǎng)條件

誘導(dǎo)培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)基中添加白砂糖30g／L，生根培養(yǎng)基中加白砂糖20g／L，卡拉膠均為6.0g／L，培養(yǎng)基pH 5.8。培養(yǎng)溫度（28±1）℃，光照10h／d，光照強度為2 000Lx。

1.8 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2007數(shù)據(jù)分析庫進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時間的確定

從表1看出，隨著消毒時間的延長，外植體的污染率下降，在3～10min，萌芽率隨消毒時間的增加而增加，高達(dá)70%，且不定芽長勢較壯（圖示A），而當(dāng)消毒時間增加到12min時萌芽率下降，不定芽長勢弱，說明消毒時間長，消毒效果好，但時間過長，消毒劑對外植體也會產(chǎn)生傷害。綜合考慮污染率和萌芽率，裸花紫珠當(dāng)年生莖段最佳的升汞消毒時間為10min。

2.2 6－BA對芽誘導(dǎo)的影響

接種培養(yǎng)10d后，外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上直接從莖節(jié)處分化出芽點。6－BA對裸花紫珠莖段芽誘導(dǎo)影響很大，當(dāng)培養(yǎng)基中未加6－BA時，芽誘導(dǎo)率僅12.5%；而當(dāng)6－BA濃度為0.5mg／L時，萌發(fā)率最高，達(dá)87.5%；隨6－BA濃度的升高，芽誘導(dǎo)率反而下降，且葉片玻璃化；當(dāng)6－BA濃度高達(dá)2.0mg／L時，只有愈傷組織，不分化芽（表2）。

2.3 激素組合對芽增殖的影響

表1 不同消毒時間裸花紫珠的外植體Table 1 Explants of C.nudifloratreated with different sterilization time

表2 不同6－BA濃度裸花紫珠的芽誘導(dǎo)與生長狀況Table 2 Bud induction of C.nudifloratreated with different 6－BA concentration

從表3看出，單節(jié)莖段（圖示B、C）在16種激素組合處理中的增殖系數(shù)差異很大，最高的達(dá)12.7，最低的只有3.2。6－BA濃度為0.5mg／L時，叢生芽增殖系數(shù)低，均在5.0以下，但叢生芽芽苗粗壯；6－BA濃度為2.00mg／L時，叢生芽增殖系數(shù)最高，但叢生芽芽苗細(xì)弱，大量玻璃化，而且植株節(jié)間很短，苗高1.0～1.5cm，不利于生根培養(yǎng)；6－BA濃度為1.50mg／L時，叢生芽增殖系數(shù)為7.62～10.62，雖然增殖系數(shù)低于6－BA濃度2.00mg／L，但叢生芽芽苗壯，平均株高1.5cm，利于生根，說明較低和較高濃度的6－BA對叢生芽的增殖效果均不理想。

表3 不同激素組合裸花紫珠單節(jié)莖段芽的增殖情況Table 3 Bud multiplication of C.nudiflora plantlets with different hormone combinations

對影響因子6－BA、NAA各處理的增殖系數(shù)進(jìn)行方差分析得到，6－BA和NAA對叢生芽增殖的影響均達(dá)極顯著水平，其中：6－BA對叢生芽的誘導(dǎo)影響作用大于NAA，6－BA和NAA的相互作用對叢生芽的增殖存在極顯著影響，兩者適宜的配比，叢生芽的增殖效果最好。6－BA和NAA的多重比較表明，6－BA 1.50mg／L 與0.50mg／L、1.00mg／L、3.00mg／L差 異 極 顯 著，NAA 0.05mg／L 與0mg／L、0.10mg／L、0.20mg／L的差異也達(dá)極顯著，6－BA 1.50mg／L與 NAA 0.10mg／L 兩 者 配合，叢生芽的增殖系數(shù)最大，而且叢生芽的生長狀況也較好。

2.4 IBA對生根的影響

從表4看出，在5種不同處理中，試管苗的株高無顯著性差異，生根天數(shù)、根條數(shù)、根長和根誘導(dǎo)率均存在顯著差異。未添加IBA的生根效果最差，根誘導(dǎo)最慢，20d后才開始生根，且根少、短，生根率僅有12.0%；低濃度的IBA，生根效果不理想，高濃度的IBA對生根也不利；只有IBA 1.0mg／L時，苗發(fā)根早、根多、粗壯，且有須根，利于煉苗移栽（圖示D、E）。

2.5 基質(zhì)對組培苗生長的影響

裸花紫珠組培苗在不同的移栽基質(zhì)中成活率和株高均有不同（表5），基質(zhì)組合①、②和③、④之間差異顯著，基質(zhì)組合③和④之間差異不顯著，且組培苗的移栽成活率高，生長健壯（圖示F）。因此，選用河沙∶椰糠∶紅土＝（1～2）∶1∶1基質(zhì)配方移栽裸花紫珠組培苗較好。

表4 不同IBA濃度裸花紫珠組培苗的根分化情況Table 4 Root differentiation of C.nudiflora plantlets with different IBA concentration

表5 不同移栽基質(zhì)裸花紫珠組培苗的生長情況Table 5 Growth plantlets of C.nudiflora with different transplanting substrate

圖示 組織培養(yǎng)快繁裸花紫珠的植株性狀Fig. Character of C.nudiflora plantlets from rapid propagation

3 結(jié)論與討論

本研究建立的裸花紫珠組培快繁技術(shù)體系：于晴天午后，剪取野生裸花紫珠莖段為外植體，流水沖洗后，用0.1%升汞溶液消毒10min，接種于培養(yǎng)基MS＋6－BA 0.5mg／L＋ 白 糖 30g／L＋ 卡 拉 膠6.0g／L（pH 5.8）中誘導(dǎo)，當(dāng)誘導(dǎo)出的叢生芽長4cm左右時，將其切割成單節(jié)莖段置于培養(yǎng)基MS＋6－BA1.50mg／L＋NAA0.01mg／L＋30g／L白糖＋6.0g／L卡拉膠（pH 5.8）中繼代增殖，當(dāng)增殖長出的無根試管苗長1.5cm左右時，即從基部切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基1／2MS＋I(xiàn)BA1.0mg／L＋白糖20g／L＋卡拉膠6.0g／L（pH 5.8）中，當(dāng)苗高4～6cm、生根4條以上時煉苗、移栽于基質(zhì)V河沙∶V椰糠∶V紅土＝（1～2）∶1∶1中，外植體芽誘導(dǎo)率為87.5%，繼代增殖繁殖周期為30d，增殖系數(shù)為10，生根率100%，移栽成活率超過95%。

6－BA作為外源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)具有快速、非極性運輸特性，在植物體各個部位均有分布，以莖尖和根部濃度較高［8］。在培養(yǎng)基中加入6－BA，是為促進(jìn)細(xì)胞分裂和由愈傷組織或器官上分化不定芽［9］，在本研究的外植體芽誘導(dǎo)試驗中，添加0.5mg／L 6－BA的芽誘導(dǎo)率是未添加的7倍，表明6－BA是裸花紫珠外植體芽誘導(dǎo)的關(guān)鍵激素。

不同植物生長調(diào)節(jié)劑配合有疊加作用，比單一生長調(diào)節(jié)劑更能促進(jìn)叢生芽或不定芽的形成與增殖［10］。在本研究中，6－BA 1.50mg／L 單獨使用時增殖系數(shù)為7.62，與NAA 0.10mg／L配合使增殖系數(shù)達(dá)10.62，差異達(dá)極顯著水平，且叢生芽的生長狀況良好。本研究與潘梅等［7］研究適用于裸花紫珠增 殖 的 激 素 組 合 6－BA 2.00mg／L＋ NAA 0.05mg／L不同，可能與外植體的取材不同、基本培養(yǎng)基的組分差別有關(guān)。潘梅等［7］采用的是種子接種培養(yǎng)無菌苗作外植體，而本研究是取用野生裸花紫珠莖段作外植體；潘梅等［7］是用蒸餾水和蔗糖配制培養(yǎng)基，而本研究是用自來水和市場白砂糖配制培養(yǎng)基，自來水的成分會影響培養(yǎng)基組分。

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