固相萃取高效液相色譜法測(cè)定六經(jīng)頭痛片中馬兜鈴酸Ⅰ的含量

黃可婧，祝小靜

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

1．馬兜鈴酸Ⅰ

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黃可婧，祝小靜

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

目的：建立六經(jīng)頭痛片中馬兜鈴酸Ⅰ的限量檢查法。方法: 通過(guò)提取、固相萃取對(duì)制劑中馬兜鈴酸Ⅰ進(jìn)行提取純化，應(yīng)用高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。色譜條件: 采用Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-1%冰醋酸(38∶62), 檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。結(jié)果：馬兜鈴酸Ⅰ在0.199 6～0.997 9 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 7)。檢測(cè)限為0.997 9 ng、定量限為1.996 ng；平均回收率為99.18%，RSD為1.47%。結(jié)論: 所建立的方法簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為控制六經(jīng)頭痛片安全性的檢測(cè)方法。

六經(jīng)頭痛片，馬兜鈴酸Ⅰ，固相萃取-高效液相色譜，毒性成分限量檢查

六經(jīng)頭痛片為國(guó)家中藥保護(hù)品種，是由白芷、辛夷、藁本、細(xì)辛等9味中藥加工制成的片劑，具有疏風(fēng)活絡(luò)、止痛利竅的功效，用于全頭痛、偏頭痛及局部頭痛。因制劑中細(xì)辛含有馬兜鈴酸[1-5]，馬兜鈴酸可引起腎臟毒性，根據(jù)國(guó)家中藥品種保護(hù)審評(píng)委員會(huì)的改進(jìn)意見(jiàn)與有關(guān)要求，在原標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上增加了馬兜鈴酸Ⅰ的限量檢查方法。

1 儀器與試藥

SHIMADZU LC-20AD高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器，LC solution工作站。馬兜鈴酸Ⅰ對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，純度為98.8%，批號(hào)110746-201108)；六經(jīng)頭痛片(天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司隆順榕制藥廠，批號(hào)A12352、A2353、A12354、0811238、0901246)；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Phenomenex C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈-1%冰醋酸(38∶62)為流動(dòng)相，柱溫:40 ℃，流速：1.0 ml/min，進(jìn)樣量：10 μl，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。理論板數(shù)按馬兜鈴酸Ⅰ峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000[6]。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取馬兜鈴酸Ⅰ對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含馬兜鈴酸Ⅰ 0.2 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取樣品適量，除去包衣，研細(xì)，取細(xì)粉約3 g，精密稱定，精密加入甲醇25 ml，超聲處理40 min后，放冷，稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 ml，加至依次用甲醇、水、甲醇各3 ml預(yù)洗的strata X-AW 33 μm(Phenomenex，60 mg/3 ml)固相萃取柱上，依次用水、甲醇洗滌至洗脫液無(wú)色，棄去洗脫液，再用甲酸甲醇溶液(25→100)洗脫至5 ml量瓶中，洗脫至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取處方1/100處方量(除細(xì)辛外)，按制法及供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品、陰性樣品和供試品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析。色譜圖見(jiàn)圖1，可見(jiàn)樣品中其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。理論板數(shù)按馬兜鈴酸Ⅰ峰計(jì)算在10 000 以上，馬兜鈴酸Ⅰ 峰與相鄰的峰分離良好。

2.4 線性關(guān)系考查 取馬兜鈴酸Ⅰ對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 ml分別含0.997 9、0.499 0、0.399 2、0.299 4和0.199 6 μg的系列對(duì)照品溶液，吸取10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定馬兜鈴酸Ⅰ的峰面積，以對(duì)照品溶液(μg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得方程：Y=60.99X+0.650(r=0.999 9)，結(jié)果表明，馬兜鈴酸Ⅰ在0.199 6～0.997 9 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 檢出限及定量限的測(cè)定 取對(duì)照品溶液(0.199 6 μg/ml)，分別精密吸取5和10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，記錄色譜圖，結(jié)果表明進(jìn)樣量為5 μl時(shí)，馬兜鈴酸Ⅰ峰信噪比(/N)為5.5；進(jìn)樣量為10 μl時(shí)，馬兜鈴酸Ⅰ峰信噪比(/N)為14.8，表明該色譜條件下馬兜鈴酸Ⅰ的檢出限為0.997 9 ng、定量限為1.996 ng。

2.6 精密度試驗(yàn) 取“回收率試驗(yàn)”中“回收-1”供試品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定馬兜鈴酸Ⅰ峰面積，測(cè)得峰面積平均值為13.33，RSD為0.88%，符合要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“回收率試驗(yàn)”中“回收-1”供試品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，分別在0、4、8、12、18和24 h測(cè)定，測(cè)得馬兜鈴酸Ⅰ峰面積值的RSD為1.77%，符合要求。

1．馬兜鈴酸Ⅰ

圖1 對(duì)照品(A)

陰性樣品(B)供試品(C)HPLC色譜圖

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(A12353)樣品，除去包衣，研細(xì)，取約3 g(共6份)，精密稱定，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，結(jié)果樣品中未檢出馬兜鈴酸Ⅰ。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批號(hào)(A12353)樣品，除去包衣，研細(xì)，取約3 g(共6份)，精密稱定，至錐形瓶中，分別精密加入馬兜鈴酸Ⅰ對(duì)照品溶液(0.199 6 μg/ml)25 ml，再按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，制得供回收率用供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為99.18%， RSD為1.47%，符合規(guī)定。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 馬兜鈴酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.10 藥材及樣品測(cè)定 取細(xì)辛藥材中粉0.5 g，精密稱定，以下同“2.2.2”項(xiàng)下供試品制備方法操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果藥材中未檢出馬兜鈴酸Ⅰ。另取該品5個(gè)批號(hào)的樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定樣品中馬兜鈴酸Ⅰ含量，結(jié)果5批樣品中均未檢出馬兜鈴酸Ⅰ，見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 實(shí)驗(yàn)中使用二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定馬兜鈴酸Ⅰ的紫外光譜圖，結(jié)果馬兜鈴酸I 在250、321和394 nm 處有吸收，其中250 nm 為最大吸收波長(zhǎng)，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm[6]。

3.2 流動(dòng)相的選擇 參照有關(guān)文獻(xiàn)，分別試驗(yàn)了甲醇-1%冰醋酸(65∶35)、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鈉(含磷酸1 ml/L)(37∶63)、乙腈-0.05%磷酸梯度洗脫以及乙腈-1%冰醋酸不同比例，對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了考查，結(jié)果確定乙腈-1%冰醋酸(38∶62)作為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

3.3 提取方法的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7-9]，將樣品采取甲醇加熱回流提取，提取液蒸干，堿化，氯仿去除雜質(zhì)后，將提取液酸化，用氯仿提取，所制得的供試品溶液仍雜質(zhì)較多，未能將樣品雜質(zhì)峰與馬兜鈴酸色譜峰有效分離。并且馬兜鈴酸在樣品處方中最大理論限量值甚微(約1.5 μg/g)，采取強(qiáng)酸強(qiáng)堿處理后，處方中與馬兜鈴酸結(jié)構(gòu)類似的組分也許會(huì)相互轉(zhuǎn)化，測(cè)定結(jié)果不能反映馬兜鈴酸在樣品中的真實(shí)存在狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[10,11]，將樣品的甲醇提取溶液，通過(guò)預(yù)洗并活化的strata-AW33u(Phenomenex，60 mg/3 ml)固相萃取柱，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行有效富集，然后用水、甲醇去除堿性雜質(zhì)，再用甲酸甲醇溶液(25→100)洗脫目標(biāo)物，從而達(dá)到富集凈化的效果。

3.4 上樣量及洗脫溶劑的選擇 試驗(yàn)中對(duì)固相萃取柱的承載量、洗脫劑的酸度、洗脫劑的用量均進(jìn)行了詳細(xì)考查，最終選定文中規(guī)定的上樣量及洗脫劑。

3.5 粗放度考查 分別使用Agilent 1100高效液相色譜儀(DAD)、島津LC-20AD高效液相色譜儀(DAD)；Phenomenex-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱、Agilent-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色譜柱，結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)建立的方法，采取不同色譜柱及儀器均能將樣品中馬兜鈴酸Ⅰ與雜質(zhì)有效分離。

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Huang Kejing,Zhu Xiaojing

(Tianjin Institute for Drug Control,Tianjin 300070)

Objective： To establish a method for determination the content limit of aristolochic acidⅠin Liujingtoutong tablet．Methods: Aristolochic acidⅠwas extracted from samples and purified by SPE.The contents of aristolochic acidⅠwas determined by an HPLC method with a phenomenex ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) column as stationary phase and a solution of acetonitrile-1% glacial acetic acid (38∶62)as mobile phase．The flow rate of the solution was 1.0 ml/min and the detection wavelength was set up at 250 nm. Results: There existed a good linear relationship between the peak area and the aristolochic acidⅠlevel when the levels of aristolochic acidⅠfall within the range of 0.199 6～0.997 9 μg/ml (The coefficient was 0.999 7).The detection limit and quantitation limit of aristolochic acidⅠin Liujingtoutong tablet were 0.997 9 ng and 1.996 ng, respectively. The average recovery(n=6) was 99.18%. Conclusion: The developed method is simple, accurate, reproducible, and can be used for the inspection of Liujingtoutong tablet．

Liujingtoutong tablet，aristolochic acid Ⅰ，SPE-HPLC，toxic ingredients limit test

2015-05-05

R927.2

A

1006-5687(2015)05-0009-03